وأود أن أشكر Sreemanti باسو لتقديم البيانات عن الشكل 1. وأيد هذا العمل في جزء من المعاهد الوطنية للصحة منح AI069358 ومؤسسة البحوث BloodCenter.

ألف أرنب المتممة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي أن تكمل الأسهم إذابة أرنب في درجة حرارة الغرفة ، وبعد ذلك في aliquoted 0.5 و / أو وحدات التخزين 1 مل -20-80 والمجمدة في درجة مئوية لمدة طويلة الأجل للتخزين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي لكل معاير الكثير من تكملة لتحديد تركيز العمل الأمثل. عادة ، والتخفيف من 1:10 حتي 1:20 هو الأمثل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لا يكمل الأرنب presterilized دائما قبل بيعها ، اعتمادا على الاستخدام النهائي للخلايا ، ينبغي تصفية تعقيم عندما تكمل aliquoted والمجمدة أو قبل بالإضافة إلى الخلايا. </li></ol> باء جسم التحديد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ليس كل الأجسام المضادة فعالة في تنشيط تكمل ، وبالتالي يجب أولا أن يتم اختبار الأجسام المضادة للنشاط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كل من الفأر والجرذ خريطة موقع فعالة في تنشيط المتممة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أضداد الغلوبولين المناعي عادة ما تكون الأكثر كفاءة لاستخدامها في استكمال تحلل الخلايا التي يسببها تلاه مفتش الحكومة. وisotypes مفتش أفضل لتفعيل تكمل تختلف بين الأنواع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي لكل معاير الضد للاستخدام الأمثل في مناطق ذات كثافة خلية من خلايا 7 10 / مل. </li></ol> جيم البروتوكول الأساسي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط خلية السكان بدأوا 5 × 10 7 خلايا / مل في المتوسط ​​تحتوي على السفح الحرارة المعطل. والحجم النهائي للخلايا يكون ضعف حجم انطلاق. تذكر لانقاذ بعض الخلايا بحيث يمكن قياسها كميا للنضوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي أن يضاف إلى كل الأضداد تعليق خلية في تركيز مناسب محدد سلفا أو التخفيف. مزيج جيد من قبل خلايا قلب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب كمية تكمل الحاجة. تحسن الأسهم تكمل في درجة حرارة الغرفة. إذا لم يتم استكمال عقيمة ، تعقيم باستخدام بروتين منخفض طرف الحقنة ملزمة التصفية. إلى المحقنة ، إضافة مل العديد من المتوسط ​​قبل إضافة تكملة وتصفية مباشرة في أنبوب يحتوي على الخلايا والأجسام المضادة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط حجم النهائي في الأنبوب بحيث الخلايا هي الخلايا في 1 × 7 10 / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا على 37 درجة مئوية لمدة ساعة ، وخلط كل 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي الخلايا وتجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل مع المتوسط ​​مرتين. سوف حطام خلية العصا إلى جانب أنابيب البوليسترين. ويمكن التخلص من الخلايا الميتة والحطام باستخدام مصفاة الخلية أو عن طريق الطرد المركزي المتدرج الكثافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التحقق من نقاء الخلية بمقارنة السكان خلية من الفائدة قبل وبعد نضوب. التدفق الخلوي والمناعية هما طرق جيدة لتحديد نقاء الخلية. </li></ol> ممثل النتائج عند استخدام خريطة موقع الذي يتم كفاءة عالية في تفعيل استنفاد تكملة الخلية ، وبعد جولة واحدة أكبر ثم 95 ٪. هذا هو مبين في الشكل 1 حيث بدأنا مع splenocytes الماوس تتألف من 32.2 ٪ في الخلايا التائية αβ الكشف عنها بواسطة التعبير عن TCRβ (eBioscience ، سان دييغو ، كاليفورنيا) التي التدفق الخلوي. نحن المنضب الخلايا التائية باستخدام خريطة موقع لThy1 محددة ، وهو بروتين التي أعربت عنها جميع الخلايا التائية ، ولكن ليس غيرها من الكريات البيض. كان الضد كنا Y - 19 فأرا IgG2c 2. ووصف الإجراء التالي ، تم تخفيض عدد السكان TCRβ إلى 1.56 ٪ ، مما يمثل انخفاضا أكبر من 95 ٪. <img src="/files/ftp_upload/1487/1487fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. نضوب thy1 + تم الحصول عليها من قبل الخلايا التائية الطحال تنشيط المتممة. splenocytes بواسطة الماوس إجمالي تجانس الطحال وتحلل من RBC. أضيفت مكافحة thy1 والطفل تكمل الأرنب بتركيزات محددة سلفا على تعليق خلية واحدة من هذه splenocytes أن تركيز الخلية النهائية 1 × 10 7 خلايا / مل. بعد حضانة لمدة 1 ساعة إلى 37 درجة مئوية ، وكانت تغسل الخلايا مرتين وتقييمها من قبل الاستبعاد التريبان الأزرق للبقاء الخلية. تم تقييم كفاءة من قبل استنفاد التدفق الخلوي مقارنة النسبة المئوية للخلايا + TCRβ قبل استنفاد (اللوحة اليسرى) وبعد استنفاد (اللوحة اليمنى). شريط أفقي يشير إلى تلطيخ إيجابية وعدد من فوق العارضة في المئة ايجابية.

