قد ينتج عامل التربانوسوما كروزي لمرض شاغاس التهابات أعراض طويلة الأمد قد تنفتح في علم الأمراض السريرية المعترف بها. إن العثور على أعشاش الـ Trypanosoma cruzi في الأنبوب شبه المنيروز لصبي توفي بسبب مرض شاغاس يشير إلى بروتوكول البحث لكشف إمكانية انتقال الطفيليات تشاغاس جنسيًا. تقديم الرعاية الصحية لمدة خمس سنوات وتوظيف الأسر، وتظهر المشاركين الذين يعانون من الأعراض السريرية لمرض شاغاس الحاد، ACG.
حصلت على 15 مل من الدم الوريدي من المشاركين في الأسرة في ثلاث مناسبات واحدة سنة واحدة على حدة، مقسمة إلى ثلاثة، خمسة مل aliquots وتخزينها في أربعة Centigrades. جمعت مل اثنين من السائل المنوي المصل من المتطوعين الكبار تظهر T.cruzi في الدم من الحالات ACG للتحقق من صحة التحاليل الجزيئية. عزل T.cruzi من aliquot الدم ACG يتم تخزينها في أنبوب 10 مل مع تخثر.
تلقيح خمسة مل من الدم في 50 مل أنبوب slants بالإضافة إلى خمسة مل من الكبد ضخ التربتوز المتوسطة واحتضان في شاكر في 27 درجة لمدة ثلاثة أشهر. البحث المجهري لتي كروزي في 100 ميكرولتر من عظمى على الشريحة الزجاجية. حصاد flagellates من الطرد المركزي المتوسطة في 1، 000 × G لمدة 10 دقيقة وغسلها في PBS درجة حِمّية 7.4.
تلقيح 75 مل L6 خلية العضلات قارورة كل مع 10 إلى عزل T.cruzi السادسة. تغذية الخلايا الثقافة مع 15 مل من دولبيككو الحد الأدنى من المتوسطة الأساسية، DMEM في 37 درجة مئوية. تنمو عزل الطفيليات والسيطرة الإيجابية Berenice T.cruzi.
تنمو تي كروزي النسبي Leishmania braziliensis في DMEM كتحكم سلبي. استخدام 10 × 10 إلى ثقافة الأنسجة السادسة المشتقة T.cruzi trypomastigotes لتصيب الفئران. البحث عن أعشاش T.cruzi في أقسام العضلات وأجهزة التكاثر بعد شهر واحد.
استخدام aliquots الدم في EDTA كورنينج أنبوب عقيم 10 مل وجمع الخلايا البيضاء بالانفروج المركزي كثافة تدرج في 3، 000 X G لمدة 45 دقيقة. اغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني وطاردة مركزية عند 1،500 × G لمدة 10 دقائق في أنبوب مختلف. استخراج الحمض النووي من العزل أرسلت من T.cruzi بيرينيس من L.braziliensis من 109 مواضيع الأسرة ومن الحيوانات المنوية من 21 مشاركا كما هو الحال في الخطوة 3.3 من البروتوكول.
قياس تركيزات الحمض النووي على 0.8٪ agarose هلام واستيعابها في 206 نانومتر. استخدام T.cruzi TCZ اندفاعة واحدة اثنين التمهيدية الصليد إلى 188 مسبار النيوكليوتيدات في تحليل PCR. جعل مزيج PCR مع 10 نانوغرام قالب الحمض النووي، 0.4 ميكرومولار من كل زوج من التمهيدية، واثنين من وحدات المخزون بوليميراز الحمض النووي، 0.2 الحمض النووي ميكرومولر-TPs، و5 كلوريد المغنيسيوم ميكرومولر في 25 ميكرولتر الحجم النهائي.
إجراء تضخيم الحمض النووي كما هو الحال في الخطوة 3.5.2 وإظهار نطاقات الحمض النووي في الجل. استخدام T.cruzi 188 النيوكليوتيد مسبار المناجل حتى الآن التمهيدي التسمية مع ألفا 32P dATP وفصل المنتج PCR على 1.3٪ agarose هلام ونقلها إلى غشاء النايلون مشحونة إيجابيا. غسل الغشاء وتعرض الآن لحقل الأشعة السينية لفترات متغيرة.
