تم تصميم هذا البروتوكول للتحقق مما إذا كان المركب المرشح المضاد لفيروس التهاب الكبد B يمنع دخول الفيروس خاصة عن طريق منع ربط NTCP. تهدف هذه التقنية إلى التحقق مما إذا كان دخول فيروس التهاب الكبد B أو الخطوة الأولى من العدوى يمكن أن يقطعها أي مركب مرشح. سيوضح الإجراء بيانوت ثونغسري ، طالب PSP من مختبري.
لبدء قياس ببتيد توروكولات الصوديوم ، أو NTCP ، احتضان خلايا الكبد الناضجة بثمانية مطحنة أو أكثر من حمض الإيثيلين ديامينيترايتيك أو EDTA لمدة 15 دقيقة. اجمع كريات الخلايا وإصلاح خلايا الكبد بإضافة 300 ميكرولتر من 3.7٪ بارافورمالدهيد في PBS لمدة 15 دقيقة. ثم انقل معلق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر لأجهزة الطرد المركزي عند 300 جم و 25 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
اغسل الخلايا مرتين باستخدام 700 ميكرولتر من PBS تحتوي على 1٪ مصل بقري جنيني أو FBS في جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق كما هو موضح من قبل. ثم قم باختراق الخلايا ب 300 ميكرولتر من 0.05٪ Triton X 100 في PBS في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. بعد الطرد المركزي ، أعط ثلاث غسلات لمدة دقيقة واحدة لكل منها باستخدام 700 ميكرولتر من PBS تحتوي على 1٪ FBS.
احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية مع الجسم المضاد الأساسي ضد NTCP بنسبة واحد إلى 100 ، تليها ثلاث غسلات مع عازلة غسل بيرم ، والطرد المركزي. قم بتلطيخ الخلايا بجسم مضاد ثانوي مقترن ب Alexa Fluor 488 لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية وكرر ثلاث غسلات من محلول غسيل بيرم لمدة دقيقة واحدة لكل منها. بعد الطرد المركزي عند 300 جم ، أعد تعليق حبيبات الخلية ب 200 ميكرولتر من PBS تحتوي على 1٪ FBS.
في البرنامج ، حدد معلمات القياس لتحليل التدفق الخلوي ، بما في ذلك FSC أو SSC أو FITC أو PE. قم بتعيين تعديل التعويض التلقائي وقم بتضمين عناصر التحكم في التعويض كما هو موضح في المخطوطة. بعد ذلك ، قم بتشغيل العينة غير الملوثة بمعدل تدفق سائل متوسط يبلغ 60 ميكرولترا في الدقيقة. اضبط عتبة التشتت الأمامي والتشتت الجانبي حتى تغطي عدد الخلايا محل الاهتمام.
ضع علامة على منطقة البوابة في هذه المنطقة وتنطبق على جميع ضوابط التعويض. اضبط أنبوب مضاعف الصورة أو مضان PMT باستخدام التحكم غير الملوث واضبط جهد PMT ل FITC أو PE في الربع السالب. قم بتشغيل العينة الملطخة الموجبة واضبط FITC أو PE في مقياس الربع الموجب.
قم بتشغيل عناصر التحكم غير الملوثة أو الملطخة ب FITC أو PE ، واحسب التعويض ، وقم بتطبيقه على إعدادات العينة. بعد ذلك ، قم بتشغيل عينة خلايا الكبد لقياس مستوى NTCP. بعد ذلك ، ابدأ في تحليل خلايا الكبد الملطخة عن طريق التحديد المتسلسل على نوافذ BD FACSuite ، وأنبوب التحكم ، ثم علامة تبويب مصادر البيانات.
انتظر حتى تظهر البيانات الأولية. بعد ذلك ، في علامة تبويب ورقة العمل على الجانب الأيمن ، انقر فوق زر البوابة البيضاوية ، وحدد مجتمع الخلية و SSC ومخطط نقطة FSC باستخدام مؤشر الماوس. ثم انتظر حتى تظهر الدائرة P1.
