يوضح هذا البروتوكول بالتفصيل طريقة الفحص المجهري لتوسيع البنية الفوقية في ثلاث مراحل دورة حياة في المختبر من المثقبية الكروزية ، العامل الممرض المسؤول عن مرض شاغاس. يوفر هذا البروتوكول بديلا لتقنيات التصوير فائقة الدقة والفحص المجهري الإلكتروني الحالية ، مع ميزة كونه متوافقا مع المجاهر التقليدية الموجودة في معظم مختبرات الأحياء وفي مرافق الماكينة الأساسية. يستخدم تقنيات شائعة لمعظم مختبرات الأبحاث للحصول على الصور التي تتيح إعادة البناء ثلاثي الأبعاد.
يسهل البروتوكول دراسة الهياكل النانوية في المثقبيات ، مما يسمح بفحص مجموعة من الخلايا وتصوير الحجم الكامل للخلية ذات الأهمية بدقة عالية. إنه مفيد بشكل خاص لأنواع الخلايا الخاصة بالعلم في المراحل العابرة من دورة الخلية والتمايز. للحصول على مزيد من الدقة ، سنستخدم مجموعة ExM مع التقنيات المجهرية فائقة الدقة من أجل الوصول إلى دقة أقل من 20 نانومتر.
ابدأ بتحضير معلق المثقبية الكروزي epimastigote من ثقافة طور السجل في وسط LIT مكمل بنسبة 10٪ FCS. الطرد المركزي التعليق عند 5 ، 000 جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. اغسل الحبيبات مرتين باستخدام PBS ، ثم أعد تعليقها في 200 ميكرولتر من PBS.
قم بلصق التعليق بزلة غطاء مستديرة مقاس 12 ملم مطلية ب Poly-D-Lysine واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 إلى 20 دقيقة قبل منع الربط المتقاطع. اجمع المادة الطافية لطبقة أحادية لخلية Vero المصابة بالمثقبيات بعد أربعة أيام من الإصابة. باستخدام غرفة عد خلايا Neubauer ، حدد تركيز المثقبيات.
الطرد المركزي معلق الخلية عند 7 ، 000 جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد شطف الخلايا وإعادة تعليقها في PBS ، انقل تعليق الخلية إلى زلة غطاء مطلية بالليسين واحتضان زلة الغطاء في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 إلى 15 دقيقة قبل منع الارتباط المتقاطع. للحصول على amastigotes من خلايا Vero المصابة ، ضع زلة غطاء دائرية معقمة مقاس 12 ملم في الجزء السفلي من لوحة زراعة أنسجة 24 جيدا.
بعد ذلك ، قم بإعداد تعليق خلايا Vero في DMEM مكملا بنسبة 2٪ FCS ، وبذر 500 ميكرولتر من المعلق في كل بئر. احتضن اللوحة طوال الليل لضمان ارتباط الخلية. ثم اغسل الخلايا مرتين باستخدام 500 ميكرولتر من PBS المعقم.
أضف T.cruzi المثقبية إلى الخلايا واحتضانها في وقت سابق لمدة ست ساعات. ابدأ بإضافة 0.5 مل من محلول منع الربط المتقاطع إلى كل بئر من صفيحة 24 بئرا. بعد ذلك ، اغمر زلات الغطاء المطلي ب Poly-D-Lysine مقاس 12 ملم مع الطفيليات الملتصقة.
بعد ملء الآبار الفارغة بالماء لتقليل التبخر ، أغلق اللوحة بغشاء مانع للتسرب واحتضنها. لتبلور العينات ، قم أولا بتجميع غرفة رطبة في طبق بتري عن طريق وضع طبقة مانعة للتسرب فوق المناديل الورقية. ثم بلل المناديل الورقية بالماء واحتضانها عند 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة 20 دقيقة لتبريدها.
ضع الغرفة الرطبة الباردة على الجليد. بعد ذلك ، باستخدام ماصة باستور سعة ثلاثة ملليلتر ، قم بشفط محلول منع الربط المتقاطع من آبار لوحة 24 بئر. الآن ، استخدم الملقط لإزالة زلات الغطاء ووضعها على المناديل الورقية بحيث تكون الطفيليات متجهة لأعلى.
خذ 90 ميكرولترا من المحلول الأحادي في أنبوب وأضف خمسة ميكرولترات لكل من TEMED و APS المذاب. دوامة الخليط لمدة ثانيتين إلى ثلاث ثوان. ماصة 35 ميكرولترا من هذا الخليط فوق فيلم مانع للتسرب لكل زلة غطاء، واستخدم الملقط على الفور لوضع زلات الغطاء فوق القطرة بحيث تكون الطفيليات متجهة لأسفل.
