تحتوي المركبات النشطة بيولوجيا التي يتم التحكم فيها ضوئيا على شظايا قابلة للإيزوميريز ضوئيا بشكل عكسي ، ومفاتيح ضوئية في جزيئاتها. المركبات عبارة عن ببتيدات دورية معدلة بواسطة جزء من الدياريليثين يخضع لتحولات كهربية عكسية ناتجة عن الضوء. يمكنهم التبديل الضوئي ، أي التبديل بين شكل مولد للأشعة فوق البنفسجية وغير نشط بيولوجيا وشكل نشط بيولوجيا يولد الضوء الأحمر.
ويعتقد أن الأدوية القابلة للتبديل الضوئي أكثر أمانا من الأدوية غير القابلة للتبديل الضوئي. هذا لأنه يمكنك إعطاء شكل غير سام وغير نشط لجسم الإنسان وتنشيطه محليا بالضوء فقط حيث تحتاج إليه ، وهو ، على سبيل المثال ، الأورام أو المثاقب أو الجروح. لا توجد طرق أو بروتوكولات قياسية للتطوير قبل السريري أو السريري لمثل هذه الأدوية الضوئية ، لذلك هنا ، نريد أن نعرض لك التجارب التي يمكن استخدامها لهذا البحث قبل السريري المبكر.
ستوضح كاترينا هورباتوك وتتيانا ماخني الإجراءات. تمت الموافقة على رعاية الحيوان والإجراءات التجريبية من قبل لجنة أخلاقيات البيولوجيا التابعة لشركة Bienta. ابدأ بإعداد المخازن المؤقتة باستخدام الإجراءات القياسية.
بدلا من ذلك ، استخدم الحلول المتاحة تجاريا. إعداد حلول الأسهم من المركبات. لكل مركب ، قم بوزن دفعتين من 5.12 ملليجرام من المركب في الشكل الضوئي المغلق الحلقي إلى أنبوبي إيبندورف سعة 1.5 ملليلتر ، أحدهما شفاف والآخر بجدران سوداء غير شفافة.
كعنصر تحكم إيجابي ، قم بوزن 2.28 ملليغرام من الببتيد الأم ، وليس الببتيد المتحكم فيه ضوئيا ، في أنبوب إضافي. أضف 100 ميكرولتر من DMSO النقي لكل عينة ، ودوامة لمدة 30 ثانية. قم بتزكيل ضوئي لمحلول المخزون في الأنبوب ذي الجدران الشفافة عن طريق تشعيع المحلول بليزر 650 نانومتر ، وكثافة طاقة خفيفة 6 واط لكل سنتيمتر مربع ، مع دوامة لضمان الخلط.
استمر حتى يتغير اللون من الأرجواني الداكن إلى البني الفاتح. يحفظ بعيدا عن الضوء بورق الألمنيوم. البذور 5،000 إلى 10،000 خلية لكل بئر.
استخدمنا حوالي 8،000 خلية لويس لسرطان الرئة في 200 ميكرولتر من DMEM في 60 بئرا مركزية من صفيحة معقمة مكونة من 96 بئرا ذات قاع شفاف وجدران سوداء غير شفافة. املأ الآبار ال 36 المتبقية ب DMEM النقي. احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية في جو CO2 بنسبة 5٪ طوال الليل.
في اليوم التالي ، قم بإعداد التخفيفات التسلسلية للمركبات والتحكم الإيجابي في ألواح البولي بروبلين الشفافة. ابدأ بالأسهم في DMSO ، وقم بتخفيفها باستخدام DMEM ، ولكن لا تتجاوز حجم DMSO 1٪ في أعلى تركيز نهائي. لمنع الايزومرات الضوئية غير المنضبط للمركبات المدروسة ، أطفئ الأنوار في الخزانة المعقمة.
نقل 100 ميكرولتر من التخفيفات إلى 56 بئرا مع 100 ميكرولتر من DMEM المضافة مسبقا للوصول إلى التركيز النهائي المطلوب للمركبات في الآبار ، عادة في نطاق خمسة إلى 150 ميكرومولار. بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من DMEM إلى أربعة آبار ، والتي تعمل كعنصر تحكم سلبي. قم بتغطية الألواح بورق الألمنيوم أو غطاء بلاستيكي غير شفاف لمنع التبديل الضوئي غير المنضبط.
ضع الألواح في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية لوقت الحضانة المختار. بعد الحضانة ، أضف 50 ميكرولترا من محلول التلوين لكل بئر إلى الألواح. استخدم Hoechst 33342 خماسي الميكرومولار ويوديد البروبيديوم أحادي الميكرومولار كحلول تلطيخ نهائية لهذه التجربة.