<ol>
	<li>Janeway, C., Travers, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Immune+System+in+Health+and+Disease.">The Immune System in Health and Disease.</a> Immunobiology. , (1994).</li><li>Jones, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+activities+of+antibodies+against+brain-associated+T+cell+antigens+II.+Stimulation+of+T+cell-induced+B+cell+proliferation.">Functional activities of antibodies against brain-associated T cell antigens II. Stimulation of T cell-induced B cell proliferation.</a> Eur J Immunol. 12, 30-37 (1982).</li></ol>

عملية تنقية للسكان الخلية هو إجراء المشتركة اللازمة لدراسة وظائفها. نحن هنا وصف طريقة سريعة وفعالة للأوزون السكان الخلية باستخدام مستضد محددة الأضداد ونقص المتممة. لا يمكن أن يتحقق استنفاد أية مجموعة من السكان الخلية إذا كان الضد - تكمل تفعيل متاح للعلامة محددة النسب. وأعرب بروتين هنا أثبتنا استنفاد الخلايا التائية باستخدام خريطة موقع لThy1 محددة ، وذلك أساسا جميع السكان الخلايا التائية. المنضب لدينا أكثر من 95 ٪ من الخلايا التائية αβ وزيدت splenocytes المتبقية من 68 ٪ إلى 98 ٪. هذا المستوى من النقاء الخلية استراتيجيات مماثلة لتنقية الأخرى بما في ذلك نظام مراقبة الأصول الميدانية والانفصال حبة المغناطيسي. نضوب تكمل هي تقنية السريعة التي يمكن أن يؤديها في 1.5 ساعة مرة واحدة يتم الحصول على السكان خلية البداية. ميزة أخرى لاستنفاد تكملة هو أن أي مختبر يمكن أن تؤدي هذه التقنية لأنها لا تتطلب معدات باهظة الثمن والكواشف. القطع الكبير الوحيد المعدات المطلوبة هي حمام الماء وأجهزة الطرد المركزي ملف. يمكن شراؤها يكمل الأرنب من مجموعة متنوعة من الباعة بتكلفة معقولة (انظر الجدول الكواشف) ويمكن شراؤها من العديد من خريطة موقع ATTC والمنتجة محليا للسيطرة على التكاليف. في المقابل ، FACS يتطلب تدفق عداد الكريات مع قدرة على فرز الخلية التي ستكلف في الأرقام الستة ومكلفة خريطة موقع الموسومة fluorescently. الفصل المغناطيسي هو حبة بأسعار معتدلة ، ولكن يتطلب شراء المغناطيس والخرز المغناطيسي ، والتي يمكن أن تكون مكلفة. بالإضافة إلى ذلك ، بعض استراتيجيات الفصل المغناطيسي حبة يتطلب أيضا شراء من الأعمدة. وحجر العثرة الاساسي هو لاستخدام تكملة لنضوب الخلية هو توافر تكمل تفعيل خريطة موقع مع خصوصية المستضد اللازمة. على الرغم من أن الإنسان ، والفأر والجرذان الأضداد جميعا القدرة على استكمال الإصلاح ، وبعض isotypes هي أفضل من غيرها. على الرغم من الغلوبولين