وsesphatase التيروزين SHP2، هو وسيط رئيسي للإشارات الخلوية، وتعزيز بقاء الخلايا وانتشار. يركز فريقي على العثور على مثبطات SHP2 الصغيرة لعلاج السرطان. لدينا تقنية يوفر طريقة سريعة وقوية لإنشاء بينانتران الخلية، فضلا عن المشاركة المستهدفة من مثبطات SHP2 جزيء صغير، في الخلايا.
هذا هو الطمأنة ، يتم توجيه موارد الاكتشاف بكفاءة. SHP2 كهدف جذاب لعلاج السرطان. والعديد من مثبطات SHP2، هي في التجارب السريرية.
لدينا تقنية لتسهيل اكتشاف مثبطات الجيل القادم مع تحسين ملامح فعالية. التظاهر للإجراء سيكون سيليست روميرو، مساعدة باحثة ودوغلاس شيفلر، أستاذ مساعد باحث، من مختبرنا. لبدء فصل HEK293 الخلايا التائية من لوحات، وذلك باستخدام ثلاثة ملليلتر من كاشف مفرزة الخلية.
تمييع الخلايا مع 12 ملليلتر من وسائل الإعلام النمو، وجمعها عن طريق الطرد المركزي في 1، 400 مرات G، لمدة أربع دقائق. Resuspend الحنك الخلية في 10 ملليلتر من وسائل الإعلام النمو وقياس تركيز وديموجة الخلايا مع الأزرق trypan وعداد الخلية. لوحة 700، 000 الخلايا المتنامية أضعافاً مضاعفة في كل بئر من ستة بئر لوحة ثقافة واحتضانها لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية، و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
في اليوم التالي، تمييع اثنين من ميكروغرام من الحمض النووي البلازما إلى 200 ميكرولترات من عازلة transfection. دوامة الحمض النووي البلازما لمدة 10 ثوان و centralfuge في 1، 400 مرة G لمدة أربع دقائق. أضف أربعة ميكرولترات من كاشف نقل الملوثات إلى الحمض النووي المخفف.
دوامة لمدة 10 ثانية، وتكرار الطرد المركزي. احتضان الحمض النووي في 23 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، ثم إضافة مزيج transfection إلى الخلايا T HEK293 المرفقة في لوحة الآبار الستة، وإعادة الخلايا إلى الحاضنة لمدة 24 ساعة أخرى. لإعداد لوحات فحص, تمييع حلول مثبطات في DMSO, لتركيز المخزون من 10 millimolar والاستغناء عنها في 384 انخفاض بئر لوحة مصدر حجم الميت, للاستخدام الفوري.
بقعة الحجم المطلوب من مثبطات أو مركبة، وذلك باستخدام معالج السائل في 384 لوحات PCR في الوقت الحقيقي في حجم النهائي المستهدف أقل من 0.5٪ DMSO. ختم لوحات باستخدام ختم لوحة مع تطهير الغاز الخامل. لإعداد الخلايا المصابة قبل احتضان وسائل الإعلام النمو وبيع مفرزة في حمام الماء 37 درجة مئوية.
إزالة الخلايا من الحاضنة وتبخر بلطف وسائل الإعلام من الآبار. إضافة 0.3 ملليلتر من كاشف مفرزة الخلية إلى كل بئر، وصخر بلطف لوحة ذهابا وإيابا لتغطية سطح لوحة أسفل بدقة. احتضان لوحة في 23 درجة مئوية لمدة دقيقتين.
إضافة ملليلتر واحد من وسائل الإعلام النمو إلى كل بئر، وبسافا ماصة الخلايا في البئر. ثم نقلها إلى 15 ملليلتر فالكون الطرد المركزي أنبوب الطرد المركزي الخلايا في 1، 400 مرة G لمدة أربع دقائق لجمع الخلايا. التعرق بلطف وسائل الإعلام، ثم resuspend بيليه الخلية في مليلتر اثنين من وسائل الإعلام النمو.