احتضان مرة أخرى عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. قم بإجراء التصوير الفلوري الآلي باستخدام عدسة هدف تكبير 20X. العمليات المختبرية لهذا الجزء من الطريقة مماثلة لتلك الموصوفة لتجربة 2D: إعداد ثقافة الخلية ، والحضانة مع المركبات المختبرة ، والتصوير.
ومع ذلك ، في هذه الحالة ، يتم تحضير الخلايا على شكل كرويات مدمجة وناضجة في صفيحة ذات قاع U ذات 384 بئرا ، شديدة الالتصاق منخفضة للغاية مع جدران سوداء غير شفافة. يسمح استخدام لوحة بهذا الحجم بمقارنة مركبين في تجربة واحدة. في هذه التجربة ، استخدمنا بالإضافة إلى ذلك Calcein AM كمكون ثالث لمحلول التلوين متعدد الألوان.
يتم تحليل الصور التي تم الحصول عليها من كل من تجارب 2D و 3D باستخدام برنامج تحليل الصور الآلي للأدوات. تعتبر الخلايا الملطخة بأصباغ Hoechst و propidium iodide ميتة نخرية ، ويتم استخدام جزءها كدالة للتركيز لحساب قيمة IC50. قم بتجميع القطار البصري لتشعيع العينة.
يتكون من كابل بصري من مصدر ضوء الليزر ، وعدسة ذات بعد بؤري متغير ، وحقنة بغطاء غير شفاف ، ونهاية قطع مسطحة. يجب إجراء جميع العمليات اللاحقة في غرفة مظلمة مع الحد الأدنى من الإضاءة في مكان العمل. قم بإعداد عينة نسيج نموذجية محملة بالمركبات الضوئية غير النشطة.
في المدى النموذجي ، يتم خلط خمسة جرامات من لحم الخنزير المفروم الطازج ميكانيكيا مع محلول PBS للمركب للوصول إلى التركيز النهائي البالغ 50 ملليغرام لكل كيلوغرام. املأ المحقنة بالعينة المحملة. قم بإشعاع العينة في القطار البصري للتعرض المطلوب ووقت جرعة الضوء.
بعد التعرض ، اصنع شرائح بسمك أربعة ملليمترات من العينة عن طريق دفع الكتلة من المحقنة بالمكبس وقطعها بمشرط. قم بوزن واستخراج المركب باستخدام الأسيتونيتريل والماء وخليط TFA و 70٪ أسيتونيتريل و 01٪ حمض ثلاثي فلورو أسيتيك في أنبوب إيبندورف سعة 1.5 ملليلتر. أجهزة الطرد المركزي في 20XG لمدة 30 دقيقة مرتين لإزالة المواد غير القابلة للذوبان وجمع المواد الطافية.
سجل الكروماتوجرام المكتشف بالأشعة فوق البنفسجية عند اكتشاف 570 نانومتر لشكلها المغلق واكتشاف 270 نانومتر للشكل الدائري المفتوح. استخدم عينات التحكم غير المشععة والمشععة المحضرة بشكل مشابه لمحاليل المخزون في تجارب الخلية لتحديد أوقات الاحتفاظ المحددة ومعايرة الطريقة. كرر التجربة ثلاث مرات ، وارسم النسبة المئوية الطبيعية لكل شكل ضوئي على الرسم ، النسبة المئوية مقابل المسافة من سطح الأنسجة المشععة.
في اليوم صفر ، قم بتلقيح C57 Black 6 الفئران البالغة التي تزن كل منها حوالي 20 جراما تحت الجلد مع تعليق حوالي نصف مليون خلية من خلايا سرطان الرئة لويس في حوالي 100 ميكرولتر من مزيج DMEM و Matrigel في الساق الخلفية اليمنى. يتم هذا الإجراء تحت تخدير الأيزوفلوران بنسبة 5٪. الحيوانات جاهزة للعلاج في الأيام من الخامس إلى الثامن ، عندما تكون الأورام واضحة.
يجب إجراء جميع العمليات التي تنطوي على الاختبار في ظروف شبه مظلمة. تنطبق هذه الحالة أيضا عند علاج الحيوانات بعد تلقي الجرعة المركبة لمدة يومين. قم بتجميع أربع مجموعات من ثمانية بشكل عشوائي ، وقم بإزالة الفراء من منطقة الورم.
تتلقى المجموعتان الضابطتان حقنة في الوريد للسيارة. 100 ميكرولتر ملحي لكل 20 جرام ، وتلقت الحيوانات في المجموعتين التجريبيتين المركب المختبر في الشكل الضوئي غير النشط في محلول واحد ملليغرام لكل ملليلتر ملحي. إعطاء البلعة المركبة في الوريد الذيل بمعدل خمسة ملليلتر لكل كيلو.