المناعي من جميع الأنواع الثلاثة هي فعالة للغاية في تحديد تكمل isotypes مفتش تختلف. يجب أولا ومن ثم يتم اختبار كل خريطة موقع في دراسة تجريبية لتحديد مدى فعاليته. عن الأجسام المضادة التي ليست ذات كفاءة عالية ، يمكن إجراء جولتين من استنفاد تكملة دون التأثير على سلامة السكان الخلايا المتبقية. كما وفورات في التكاليف ، ينبغي معاير الأجسام المضادة للفعالية المثلى. بالإضافة إلى ذلك ، أن الأجسام المضادة المستخدمة لا تحتاج إلى تنقية. supernatants ورم هجين واستسقاء السوائل فقط العمل بشكل فعال ، وهو أمر مريح خصوصا للأضداد الغلوبولين المناعي ، والتي هي صعبة لتنقية. كما هو الحال مع الأضداد ، فمن المحتم أن يكون مكملا معاير في الدراسة التجريبية. وهناك تركيز عال جدا يؤدي الى فقدان قابلية للسكان الخلية غير المستهدفة. المهم أيضا هو أن فترة حضانة لا تتجاوز 60 دقيقة. في بروتوكول لدينا ، فقد شاركنا في احتضان هذه الأضداد وتكمل معا. ومع ذلك ، يمكن أن توصف الخلايا مع الأجسام المضادة لل15-30 دقيقة ويغسل قبل إضافة متممة. عند استخدام هذه الاستراتيجية ، للتأكد من تنفيذ حضانات الأضداد على الجليد لمنع فقدان الخلية المستضد على سطح الخلية ، كما يحدث مع بعض البروتينات التي ترميم وتغطية أو استيعاب مستقبلة. على الرغم من كفاءة عالية ، والعيب الرئيسي لاستكمال استنزاف بالمقارنة مع الأساليب الأخرى هو أنه لا يمكن استخدامها لاختيار ايجابية. وبالتالي فمن الصعب الحصول على مجموعات سكانية فرعية من الخلايا. على سبيل المثال ، سيكون من الصعب تطهير المنطقة الهامشية خلايا من خلايا B B الجريبي ، والتي من الأفضل أن يقوم به نظام مراقبة الأصول الميدانية. في هذه الحالة ، يمكن أن تستخدم لتنشيط تكملة تستنفد خلايا تي للحد من عدد الخلايا التي تم فرزها. وهذه الاستراتيجية تقليل الوقت الفرز ، التي من شأنها توفير المال وستكون أقل قسوة على الخلايا. منذ تنقية خلية معينة من السكان هو مطلب مشترك وضعت عددا من الاستراتيجيات. المزايا الرئيسية للاستراتيجية مكملة لها القدرة على تحمل التكاليف ونضوب ، بساطة التقنية وتوفير الوقت.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>3-4 week baby rabbit complement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pel-Freez Biologicals</td>
<td>31061-3</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Water bath</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>various</td>
<td>various </td>
<td>An incubator set at 37 &deg;C can also be used.</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

