سيساعد هذا البروتوكول في تحديد نشاط بروتينات ATPase عن طريق قياس الفوسفات الحر الناتج عن التحلل المائي ATP بواسطة البروتينات. مقايسة الملكيت الخضراء هي إجراء بسيط وحساس وسريع وغير مكلف للكشف عن الفوسفات غير العضوي. إنها مناسبة للأتمتة والفحص عالي الإنتاجية للمركبات مقابل هدفها.
ستلعب هذه التقنية دورا مهما في الاكتشاف السريع للمثبطات ضد بروتين Hsp90 ، وهو هدف مهم مضاد للسرطان. للبدء ، ماصة 40 ميكرولتر من معيار فوسفات واحد مليمولار في 960 ميكرولتر من الماء عالي النقاء للحصول على محلول فوسفات 40 ميكرومولار. أضف هذا المحلول وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لتشكيل تخفيف تسلسلي للفوسفات من 0 إلى 40 ميكرومولار.
بعد ذلك ، استخدم ثمانية ميكرولترات من الخميرة Hsp90 لنشاط ATPase القابل للقياس. أضف كاشف الملكيت الأخضر إلى الفراغ والتحكم الإيجابي ، وتحقق من فرق الكثافة الضوئية بين الفراغ والتحكم الإيجابي بعد أن تكون الإضافة 0.5 على الأقل وأقل من 1. لتحضير ATP ، انقل ملليغرام واحد من ATP إلى قنينة تحتوي على 453.39 ميكرولتر من الماء عالي النقاء للحصول على محلول مخزون أربعة مليمولار.
تحضير ATP طازجة ، لأنه يمكن أن يتحلل تلقائيا مع مرور الوقت. أضف أربعة ميكرولترات من محلول مخزون ATP إلى كل بئر لإعطاء تركيز نهائي للبئر يبلغ 0.2 مللي مولار. أضف جزيء ATP باعتباره المكون الأخير للتفاعل باستخدام ماصة متعددة القنوات بحيث تبدأ جميع التفاعلات في وقت واحد.
بعد ذلك ، قم بإعداد مخزون 10 مليمولار من جيلداناميسين عن طريق إذابة ملليغرام واحد في 178.37 ميكرولتر من DMSO. باستخدام محلول المخزون ، قم بإعداد محلول 4 مليمولار و 0.8 مليمولار و 0.16 مليمولار و 0.032 مللي مولار و 0.0064 مللي مولار و 0.00128 مليمول في DMSO عن طريق التخفيف التسلسلي. أضف ميكرولتر من محاليل المخزون هذه إلى كل بئر للحصول على تركيز بئر نهائي قدره 0.1 مللي مولار و 0.02 مللي مولار و 0.04 مللي مولار و 0.0008 مللي مولار و 0.00016 مللي مولار و 0.000032 مللي مولار.
ثم قم بإعداد الآبار مع الآبار التي تحتوي على التحكم الفارغ والسلبي. الآبار التي تحتوي على geldanamycin بمثابة السيطرة الإيجابية. جهز الألواح المكونة من 96 بئرا وقم بإعداد بئر منفصل للمركبات التي تظهر امتصاصا عند 620 نانومتر لتسجيل الامتصاص عند هذا الطول الموجي.
لا تظهر بئرا منفصلا لجيلداناميسين ، لأن جيلداناميسين لا يظهر امتصاصا عند 620 نانومتر للتركيز المستخدم في هذا الفحص. قم بإعداد آبار الفحص عن طريق إضافة مياه فائقة النقاء إلى كل بئر. ثم أضف الكمية المطلوبة من المخزن المؤقت للفحص ومحلول مركب مثل محلول جيلداناميسين.
أضف Hsp90 إلى الآبار المناسبة وهز الألواح لمدة دقيقتين على شاكر لوحة في درجة حرارة الغرفة. أضف أربعة ميكرولترات من محلول ATP باستخدام ماصة متعددة القنوات. لف اللوحة بورق الألمنيوم ورجها لمدة دقيقتين على شاكر لوحة في درجة حرارة الغرفة عند 200 دورة في الدقيقة.
احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات. أوقف التفاعل بإضافة 20 ميكرولترا من كاشف الملكيت الأخضر بنفس ترتيب ATP باستخدام ماصة متعددة القنوات واحتضانها لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. أخيرا ، قم بقياس امتصاص اللوحة عند 620 نانومتر في قارئ اللوحة.
بالإضافة إلى اللوحة A ، أضف 90 ميكرولترا من مخزن الفحص في كل بئر. بالإضافة إلى اللوحة B ، أضف 90 ميكرولترا من المخزن المؤقت مع Hsp90 في كل بئر. بالإضافة إلى اللوحة C ، أضف 90 ميكرولترا من ATP ، بالإضافة إلى اللوحة D أضف 90 ميكرولترا من كاشف الملكيت الأخضر في كل بئر.
استخدم نظام توزيع آلي متعدد القنوات لنقل 40 ميكرولترا من المحلول من كل بئر من لوحة الإضافة A إلى اللوحين الرئيسيين الأول والثاني ، واللوحة B إلى اللوحة الرئيسية الثالثة والرابعة. انقل 20 ميكرولترا من المحلول من كل بئر من الصفيحة المركبة إلى الصفائح الرئيسية الأولى ، والألواح الرئيسية الثانية ، والألواح الرئيسية ثلاثة ، والألواح الرئيسية أربعة. هز لوحات لمدة دقيقة واحدة في شاكر في 200 دورة في الدقيقة.
انقل 20 ميكرولترا من المحلول من كل بئر من ألواح الإضافة C إلى الألواح الرئيسية واحد واثنان وثلاثة وأربعة. هز لوحات لمدة دقيقة واحدة في شاكر في 200 دورة في الدقيقة. احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات ثم انقل 20 ميكرولترا من كاشف الملكيت الأخضر من لوحة الإضافة D إلى آبار الألواح الرئيسية واحد واثنان وثلاثة وأربعة.
بعد حضانة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، قم بقياس امتصاص اللوحة عند 620 نانومتر في قارئ اللوحة. يوضح هنا تركيب أخضر الملكيت وتفاعلات كاشف الملكيت الأخضر A مع الفوسفات الحر والتفاعل اللاحق مع الكاشف B. يتم تمثيل مخطط قياسي لتركيز الفوسفات القياسي في هذا الشكل.
هنا ، يمثل المحور السيني تركيز الفوسفات الحر أو pi في الميكرومولار ، ويتم تصوير الامتصاص عند 620 نانومتر على المحور ص. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف بين رقمي العينة. يتم استخدام النسبة المئوية لنشاط ATPase لقياس تثبيط البروتين المعتمد على الجرعة بواسطة geldanamycin.
وقد لوحظ أن جيلداناميسين يثبط البروتين بطريقة تعتمد على الجرعة بقيمة IC50 تبلغ 0.85 ميكرومولار. هنا ، كل نقطة هي وسيلة لتحديدين. يظهر تطور اللون في اللوحة الرئيسية بعد إضافة عامل الملكيت الأخضر في هذه الصورة.
يرجع اللون الوردي في بئر A11 إلى اللون المركب. وبالمثل ، يظهر هنا تطور اللون في اللوحة الرئيسية الثانية. يرجع اللون الوردي في بئر A11 إلى الطبيعة الملونة للكمبوند.
يظهر هنا تطور اللون بعد إضافة كاشف الملكيت الأخضر في اللوحة الرئيسية الثالثة وفي اللوحة الرئيسية الرابعة. تعد إضافة ATP وكاشف الملكيت الأخضر في نفس الفترة الزمنية إلى كل بئر أمرا مهما يجب تذكره عند محاولة هذا الإجراء.
