تمثل الخلايا الدبقية الصغيرة المشتقة من iPS مصدرا ذا صلة بيولوجيا للخلايا الدبقية الصغيرة البشرية للتجارب في المختبر ، وهي أداة مهمة للتحقيق في بيولوجيا الخلايا الدبقية الصغيرة في الصحة والمرض. نقدم بروتوكول تمايز الخلايا الدبقية الصغيرة البسيط الذي يتطلب الحد الأدنى من استخدام عوامل النمو ويحقق درجة نقاء وإنتاجية عالية. أيضا ، نظهر مقايسة البلعمة البشرية بالكامل.
الخلايا الدبقية الصغيرة المشتقة من iPSC حساسة للغاية لتبخر الوسائط. يجب تجنب استخدام الآبار الموجودة في زاوية لوحة زراعة الخلايا ، وملء جميع الآبار الفارغة بالماء لتحسين البقاء على قيد الحياة. بمجرد أن تصل الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات ، أو iPSCs ، إلى 80٪ من الالتقاء ، قم بفصل المستعمرات عن طريق الغسيل بملليلتر واحد من DPBS ، وإضافة ملليلتر واحد من كاشف التفكك لمدة دقيقتين عند 37 درجة مئوية.
قم بإزاحة المستعمرات باستخدام رافع الخلايا عن طريق الكشط عدة مرات لإنشاء تعليق خلية واحدة. اجمع التعليق ، وانقله إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر يحتوي على تسعة ملليلتر من DPBS. ثم قم بطرد الخلايا بالطرد المركزي بمعدل 500 مرة جم لمدة دقيقة واحدة ، وقم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليقها في ملليلتر واحد من الجسم الجنيني ، أو EB ، المتوسط.
خذ 10 ميكرولتر من الخلايا ، وقم بتخفيف واحد إلى اثنين باستخدام التريبان الأزرق. عد الخلايا على مقياس الدم ، وبناء على عدد الخلايا ، قم بتخفيف مخزون الخلايا إلى تخفيف نهائي قدره 10،000 خلية لكل 100 ميكرولتر. بالنسبة لخلايا الطلاء ، أضف 100 ميكرولتر من الخلايا المخففة لكل بئر إلى صفيحة 96 بئرا منخفضة الالتصاق.
قم بطرد اللوحة بالطرد المركزي عند 125 مرة جم لمدة ثلاث دقائق ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة أربعة أيام. في اليوم الثاني ، باستخدام ماصة متعددة القنوات ، استبدل وسيط نصف EB القديم بوسيط جديد. لتوليد سلائف البلاعم البدائية ، أو PMPs ، قم بتغطية آبار لوحة من ستة آبار بإضافة ملليلتر واحد من محلول طلاء Matrigel البارد المثلج.
ثم احتضن اللوحة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعتين ، أو طوال الليل. في اليوم الرابع من تمايز EB ، باستخدام طرف ماصة واحد ملليلتر ، قم بنقل EBs إلى الآبار المطلية ب Matrigel. ماصة لأعلى ولأسفل لإزاحة EBs من البئر.
ثم أمسك اللوحة مائلة للسماح ل EBs بالاستقرار على حافة البئر. بمجرد أن تستقر جميع EBs ، ماصة برفق واستبدل الوسيط القديم ، مع الحفاظ على EB على حافة البئر بثلاثة ملليلتر من وسيط PMP الكامل المحضر حديثا. قم بتوزيع الخلايا بالتساوي في الآبار عن طريق خلط اللوحة يدويا من جانب إلى آخر ومن الخلف إلى الأمام.
ثم احتضان اللوحة لمدة سبعة أيام للسماح ل EBs بالالتصاق بقاع البئر. بعد سبعة أيام ، افحص EBs تحت مجهر المجال الضوئي عند التكبير أربع مرات للتأكد من أنها متصلة بقاع الآبار. قم بإجراء تغيير نصف متوسط ، وفي اليوم 21 ، استبدل الوسيط الكامل بثلاثة ملليلتر من وسيط PMP الكامل.
في اليوم 28 ، ابحث عن الخلايا المستديرة المشار إليها باسم PMPs في المادة الطافية. ثم اجمع الوسيط الذي يحتوي على PMPs باستخدام ماصة سعة 10 ملليلتر وآلة ماصة أوتوماتيكية دون إزعاج EBs. نقل PMPs في الوسط إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر.