depletion of specific cell populations by complement depletion

مطلوب في كثير من الأحيان لتنقية الخلايا المناعية للسكان من أجل دراسة وظائفها الفريدة. في النهج ، ولا سيما الجزيئية مثل PCR الوقت الحقيقي وتحليل [ميكروأري تتطلب عزل السكان الخلية مع نقاء عالية. استراتيجيات تشمل تنقية استخداما الفلورسنت الفرز تنشيط الخلية (FACS) ، والفصل المغناطيسي حبة ونقص المتممة. من الاستراتيجيات الثلاث ، واستنفاد تكملة يوفر مزايا يجري بسرعة ، وغير مكلفة ، لطيف على الخلايا والخلايا عالية الغلة. ويتألف النظام من استكمال عدد كبير من بروتينات البلازما أنه عندما يشرع في تنشيط بروتين تتالي بلغت ذروتها في تشكيل مجمع غشاء الهجوم الذي يشكل المسام على سطح الخلية مما يؤدي إلى موت الخلايا<sup&gt; 1</sup&gt;. يتم تنشيط المسار الكلاسيكي بواسطة أضداد IgM و IgG و كان أول وصف كآلية لقتل البكتيريا. مع جيل من الاجسام المضادة (ماب) ، يمكن استخدام سلسلة مكملة لأية مجموعة من السكان ليز الخلية بطريقة مستضد محدد. ويتحقق استنفاد الخلايا التي تكمل سلسلة بإضافة أضداد تحديد تكمل محددة مستضد ويكمل الأرنب للسكان خلية البداية. يتم تحضين هذه الخلايا لمدة ساعة في وقت لاحق تتم إزالة 37 درجة مئوية ، والخلايا التي lysed جولتين من الغسيل. ماب مع الكفاءة العالية لاستكمال تثبيت تستنزف عادة 95-100 ٪ من السكان الخلية المستهدفة. اعتمادا على استراتيجية تنقية للسكان الخلية المستهدفة ، ويمكن استخدام استنفاد تكملة لتنقية الخلية أو لإثراء سكان الخلية التي يمكن تنقيته ثم مزيدا من طريقة لاحقة.

Watch this Scientific Journal Video about Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion at JoVE.com

Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

لدراسة فعالية وظيفة الخلايا المناعية للسكان هو مطلوب في كثير من الأحيان لتنقية بهم. نضوب تكمل هي تقنية سريعة وغير مكلفة لعزل السكان الخلايا المناعية مع درجة نقاوة عالية.

نضوب بالسكان خلية معينة من قبل استنفاد تكملة

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

depletion-of-specific-cell-populations-by-complement-depletion

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

22.1K Views.  Blood Research Institute. لدراسة فعالية وظيفة الخلايا المناعية للسكان هو مطلوب في كثير من الأحيان لتنقية بهم. نضوب تكمل هي تقنية سريعة وغير مكلفة لعزل السكان الخلايا المناعية مع درجة نقاوة عالية.

Video: Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known phenotype.  Other bulk methods of purification include panning, complement depletion and magnetic bead separation.  However, FACS has several advantages over other available methods.  FACS is the preferred method when very high purity of the desired population is required, when the target cell population expresses a very low level of the identifying marker or when cell populations require separation based on differential marker density.  In addition, FACS is the only available purification technique to isolate cells based on internal staining or intracellular protein expression, such as a genetically modified fluorescent protein marker.  FACS allows the purification of individual cells based on size, granularity and fluorescence.  In order to purify cells of interest, they are first stained with fluorescently-tagged monoclonal antibodies (mAb), which recognize specific surface markers on the desired cell population (1).  Negative selection of unstained cells is also possible.  FACS purification requires a flow cytometer with sorting capacity and the appropriate software.  For FACS, cells in suspension are passed as a stream in droplets with each containing a single cell in front of a laser.  The fluorescence detection system detects cells of interest based on predetermined fluorescent parameters of the cells.  The instrument applies a charge to the droplet containing a cell of interest and an electrostatic deflection system facilitates collection of the charged droplets into appropriate collection tubes (2).  The success of staining and thereby sorting depends largely on the selection of the identifying markers and the choice of mAb.  Sorting parameters can be adjusted depending on the requirement of purity and yield.  Although FACS requires specialized equipment and personnel training, it is the method of choice for isolation of highly purified cell populations.