تأكد من قابلية الخلية للملاءمة أكبر من 90٪ باستخدام محاولة تحريك الأزرق وعداد الخلية. تخفيف الخلايا إلى تركيز 125 خلية لكل ميكرولتر، والحفاظ على الخلايا في التعليق لمدة لا تزيد عن ساعتين لقابلية البقاء الأمثل. للحضانة مع مثبطات SHP2، الاستغناء عن الخلايا في الحوض معقمة حل قناة واحدة الحوض الصغير.
أجهزة الطرد المركزي أعدت سابقا 384 جيدا في الوقت الحقيقي لوحة PCR في 2، 500 مرة G لمدة خمس دقائق، ثم إزالة الختم واستخدام ماصة متعددة القنوات ميكرولتر 125، لإضافة خمسة ميكروليتر من الخلايا المخففة إلى ويلز المطلوب. الطرد المركزي لوحة في 42 مرات G لمدة 30 ثانية دون غطاء، ثم نعلق غطاء واحتضان لوحة لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. قم ببرمجة دورة الحرارة، وفقًا لاتجاهات المخطوطة إما لتدرج الملف الحراري أو تجربة التدرج الحراري.
بدء برنامج نبض الحرارة thermocycler، ووضع لوحة المقايسة على كتلة الحرارية. عند الانتهاء من البرنامج، إزالة لوحة المقايسة. تكملة كل بئر من لوحة المقايسة مع خمسة ميكروليترس من المزيج الرئيسي الكشف المرخص.
جهاز طرد مركزي في 42 مرة G لمدة 30 ثانية، وتخزينها في 23 درجة مئوية في الظلام لمدة 30 إلى 60 دقيقة. قياس chemiluminescence باستخدام قارئ microplate مع الوقت الأمثل للتكامل. تجربة التدرج الحراري للنوع البري SHP2، أسفرت عن ملف تعريف حرارية خلوية السيني مع انتقال ذوبان ضيق نموذجي للبروتين مطوية.
حضانة من نوع البرية SHP2 مع مثبطات اللوستري SHP099، استقرت إلى الملف الحراري إلى درجة كبيرة وقابلة للقياس. تثبيت SHP2, تتبع أيضا مع قوة SHP099 مثل المركبات الحرارية. في 10 ميكرومولار، وأكثر قوة RMC-4550، أنتجت درجة أكبر من الاستقرار من SHP099 لنوع البرية SHP2.
نظرًا لآليتها الفريدة ، فإن مثبطات SHP099 مثل مثبطات الكلاسيك أقل فعالية ضد العديد من المسوخ الـ SHP2 ، بما في ذلك SHP2-E76K. بما يتفق مع هذه الخصائص المعروفة فقط يتم ملاحظة الاستقرار الحراري الهامشي من SHP2-E76K بواسطة SHP099. يمكن أن يؤثر مستوى التعبير في بروتين علامة EPL بشكل كبير على كثافة الإشارة.
لمحات الحرارية لخلايا نوع البرية المتكاملة العابرة والمتقائلة. في ظل ظروف الأصول متطابقة هي مبينة. إن تطبيع المنحنيات المتباينة يوفر ملامح حرارية مماثلة، مما يكشف عن المجموعة الواسعة من نظام الكشف عن مركبات الكربون الهيدروفلورية.
الاستفادة من قدرة دورة الحرارية لإنتاج التدرجات الحرارية على محور قصير من لوحة 384 جيدا. يمكن إجراء سلسلة من المعايرات الحرارية على لوحة واحدة. في درجة حرارة مثالية، المعايرة متساوي الحراري باستخدام كامل 10 نقطة الجرعة استجابة، أسفرت عن EC50 مفيدة، لRMC-4550.
ويمكن استخدام مبادئ هذا الأصل لرصد تدهور البروتينات في الخلايا، التي تسببها مركبات بروتاك. نحن نستخدم تقنية التحول الخلوية ثيلما لاكتشاف مثبطات SHP2 متحولة واللوكيميا، والعقاقير المحددة ضد المسوخ SHP2 oncogenic المتكررة سيكون لها تأثير كبير لعلاج هذه السرطانات.