تنمو استنساخ مختارة من مجال الأشعة السينية وتسلسل تجاريا مع TCZ اندفاعة واحدة اثنين التمهيدي. إجراء ثلاثة فحوصات مستقلة للفلوروس و triplicate واحد إلى 100 تخفيف المصل في برنامج تلفزيوني من 109 المشاركين في الدراسة. أجهزة الطرد المركزي aliquot خمسة مل من الدم المغلقة في 1، 000 X G لمدة 30 دقيقة وتخزين المصل في ناقص 20 درجة مئوية.
تشغيل تخفيف مصل المناعة مستقلة من عينات الدراسة التي تم الحصول عليها في ثلاث مناسبات سنة واحدة بعيدا. استخدام 5 ميكرولتر من amastigotes T.cruzi المحتضنة رسميا أو L.braziliensis promastigotes، 10 الطفيليات لكل ميكرولتر في تعليق PBS على الشريحة الزجاجية والسماح لها الجافة بين عشية وضحاها، كما هو الحال في الخطوة 5.3.3. احتضان الطفيلي على الزجاج مع 100 ميكرولترات من واحد إلى 100 الأمصال وغطيها مع زلة في غرفة رطبة لمدة ساعة واحدة في 37 درجة ، ثم غسل مرتين مع برنامج تلفزيوني.
احتضان الشرائح الزجاج المجففة بالهواء مع واحد إلى 1،000 تخفيف من الأجسام المضادة الفلوريسين المسمى الأرانب إلى IgG الإنسان، وغسل والجافة كذلك. قم بتركيب الشريحة الزجاجية مع زلة غطاء وفحصها تحت مجهر ضوء الأشعة فوق البنفسجية. الكشف عن T.cruzi وL.braziliensis مستضد قابل للذوبان ميكروغرام واحد في 100 ميكرولتر من الكربونات العازلة 9.6.
احتضان مع 100 ميكرولتر من واحد إلى 100 تخفيف المصل في الآبار ثلاثية الاحتياز. غسل لوحات مرتين مع حلول برنامج تلفزيوني توين وانتظر حتى يجف. احتضان مع 100 ميكرولتر من واحد إلى 1، 000 التخفيف من phosphatase القلوية متخرة، الماعز المضادة للأرانب IgG.
غسل لوحات مرتين مع برنامج تلفزيوني-توين، إضافة الركيزة شبه nitrophenylphospate وانتظر تطور الألوان. اقرأ الكثافات البصرية عند 630 نانومتر في قارئ لوحة متعدد المستويات. Transilluminate بيض الدجاج الخصبة وجعل ثقب في قذيفة في فقاعة بهم.
تلقيح 100 trypomastigotes على كل وسيلة ثقافة قذيفة في البيض عنصر تحكم وهمية. ختم ثقب مع شريط لاصق. احتضان البيض في 37 درجة مئوية، 65٪ الرطوبة لمدة 21 يوما.
تنمو الفراخ فقست من السيطرة الحية البيض المجموعة A من الضوابط وهمية، المجموعة B ومن البيض T.cruzi تلقيح، المجموعة C حتى حياتهم الكبار. تحدي الدجاج من المجموعة B و C مرتين مع 10 × 10 إلى السابعة المحتضنة رسميا trypomastigote الأسبوعية. الحصول على مل اثنين من الدم الوريدي من الوريد الجناح من الدجاج A, B, وC بعد خمسة أسابيع من التحدي.
فصل المصل وتشغيل محلل المناعةfluorescence للكشف عن الأجسام المضادة T.cruzi. تأمين رعاية الحيوانات مع السكن الممتاز والغذاء وإمدادات المياه. استخدام السائل المنوي السائل المنوي من شخص بالغ، ومرض شاغاس APCR إيجابية، ومن موضوع السيطرة كما هو الحال في الخطوة 1.5 من البروتوكول.