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

For many scientific studies requiring a biological and chemical analysis of cell populations the cells must be in a high state of purity. Fluorescence activated cell sorting (FACS) is a superior method in which to obtain pure cell populations.

تنقية سكان خلية معينة من قبل الإسفار الفرز الخلية المنشط (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

Measuring the 50% Haemolytic Complement (CH50) Activity of Serum

The complement system is a group of proteins that when activated lead to target cell lysis and facilitates phagocytosis through opsonisation. Individual complement components can be quantified however this does not provide any information as to the activity of the pathway. The CH50 is a screening assay for the activation of the classical complement pathway (Fig 1) and it is sensitive to the reduction, absence and/or inactivity of any component of the pathway. The CH50 tests the functional capability of serum complement components of the classical pathway to lyse sheep red blood cells (SRBC) pre-coated with rabbit anti-sheep red blood cell antibody (haemolysin). When antibody-coated SRBC are incubated with test serum, the classical pathway of complement is activated and haemolysis results. If a complement component is absent, the CH50 level will be zero; if one or more components of the classical pathway are decreased, the CH50 will be decreased. A fixed volume of optimally sensitised SRBC is added to each serum dilution. After incubation, the mixture is centrifuged and the degree of haemolysis is quantified by measuring the absorbance of the haemoglobin released into the supernatant at 540nm. The amount of complement activity is determined by examining the capacity of various dilutions of test serum to lyse antibody coated SRBC. This video outlines the experimental steps involved in analysing the level of complement activity of the classical complement pathway.

Measuring the 50% Haemolytic Complement CH50 Activity of Serum

The classical pathway is activated by antibody and culminates in target cell lysis. The CH50 assay provides a measure of the complement activity of a serum sample. This video demonstrates the steps involved in determining the CH50 of a serum sample, the calculations and interpreting of results.

قياس يكمل 50 ٪ الدم الانحلالي (CH 50) نشاط المصل

The complement system is a group of proteins that when activated lead to target cell lysis and facilitates phagocytosis through opsonisation. Individual ...

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the generation of extreme population diversity that facilitates virus adaptation and evolution. Increasing evidence shows that the intrinsic error rates, and the resulting mutation frequencies, of RNA viruses can be modulated by subtle amino acid changes to the viral polymerase. Although biochemical assays exist for some viral RNA polymerases that permit quantitative measure of incorporation fidelity, here we describe a simple method of measuring mutation frequencies of RNA viruses that has proven to be as accurate as biochemical approaches in identifying fidelity altering mutations. The approach uses conventional virological and sequencing techniques that can be performed in most biology laboratories. Based on our experience with a number of different viruses, we have identified the key steps that must be optimized to increase the likelihood of isolating fidelity variants and generating data of statistical significance. The isolation and characterization of fidelity altering mutations can provide new insights into polymerase structure and function1-3. Furthermore, these fidelity variants can be useful tools in characterizing mechanisms of virus adaptation and evolution4-7.

The present article describes the steps required to isolate and characterize RNA polymerase fidelity variants of RNA viruses and how to use mutation frequency data to confirm fidelity changes in tissue culture.