قم بالطرد المركزي ل PMPs المجمعة بمعدل 200 مرة g لمدة أربع دقائق واستنشاق المادة الطافية قبل إعادة تعليقها في واحد إلى مليلتر من الخلايا الدبقية الصغيرة ، أو الوسط القاعدي IMG. ثم عد الخلايا على مقياس الدم كما هو موضح سابقا. الطرد المركزي بقية الخلايا ، وتخفيف PMPs إلى التركيز المطلوب.
ثم قم بطلاء الخلايا بكثافة من 10 إلى الخلايا الخامسة لكل سنتيمتر مربع على ألواح معالجة بزراعة الخلايا باستخدام وسيط IMG الكامل الطازج. بالنسبة لمقايسة البلعمة الخلوية الحية ، قم بلوحة 20 إلى 30 مرة من 10 إلى PMPs الرابعة في لوحة 96 بئرا و 100 ميكرولتر من IMG وسط كامل واتبع عملية التمايز لمدة 10 أيام. في يوم الفحص ، قم بإزالة 40 ميكرولتر من المتوسط لكل بئر ، وأضف 10 ميكرولتر من محلول التلوين النووي.
احتضان اللوحة لمدة ساعتين. قم بإذابة التشابك العصبي المسمى على الجليد ، وقم بصوتنة بلطف باستخدام صوتي الماء لمدة دقيقة واحدة. مرة أخرى ، ضع على الفور المشابك على الجليد.
تمييع المشابك المسمى في IMG الوسط الكامل في ميكرولتر واحد من المشابك العصبية لكل 50 ميكرولتر من المتوسط. للتحكم السلبي ، قم بإعداد 60 ميكرومولار Cytochalasin D في IMG وسط كامل لمنع بلمرة الأكتين ، وبالتالي البلعمة. ثم أضف 10 ميكرولتر من هذا المحلول إلى كل بئر للحصول على تركيز نهائي قدره 10 ميكرومولار ، واحتضانه لمدة 30 دقيقة.
أخرج اللوحة من الحاضنة ، واحتضنها عند 10 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. الحفاظ على لوحة على الجليد ، وإضافة 50 ميكرولتر من المتوسطة التي تحتوي على synaptosomes. قم بالطرد المركزي للصفيحة عند 270 مرة g لمدة ثلاث دقائق عند 10 درجات مئوية ، وحافظ على اللوحة على الجليد حتى الحصول على التصوير.
أدخل اللوحة في قارئ تصوير الخلايا الحية ، وحدد الآبار المراد تحليلها. ثم حدد عدسة موضوعية 20X. بعد ذلك ، اضبط التركيز ، الصمام الثنائي الباعث للضوء ، أو LED ، والشدة ، ووقت التكامل ، وكسب المجال الساطع والقنوات الزرقاء.
يجب أن يكون مضان المشبك ضئيلا في النقطة الزمنية الأولية. حدد عدد البلاط الفردي الذي سيتم الحصول عليه في المونتاج لكل بئر. الحصول على 16 بلاطة في وسط البئر ، وتصوير ما يقرب من 5 ٪ من إجمالي مساحة البئر.
اضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية ، والفاصل الزمني المطلوب للتصوير. بعد ذلك ، افتح برنامج التحليل. ثم افتح التجربة التي تحتوي على الصور ، وانقر على أيقونة تقليل البيانات.
في القائمة ، اختر خياطة التصوير ضمن معالجة التصوير لإنشاء صورة كاملة من أربعة في أربعة مربعات فردية في المونتاج مع المعلمات الموضحة في مخطوطة النص. حدد عتبة الكثافة باستخدام قنوات DAPI و RFP لهذه الصور. افتح صورة ، وانقر فوق تحليل.
ضمن تحليل، حدد التحليل الخلوي، وضمن قناة الكشف، اختر صورة مخيطة إما في قنوات DAPI أو RFP. بعد ذلك ، انتقل إلى علامة التبويب القناع الأساسي والعدد ، وقم بإنشاء قيمة عتبة وقيم حجم الكائن التي تحدد بشكل صحيح نوى الخلية في قناة DAPI ، أو إشارة المشبك في قناة RFP. لحساب عدد النوى، انتقل إلى قائمة تقليل البيانات، وضمن تحليل الصورة، حدد التحليل الخلوي.
