إمكانية توليد أنواع فرعية مختلفة من الخلايا العصبية الحركية ذات الصلة بشكل خاص لنمويد أمراض الخلايا العصبية الحركية الحديثة مثل التصلب الجانبي الضموري. هذه الطريقة تسمح لاقتناء مجموعات الخلايا التي هي جامدة للغاية بالنسبة للخلايا العصبية الحركية مع هوية العمود الفقري أو الجمجمة في إطار زمني قصير ودون خطوة تنقية. قد يؤدي توليد الخلايا العصبية الحركية البشرية من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات أو iPSC في ظل حالة ثقافة مبسطة إلى تسهيل فحص الأدوية لأمراض الخلايا العصبية الحركية.
يمكن استخدام التعبير غير القابل للانتكاس من عامل النسخ البرمجة لتوليد أنواع خلايا أخرى مثل الخلايا العصبية والعضلات والهيكل العظمي والخلايا الدبقية من مستودع iPSC. بالنسبة إلى أي شيء وNIP iPSC، شطف ثقافة iPSC الإنسان مع برنامج تلفزيوني خال من الكالسيوم والمغنيسيوم قبل معالجة الخلايا مع كاشف تفكك الخلايا لمدة خمس إلى 10 دقائق في 37 درجة مئوية. عندما بدأت الخلايا في الانفصال عن حاوية الثقافة، استخدم ماصة P1000 لفصل الخلايا يدوياً من ثلاث إلى أربع مرات.
نقل الخلايا إلى أنبوب 15 ملليلتر وجلب حجم النهائي يصل إلى 10 ملليلتر مع برنامج تلفزيوني جديد دون الكالسيوم والمغنيسيوم للعد. جمع مرة واحدة 10 إلى الخلايا السادسة عن طريق الطرد المركزي و resuspend بيليه في 100 ميكرولترات من العازلة R من عدة electroporation. إضافة 4.5 ميكروغرام من الحمض النووي البلازما ناقل قابل للتبديل و0.5 ميكروغرام من الحمض النووي البلازما piggyBac transposase لنقل.
Transfect مع نظام كهربائي الخلية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة مع المعلمات المشار إليها. ثم، بذور الخلايا في الإنسان iPSC المتوسطة تكملها 10 مثبطات الصخور الدقيقة Y-27632 في طبق ستة ملليمتر مكسوة بالمصفوفة. بعد يومين من عملية الاستئصال، أضف 5 ميكروجرام لكل ملليلتر من البلاستيسيدين إلى الوسط الثقافي مع الاحتفاظ بالخلايا في المضادات الحيوية لمدة سبعة إلى 10 أيام على الأقل لمواجهة الخلايا التي لم تدمج الخلايا المتحولة.
في نهاية الحضانة، والحفاظ على الخلايا المُصابة بالعدوى بشكل ثابت كسكان مختلطين يتألفون من خلايا ذات أعداد مختلفة من المتحولين ومواقع تكامل مختلفة أو عزل المستنسخات المفردة. إعداد طبق إضافي للسماح للتعبير الفعال عن transgenes على ميكروغرام واحد لكل ملليلتر من الحث دوكسيسكلين ليتم تقييمها من قبل RT-PCR مع التمهيديات transgene محددة لاعصابينين -2 كما هو موضح سابقا. وفي هذه المرحلة، ينبغي أيضا تجميد مخزونات الخطوط الجديدة صفر والخطوط IPSC NIP في الوسيلة المجمدة بالنسبة للبلدان النامية.
لتمايز الخلايا العصبية الحركية، افصل الثقافات الخلية المُصابة بالعدوى بشكل ثابت مع كاشف الانفصام كما هو موضح للسماح بجمع الخلايا في أنبوب 15 ملليلتر يحتوي على خمسة مجلدات من DMEM/F12 المتوسطة. بعد الطرد المركزي، resuspend الخلايا في المتوسط iPSC الإنسان تستكمل مع مثبط الصخور الدقيقة للعد. بذور الخلايا على الأطباق المغلفة بالمصفوفة في 6.25 مرات 10 الخلايا الرابعة لكل كثافة مربعة سنتيمتر.