بمعزل عن المتغيرات الاخلاص للفيروسات الحمض النووي الريبي وتوصيف التردد يتحور الفيروس

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Depletion and Reconstitution of Macrophages in Mice

Macrophages are critical players in the innate immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune response and directing the acquired immune response. Macrophage dysfunction can lead to an inability to mount an appropriate immune response and as such, has been implicated in many disease processes, including inflammatory bowel diseases. Macrophages display polarized phenotypes that are broadly divided into two categories. Classically activated macrophages, activated by stimulation with IFN&gamma; or LPS, play an essential role in response to bacterial challenge whereas alternatively activated macrophages, activated by IL-4 or IL-13, participate in debris scavenging and tissue remodeling and have been implicated in the resolution phase of inflammation. During an inflammatory response in vivo, macrophages are found amid a complex mixture of infiltrating immune cells and may participate by exacerbating or resolving inflammation. To define the role of macrophages in situ in a whole animal model, it is necessary to examine the effect of depleting macrophages from the complex environment. To ask questions about the role of macrophage phenotype in situ, phenotypically defined polarized macrophages can be derived ex vivo, from bone marrow aspirates and added back to mice, with or without prior depletion of macrophages. In the protocol presented here clodronate-containing liposomes, versus PBS injected controls, were used to deplete colonic macrophages during dextran sodium sulfate (DSS)-induced colitis in mice. In addition, polarized macrophages were derived ex vivo and transferred to mice by intravenous injection. A caveat to this approach is that clodronate-containing liposomes deplete all professional phagocytes, including both dendritic cells and macrophages so to ensure the effect observed by depletion is macrophage-specific, reconstitution of phenotype by adoptive transfer of macrophages is necessary. Systemic macrophage depletion in mice can also be achieved by backcrossing mice onto a CD11b-DTR background, which is an excellent complementary approach. The advantage of clodronate-containing liposome-mediated depletion is that it does not require the time and expense involved in backcrossing mice and it can be used in mice regardless of the background of the mice (C57BL/6, BALB/c, or mixed background).

Macrophages play a central role in homeostasis and pathology in many tissues. The protocol presented here describes methods for depleting macrophages in vivo, deriving polarized macrophages from bone marrow aspirates, and adoptively transferring macrophages into mice. These techniques allow determination of the role that polarized macrophages play in health and disease.

نضوب وإعادة إعماره الضامة في الفئران

Macrophages are critical players in the innate  immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune  response and directing ...

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion (STED) Nanoscopy

Natural killer cells form tightly regulated, finely tuned immunological synapses (IS) in order to lyse virally infected or tumorigenic cells. Dynamic actin reorganization is critical to the function of NK cells and the formation of the IS. Imaging of F-actin at the synapse has traditionally utilized confocal microscopy, however the diffraction limit of light restricts resolution of fluorescence microscopy, including confocal, to approximately 200 nm. Recent advances in imaging technology have enabled the development of subdiffraction limited super-resolution imaging. In order to visualize F-actin architecture at the IS we recapitulate the NK cell cytotoxic synapse by adhering NK cells to activating receptor on glass. We then image proteins of interest using two-color stimulated emission depletion microscopy (STED). This results in &#60;80 nm resolution at the synapse. Herein we describe the steps of sample preparation and the acquisition of images using dual color STED nanoscopy to visualize F-actin at the NK IS. We also illustrate optimization of sample acquisition using Leica SP8 software and time-gated STED. Finally, we utilize Huygens software for post-processing deconvolution of images.

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion STED Nanoscopy

Here we illustrate the protocol for imaging by two-color STED nanoscopy the cytotoxic immune synapse of NK cells recapitulated on glass. Using this method we obtain sub-100 nm resolution of synapse proteins and the cytoskeleton.

تصور من قبل المناعية المشبك المزدوج اللون التوقيت بوابات-الانبعاث المستحث استنفاد (STED) Nanoscopy

Natural killer cells form tightly regulated, finely tuned immunological synapses (IS) in order to lyse virally infected or tumorigenic cells. Dynamic ...