بعد ساعتين و 45 دقيقة من حقن المركب ، قم بتشعيع منطقة الورم لمدة 20 دقيقة تحت تخدير إيزوفلوران باستخدام ليزر 650 نانومتر ، باستخدام كثافة طاقة ضوئية تبلغ 100 ملي واط لكل سنتيمتر مربع. مراقبة بعناية الحيواناتالظروف على مدى 30 دقيقة القادمة. مراقبة الحيوانات يوميا ، وقياس وزنها وأبعاد أورامها.
قياس أحجام الورم ، ولاحظ تطور النخر. تحديد معدل البقاء على قيد الحياة باستخدام الإجراء القياسي. يمكن تقديم نتائج بروتوكولنا للخطوة الأولى في حالة تجارب زراعة الخلايا ثنائية الأبعاد كصور ، كما هو موضح هنا في صورة تمثيلية لخلايا سرطان الرئة لويس المحتضنة ب LMB002 بتركيزات مختلفة ولفترات مختلفة من الحضانة.
يسمح التلوين المشترك مع Hoechst ويوديد البروبيديوم بتصور نوى الخلية في القناة الزرقاء ، وبالتالي إعطاء إجمالي عدد الخلايا. لوحظت الخلايا ذات السلامة المعرضة للخطر لغشاء البلازما في القناة الحمراء. بافتراض أن الأخير ميت نخرا ، يمكن قياس السمية الخلوية الظاهرة لمركب قيد الدراسة كنسبة مئوية من الخلايا الإيجابية ليوديد البروبيديوم.
يتم عرض نتائج القياس الكمي للبيانات التي تم الحصول عليها من خلال التحليل الآلي للصور هنا. بالنسبة ل LMB002 ، يمكن رؤية التبعيات السيني للنسبة المئوية للخلايا الإيجابية ليوديد البروبيديوم في تركيز المركب. من هذه البيانات ، يمكن تحديد قيم IC50.
كشفت تجربتنا أن الشكل المفتوح ل LMB002 أقل سمية بحوالي خطوة تخفيف واحدة من الببتيد الأولي ، Gramicidin S ، في حين أن الشكل المغلق يوضح ثلاث إلى أربع خطوات تخفيف أقل سمية ، والتي تزداد مع وقت الحضانة. أنتجت تجارب الخلايا 3D نفس النوع من البيانات الخام ، حيث تم حل الصور الكروية أحادية الخلية لكل جدار. يتيح إدراج الكالسيين كصبغة تلطيخ ثالثة تحديد كمية جزء الخلايا النشطة الأيضية التي لوحظت في القناة الخضراء.
تم الحصول على منحنيات تأثير الجرعة ، مثل تلك الموجودة في تجربة 2D ، من أكوام Z-stack من الصور. توضح اللوحة A هذه المنحنيات ، مما يؤكد نتائج 2D. كما هو موضح في اللوحة B ، يختلف القطر الكروي الكلي باختلاف تركيز المركب.
تسمح تجربة الخطوة الثانية بتحديد تركيزات LMB002 في كلا الشكلين الضوئيين باستخدام كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء مكتشفة بالأشعة فوق البنفسجية. كان كلا الشكلين الضوئيين مختلفين بما فيه الكفاية في أوقات الاحتفاظ والامتصاص ، كما هو موضح مدمجا على اللوحتين A و B من الشكل. يتم تلخيص البيانات التي تم الحصول عليها في الشكل ، مما يؤكد أن مصدر الضوء الأحمر لدينا يحفز التحويل الضوئي LMB002 المغلق بالحلقة على عمق يصل إلى سنتيمتر واحد في بديل الأنسجة ، واللحم المفروم عند حوالي 103 ملي واط لكل سنتيمتر مربع.
تم تمثيل نتائج التجربة في الجسم الحي ، الخطوة الثالثة من منهجيتنا ، من خلال الرسوم البيانية التي تظهر نمو الورم كدالة للوقت في منحنيات بقاء كابلان ماير. الاستراتيجية الممثلة هنا لتقييم الأدوية المرشحة للتبديل الضوئي عملية ومناسبة للمركبات ذات المفاتيح الضوئية من نوع diarylethene. الخطوة الأولى ، يمكن استخدام القياس الكمي للسمية الخلوية للفحص الأولي لمكتبات المركبات التي يتم التحكم فيها ضوئيا.
الخطوة الثانية ، تقييم كفاءة التبديل الضوئي سهل الإعداد وأخلاقي. لا يتطلب الحيوانات الحية. الخطوة الثالثة ، في نماذج علم الأدوية الضوئية في الجسم الحي ، يمكن تطبيق العلاج على الحيوانات الصغيرة.