مرة أخرى ، انتقل إلى علامة التبويب القناع الأساسي والعدد ، وضمن القناة ، حدد الصور المخيطة DAPI ، واستخدم المعلمات الموضحة في مخطوطة النص. بعد ذلك ، انتقل إلى علامة التبويب المقاييس المحسوبة ، وحدد عدد الخلايا. ثم للحصول على منطقة إشارة المشبك ، انتقل إلى قائمة تقليل البيانات ، وضمن التحليل ، حدد التحليل الخلوي.
مرة أخرى ، انتقل إلى علامة التبويب القناع الأساسي والعدد ، وضمن القناة ، حدد الصور المخيطة RFP ، واستخدم المعلمات المفصلة في مخطوطة النص. بعد ذلك ، انتقل إلى علامة التبويب المقاييس المحسوبة ، وحدد منطقة مجموع الكائن. في علامة التبويب تقليل البيانات ، انقر فوق "موافق" للسماح للبرنامج بتحليل جميع الصور التي تم الحصول عليها.
بمجرد تحليل الصور، قم بتصدير قيم منطقة مجموع الكائنات وعدد الخلايا لكل نقطة زمنية. ثم قسم منطقة مجموع الكائن على عدد الخلايا لحساب المنطقة التي تمت تسويتها لكل نقطة زمنية. في حالة مقارنة علاجات أو أنماط جينية متعددة، احسب مؤشر البلعمة باستخدام المعادلة المعطاة.
تظهر iPSCs غير المتمايزة مورفولوجيا مستعمرة مدمجة ذات حواف محددة جيدا. شكلت iPSCs المنفصلة مجاميع كروية تسمى EBs ، وتنمو في الحجم حتى اليوم الرابع من التمايز. عندما يتم طلاء EBs لتوليد PMP ، فإنها تلتصق بالألواح المطلية ب Matrigel ، وتنتشر طبقة من الخلايا وتحيط بالركام الكروي.
في اليوم 28 ، تظهر الخلايا المستديرة ذات نسبة السيتوبلازم إلى النواة الكبيرة في التعليق. يوصى بشدة بزراعة iPSCs في الألواح المطلية ب Laminin 521 بدلا من Matrigel ، بسبب ارتفاع إنتاجية PMP في الألواح المطلية ب Laminin 521. بعد تعرض PMPs لوسط IMG ، تكتسب الخلايا مورفولوجيا تشبه الخلايا الدبقية الصغيرة مع سيتوبلازم صغير في وجود عمليات ممدودة.
علاوة على ذلك ، تم التحقق من هوية الخلايا الدبقية الصغيرة عن طريق تلطيخ المناعي. عادة ، تعبر أكثر من 95٪ من الخلايا عن IB1 وحوالي 90٪ من الخلايا تعبر عن P2RY12 و TMEM119. أكد تحليل اللطخة الغربية أن iPSC اشتقت الخلايا العصبية الحركية السفلية للعلامات المشبكية البشرية المعبر عنها ، و synaptophysin وبروتين الكثافة بعد المشبكي 95.
في السيطرة مقارنة بالنقطة الزمنية الأولية ، بحلول 10 ساعات ، كانت إشارة الفلورسنت الحمراء قوية ، حيث تم ابتلاع معظم المشابك العصبية ، وتم توطينها في مقصورات حمضية داخل الخلايا. في IMGs المعالجة ب Cytochalasin D ، أشار انخفاض قوي في الإشارة الحمراء لمدة صفر و 10 ساعات إلى أن الإشارة المكتشفة ناتجة عن أحداث البلعمة. زادت مساحة المشابك المشبك مع مرور الوقت حتى 16 ساعة.
ومع ذلك ، فإن مساحة الإشارة الحمراء من الخلايا المعالجة بالسيتوكلاسين D لم تزداد مع مرور الوقت. يمكن استخدام الخلايا الدبقية الصغيرة المشتقة من iPS في تطبيقات مختلفة ، بما في ذلك البلعمة ، والاستجابة الالتهابية في دراسة أمراض النمو العصبي والأمراض التنكسية العصبية.