Methods for Quantitative Detection of Antibody-induced Complement Activation on Red Blood Cells

Antibodies against red blood cells (RBCs) can lead to complement activation resulting in an accelerated clearance via complement receptors in the liver (extravascular hemolysis) or leading to intravascular lysis of RBCs. Alloantibodies (e.g. ABO) or autoantibodies to RBC antigens (as seen in autoimmune hemolytic anemia, AIHA) leading to complement activation are potentially harmful and can be - especially when leading to intravascular lysis - fatal1. Currently, complement activation due to (auto)-antibodies on RBCs is assessed in vitro by using the Coombs test reflecting complement deposition on RBC or by a nonquantitative hemolytic assay reflecting RBC lysis1-4. However, to assess the efficacy of complement inhibitors, it is mandatory to have quantitative techniques. Here we describe two such techniques. First, an assay to detect C3 and C4 deposition on red blood cells that is induced by antibodies in patient serum is presented. For this, FACS analysis is used with fluorescently labeled anti-C3 or anti-C4 antibodies. Next, a quantitative hemolytic assay is described. In this assay, complement-mediated hemolysis induced by patient serum is measured making use of spectrophotometric&#160;detection of the released hemoglobin. Both of these assays are very reproducible and quantitative, facilitating studies of antibody-induced complement activation.

Here we describe two assays for measuring complement activation induced by antibodies against red blood cells. The major advantage over the current assays is their quantitative and easy-to-interpret nature.

طرق للكشف الكمي للجسم التي يسببها تكملة التنشيط على خلايا الدم الحمراء.

Antibodies against red blood cells (RBCs) can lead to complement activation resulting in an accelerated clearance via complement receptors in the liver ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied by adverse side effects such as a reduced ability to control infections or malignancies. Therefore, new approaches need to be developed that target only the disease mediating cells and leave the remaining immune system intact. Over the past decade a variety of cell based immunotherapy strategies to modulate T cell mediated immune responses have been developed. Most of these approaches rely on tolerance-inducing antigen presenting cells (APC). However, in addition to being technically difficult and cumbersome, such cell-based approaches are highly sensitive to cytotoxic T cell responses, which limits their therapeutic capacity. Here we present a protocol for the generation of non-cellular killer artificial antigen presenting cells (KaAPC), which allows for the depletion of pathologic T cells while leaving the remaining immune system untouched and functional. KaAPC is an alternative solution to cellular immunotherapy which has potential for treating autoimmune diseases and allograft rejections by regulating undesirable T cell responses in an antigen specific fashion.

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Guidelines are presented for the generation of killer artificial antigen presenting cells, KaAPC, an efficient tool for in vitro depletion of human antigen-specific T cells and an alternative solution to cellular immunotherapy for the treatment of T cell-mediated autoimmune diseases in an antigen-specific fashion without compromising the remaining immune system.

القاتل مستضد تقديم الخلايا الاصطناعي (KaAPC) للكفاءة<em&gt; في المختبر</em&gt; استنفاد خلايا T الإنسان مستضد محددة

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are able to replicate in the deep lung. Phagocytosis of Cryptococcus by macrophages is one of the ways that the disease is able to spread into the central nervous system to cause lethal meningoencephalitis. Therefore, study of the association between Cryptococcus and macrophages is important to understanding the progression of the infection. The present study describes a step-by-step protocol to study macrophage infectivity by C. neoformansin vitro. Using this protocol, the role of host sterols on host-pathogen interactions is studied. Different concentrations of methyl--cyclodextrin (MCD) were used to deplete cholesterol from murine reticulum sarcoma macrophage-like cell line J774A.1. Cholesterol depletion was confirmed and quantified using both a commercially available cholesterol quantification kit and thin layer chromatography. Cholesterol depleted cells were activated using Lipopolysacharide (LPS) and Interferon gamma (IFN&#947;) and infected with antibody-opsonized Cryptococcus neoformans wild-type H99 cells at an effector-to-target ratio of 1:1. Infected cells were monitored after 2 hr of incubation with C. neoformans and their phagocytic index was calculated. Cholesterol depletion resulted in a significant reduction in the phagocytic index. The presented protocols offer a convenient method to mimic the initiation of the infection process in a laboratory environment and study the role of host lipid composition on infectivity.