غرس 100 ميكرولتر aliquots من السائل المنوي في البريتونية وفي المهبل من الفئران. انتقال العدوى الجنسية من T.cruzi في الفئران الوالدين والذرية. البصمة من ال [مثقبونوما كروسّيّدّد فرومّا هدّيّد مادّي].
كشف النمط الظاهري لـ T.cruzi مع مقايسة المناعة. المناهضين لـ(تي) الأجسام المضادة كروزي لا تعترف L.braziliensis.
تمثيل بياني لـ ELISA و لم مقايسات nDNA-PCR. المجموعتين الأولى و الثانية على التوالي، سيطرة سلبية وإيجابية. المجموعة الثالثة، إيجابية nDNA-PCR وملخصات الأجسام المضادة محددة.
المجموعة الرابعة مع التهابات T.cruzi التي اكتشفتها nDNA-PCR ولكن في غياب الأجسام المضادة محددة. المجموعة الخامسة، والمشاركون أحرار من العدوى. وأظهرت هذه الرسوم ورسم الخرائط لسكان الأسرة وجود تناقضات بين نسب مضادات التن.
cruzi الأجسام المضادة وتلك من nDNA - PCR المقايسات. فتح مربع ودائرة، الذكور والإناث السلبية. أحمر مع مضاد لـ T
cruzi الأجسام المضادة وnDNA-PCR إيجابية. أسود، إيجابي nDNA-PCR وحدها. التسامح المناعي في الدجاج فقست من البيض T.cruzi تلقيح.
A, مراقبة وهمية, B, الدجاج التي تسيطر عليها الحية تحدى مع مستضد T.cruzi. C، الدجاج فقست من البيض T.cruzi تلقيح بعد التحدي مع مستضد معين. العدوى من T.cruzi أظهرت على يغرس السائل المنوي في تجويف الصفاق وفي المهبل.
الفئران ضحت ثلاثة أسابيع من هذه النقش أظهرت عش amastigote في القلب، في العضلات الهيكلية، وفي الأوعية وفي أنبوب الرحم. انتقال العدوى الجنسية من التهابات T.cruzi في نظام نموذج الماوس. أصيب T.cruzi الذكور والإناث، ونقل العدوى إلى زملائه ساذج.
العدوى T.cruzi نقل عموديا من الوالدين إلى الفئران ذرية. وكشف النشاف الجنوبي الفرقة الطفيلية anginate في غالبية القمامة F1. وأظهرت وصمة عار المناعة T.cruzi amastigotes engoniablast وفي الخلالي من epididymitis وإلى تجويف أنابيب seminiferous من الفئران ذرية.
كان العرض الطفيلي للبروتوزون في 21 حالة حادة من مرض شاغاس حاسماً للتحقق من بصمة T.cruzi في جميع الأشخاص المصابين. كشفت التناقضات بين نسب مقايسات الأجسام المضادة الطفيلية واختبارات الأحماض النووية عن غالبية آثار الأقدام في المرضى الخاليين من الأجسام المضادة. الفرق العام يفسر جيدا في نموذج الدجاج تنعكس على T.cruzi بعد الأسبوع الأول من تطور الجنين.
وأظهرت الدجاج الكبار التسامح المناعي آثار أقدام الطفيلي ولكن مع عدم وجود الأجسام المضادة محددة. بدأت الحيوية المضادة كروزي في Chagas المريض القذف العدوى على نطاق واسع على يغرس في المهبل الماوس وكذلك في تجويف البريتوني. أظهر علم الأمراض أعشاش T.cruzi amastigote في عضلات القلب والهيكل العظمي وفي الأوعية الدموية وأنبوب الرحم.
تربية الفئران شاغاس مع الاصحاب السذاجة كشفت الإناث المصابة والذكور نقل T.cruzi إلى الاصحاب غير المصابين الساذج وغالبية من القمامة اكتسبت العدوى نقل عموديا إلى ذرية. وتناول البروتوكول القائم على الأسرة فحص الأحماض النووية من أجل إجراء عمليات نقل دم موثوق بها وتحريات عن الأوبئة وتوضيح احتمال استمرار مرض شاغاس المنقول جنسياً.