في اليومين المقبلين، استبدال االنبات مع تمايز المتوسطة الطازجة تكمل مع doxycycline. في اليوم الثاني، تغيير المتوسطة إلى neurobasal B27 المتوسطة تكملها مثبطات إفرازات غاما، مثبط مستقبلات عامل النمو البطانية الوعائية، و doxycyline. في اليوم الخامس، افصل الخلايا كما هو موضح وإعادة تعليق الخلايا المنفصلة في أربعة ملليلتر من متوسطة DMEM/F12 للعد.
Pipetting مهم للتفكك الكامل للخلايا. تجميد aliquot من السلف الخلايا العصبية الحركية في المتوسطة تجميد الخلايا وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وجمع بقية الخلايا عن طريق الطرد المركزي. Resuspend بيليه في وسط الخلايا العصبية تستكمل مع 10 مثبطات الصخور الدقيقة.
بذور الخلايا على polyornithine laminin المغلفة microslide يدعم مع غطاء البوليمر زلات في مرة واحدة 10 إلى الخلايا الخامسة في كثافة مربعة سنتيمتر. في اليوم السادس، استبدل الوسيط بعناية بوسيلة عصبية جديدة بدون مثبط للثقافة حتى تحليل المصب دون فصل الخلايا عن سطح الدعم. يمكن ملاحظة تعبير موحد عن علامة متعددة الأطراف الملزمة عامل النسخ أربعة أو OTC4 في تمييز ثقافات الخلايا في اليوم صفر في غياب عموم علامة الخلايا العصبية فئة محددة ثلاثة بيتا tubulin TUJ1 الإيجابية.
في اليوم الثالث، انخفاض قوي في عدد الخلايا الإيجابية OCT4 واضح. وهذا ينعكس بتعبير TUJ1 في مجموعة فرعية من iPSCs المتمايزة. في اليوم الخامس، لا يلاحظ أي تعبير عن OCT4 في السكان مما يدل على تعبير ثابت من TUJ1 ومورفولوجيا الخلايا العصبية المكتسبة.
تحليل المثبط للمناعة سبعة أيام بعد إعادة طلاء الخلايا العصبية الحركية السلف يكشف عن تعبير موحد من TUJ1 وعلامة الخلايا العصبية الحركية ناضجة الكولين أستيل ترانزفيراز. الخلايا العصبية التي تستمد من iPSC NIL تعرض بنجاح تيارات الصوديوم المعتمدة على الجهد والتيارات البوتاسيوم المعتمدة على الجهد. 80٪ من الخلايا العصبية الحركية المشتقة من iPSC NIL التي فرضت في طريقة المشبك الحالية قادرة على تحفيز قطارات الارتفاع عند حقنها بنبض حالي زائد 60 بيكوamps أو أكثر.
الحد الأدنى الحالي المطلوب لاستثارة تكرار اطلاق النار في أكثر من 50٪ من الخلايا المسجلة هو بالإضافة إلى 40 picoamps مع عتبة ارتفاع ما يقرب من ناقص 38 millivolts ومتوسط تردد اطلاق النار في زائد 40 picoamps من حوالي ثمانية هيرتز, مما يشير إلى أن الخلايا العصبية الحركية الشوكية iPSC NIL المستمدة المعرض خصائص وظيفية نموذجية من الخلايا العصبية الناضجة. يمكن اشتقاق الخلايا العصبية الحركية الشوكية والزعنية من iPSCs أو iPSCs التي تحمل طفرات مرضية وأنه يمكن استخدام هذه الخلايا كنماذج أطروحة أو لفحص المخدرات. ويمكن استخدام طريقتنا للمساعدة في فهم لماذا تتأثر وحدات الخلايا العصبية الحركية المختلفة تفاضلية من ALS.