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

بلعم الكولسترول استنفاد وتأثيره على البلعمة من<em&gt; المستخفية المورمة</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, cloning TCRs specific for various tumor-associated antigens has been the goal of many studies. To elicit an effective T cell response, the TCR must recognize the target antigen with optimal affinity. However, cloning such TCRs has been a challenge and many available TCRs possess sub-optimal affinity for the cognate antigen. In this protocol, we describe a method of cloning de novo high affinity antigen-specific TCRs using existing TCRs by exploiting hemichain centricity. It is known that for some TCRs, each TCR&#945; or TCR&#946; hemichain do not contribute equally to antigen recognition, and the dominant hemichain is referred to as the centric hemichain. We have shown that by pairing the centric hemichain with counter-chains differing from the original counter-chain, we are able to maintain the antigen specificity, while modulating its interaction strength for the cognate antigen. Thus, the therapeutic potential of a given TCR can be improved by optimizing the pairing between the centric and counter hemichains.

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Herein we describe a novel method to generate antigen-specific T cell receptors (TCRs) by pairing the TCR&#945; or TCR&#946; of an existing TCR, possessing the antigen-specificity of interest, with complementary hemichain of the peripheral T cell receptor repertoire. The de novo generated TCRs retain antigen-specificity with varying affinity.

توليد<em&gt; دي نوفو</em&gt; محددة مستضد تي الإنسان مستقبلات الخلية من قبل فيروسات تنبيغ من مركزية Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion (STED) Microscopy

B cells that bind to membrane-bound antigens (e.g., on the surface of an antigen-presenting cell) form an immune synapse, a specialized cellular structure that optimizes B-cell receptor (BCR) signaling and BCR-mediated antigen acquisition. Both the remodeling of the actin cytoskeleton and the reorientation of the microtubule network towards the antigen contact site are essential for immune synapse formation. Remodeling of the actin cytoskeleton into a dense peripheral ring of F-actin is accompanied by polarization of the microtubule-organizing center towards the immune synapse. Microtubule plus-end binding proteins, as well as cortical plus-end capture proteins mediate physical interactions between the actin and microtubule cytoskeletons, which allow them to be reorganized in a coordinated manner. Elucidating the mechanisms that control this cytoskeletal reorganization, as well as understanding how these cytoskeletal structures shape immune synapse formation and BCR signaling, can provide new insights into B cell activation. This has been aided by the development of super-resolution microscopy approaches that reveal new details of cytoskeletal network organization. We describe here a method for using stimulated emission depletion (STED) microscopy to simultaneously image actin structures, microtubules, and transfected GFP-tagged microtubule plus-end binding proteins in B cells. To model the early events in immune synapse formation, we allow B cells to spread on coverslips coated with anti-immunoglobulin (anti-Ig) antibodies, which initiate BCR signaling and cytoskeleton remodeling. We provide step-by-step protocols for expressing GFP fusion proteins in A20 B-lymphoma cells, for anti-Ig-induced cell spreading, and for subsequent cell fixation, Immunostaining, image acquisition, and image deconvolution steps. The high-resolution images obtained using these procedures allow one to simultaneously visualize actin structures, microtubules, and the microtubule plus-end binding proteins that may link these two cytoskeletal networks.

Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion STED Microscopy

We present a protocol for using STED microscopy to simultaneously image actin structures, microtubules, and microtubule plus-end binding proteins in B cells that have spread on coverslips coated with antibodies to the B-cell receptor, a model for the initial phase of immune synapse formation.

تصور أكتين وسيتوسكيليتونس ميكروتوبولي في المشبك محصنة خلية ب استخدام الفحص المجهري استنفاد (STED) حفز الانبعاثات

B cells that bind to membrane-bound antigens (e.g., on the surface of an antigen-presenting cell) form an immune synapse, a specialized cellular structure ...