احتضن الغرفة الرطبة على الجليد لمدة خمس دقائق ، ثم عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. ابدأ بسحب ملليلترين من محلول التمسخ في كل بئر من ستة آبار. انقل زلات الغطاء المغلي التي تحتوي على طفيليات المثقبية الكروزية إلى محلول التمسخ واحتضانها بتحريض لطيف.
لتشجيع انفصال الجل. باستخدام ملعقة معدنية ، انقل الجل بعناية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مليلتر يحتوي على مليلتر واحد من محلول التمسخ. احتضان الأنبوب بغطاء آمن على كتلة تسخين.
استخدم ماصة P1000 لشفط محلول التمسخ من أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة. باستخدام ملعقة معدنية ، انقل الجل إلى طبق بتري يحتوي على 10 مل من الماء عالي النقاء واتركه لمدة 30 دقيقة. باستخدام ماصة باستور يمكن التخلص منها سعة ثلاثة ملليلتر، استبدل الماء فائق النقاء في الطبق، واترك الجل مغمورا طوال الليل في درجة حرارة الغرفة.
في اليوم التالي ، قم بقياس قطر الجل باستخدام الفرجار لحساب التمدد. كانت العينات مرئية على شكل هلام مستو وشفاف يتوسع من 4 إلى 4.5 مرات في الماء. ابدأ وضع العلامات الفلورية عن طريق غسل دوائر الهلام الموسعة التي تحتوي على الطفيليات باستخدام PBS.
استخدم شفرة حلاقة لقطع الدوائر في المنتصف إلى مربعات 10 × 10 ملم. الآن ، انقل كل مربع إلى صفيحة 12 بئر واحتضانها في 500 ميكرولتر من الجسم المضاد الأساسي المخفف في 2٪ PBS و BSA ، مع الرج. بعد ذلك ، احتضن مربعات الجل في صفيحة من ستة آبار تحتوي على ملليلترين من PBS مع 0.1٪ بولي سوربات 20 لمدة 10 دقائق ، مع الرج.
بعد نقل الجل إلى صفيحة 12 بئرا ، أضف 500 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي في PBS مع DAPI و 10 ميكروغرام لكل مليلتر من إستر NHS المقترن بالفلوروفور المطلوب. احتضن الجل لمدة 2.5 ساعة عند 37 درجة مئوية تحت تحريض لطيف. بعد غسل الجل ثلاث مرات في PBS polysorbate 20 كما كان سابقا ، انقل الجل إلى طبق بتري بالماء فائق النقاء واحتضنه لمدة 30 دقيقة.
ضع مربعا مقاس 10 × 10 ملم من قطعة الجل الموسعة على طبق سفلي مقاس 35 ملم. تحقق من اتجاه الطفيليات بتكبير 10 أو 20X. صور العينات في مجهر متحد البؤر بهدف غمر الزيت 63X ، بفتحة عددية 1.4.
احصل على مكدسات Z ، وعرض كل خطوة Z ، ووقت التعرض المحدد تجريبيا لكل بكسل ، ثم احصل على شدة الإشارة وتحسين أوقات الاستحواذ باستخدام تكبير المسح الضوئي للتكبير الفعال ، إذا رغبت في ذلك. افتح Z-stack باستخدام برنامج معالجة الصور وقم بتجميع الصور المكدسة باستخدام خيار مشروع المجموعة Z لكل قناة. ثم حدد الإسقاط الأقصى للشدة.
دمج الصور باستخدام أداة دمج القنوات. حدد لون كل قناة وأضف شريط المقياس باستخدام أداة Scale Bar في برنامج المعالجة. قدم التمدد الأولي دقة فعالة تبلغ 70 نانومتر ، بينما أظهر التمدد الثانوي عوامل تمدد تبلغ حوالي 4.5.
أظهر تلطيخ جميع مراحل دورة الحياة الثلاث في المختبر من T.cruzi باستخدام علامات الهيكل الخلوي توطين مشد أنبوبي دقيق وتوطين محور عصبي سوطي للبروتين. تم تمييز تكثيف الكروماتين بوضوح عند تلطيخه ب DAPI. أظهر التوطين المناعي لعلامات ألفا توبولين المتداخلة مع وضع العلامات على البروتين في epimastigotes أن الجسم القاعدي الملطخ بمضاد ألفا توبولين و FITC قد انقسم.
ساعد وضع العلامات على البروتين في تحديد الهياكل الطفيلية المختلفة في جميع مراحل دورة الحياة.