انقر على زر بوابة الفاصل الزمني وحدد المنطقة في الرسم البياني الملون بفلوريسئين إيزوثيوسيانات. بدءا من أعلى قيمة شدة مضان إلى الجانب الأيمن. يظهر السطر P2 على الشاشة.
انقر فوق أنبوب التجربة ولاحظ أن البيانات الموجودة في علامة تبويب ورقة العمل تتغير. انقر فوق زر الإحصائيات ثم على المساحة الفارغة وورقة العمل. بعد ذلك ، لاحظ القيم الإحصائية لسكان عديد الببتيد الذي ينقل توروكولات الصوديوم.
استنشاق الوسط من ألواح بئر MHC المتقاربة بنسبة 100٪ وإضافة أربعة سيكلوسبورين ميكرومولار A مخفف بمتوسط ويليام E لمدة ساعتين. بعد ذلك ، قم بشفط مثبط دخول فيروس التهاب الكبد B المرشح لاستبداله بملليلتر واحد من Williams E Medium الذي يحتوي على 4٪ بولي إيثيلين جلايكول. بعد ذلك ، احتضان وسط الاستزراع بجزيئات فيروس التهاب الكبد B عند تعدد العدوى من 100 لكل بئر لمدة 18 ساعة عند 37 درجة مئوية.
بعد ذلك ، تخلص من المادة الطافية عند ملليلتر من PBS البارد وقم بالدوران برفق لشطف الوسط القديم بفيروس التهاب الكبد B غير المرتبط. بعد زراعة الخلايا بملليلتر من William's E Medium الكامل لمدة سبعة أيام ، اغسل الخلايا باستخدام PBS وقم بإصلاحها بنسبة 3.7٪ ألدهيد بارافورم و PBS لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. احتضان الخلايا المصابة بالتتابع بمحلول حجب IF لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الجسم المضاد الأولي عند تخفيف واحد إلى 200 في محلول الحجب طوال الليل عند أربع درجات مئوية.
ثم أعط ثلاث غسلات مدة كل منها دقيقة واحدة باستخدام محلول الغسيل قبل احتضان الخلايا بالجسم المضاد الثانوي في تخفيف واحد إلى 500 لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد الغسيل ثلاث مرات ، قم بتركيب العينة بوسيط تثبيت مضاد للتلاشي باستخدام DAPI وقم بتغطيتها بغطاء زجاجي زلة. باستخدام مجهر مضان مجهز بمرشحات DAPI و PE ، يكتشف إشارة التألق بعدسة موضوعية 20 × لتحديد نشاط الدخول المضاد ل HBV للمركبات المرشحة.
بالنسبة لفحص ربط الخلايا ، قم بإعداد الخلايا كما هو موضح من قبل واحتضانها بجزيئات فيروس التهاب الكبد B عند أربع درجات مئوية لمدة ساعتين. بعد التخلص من الوسط ، اشطف الخلايا بمليتين من PBS البارد مع دوامة لطيفة. ثم حصاد الخلايا المصابة باستخدام مكشطة الخلايا وتعطيل الخلايا مع العازلة التحلل.
انقل محللة الخلية إلى أنبوب تجميع لاستخراج الحمض النووي الكلي مع تفاعل البلمرة المتسلسل باستخدام ظروف درجة الحرارة الموضحة في المخطوطة. بعد تحضير الخلايا كما هو موضح من قبل ، احتضان خلايا الكبد بمحلول حمض توروكوليك الصوديوم لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، واستنشاق المحلول وغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام HEPES البارد. بعد ذلك ، أضف 300 إلى 500 ميكرولتر من HEPES البارد لحصاد الخلايا باستخدام كاشطات الخلايا على الجليد.
تجانس الخلايا عن طريق الموجات فوق الصوتية في 20 كيلو هرتز لمدة 20 ثانية ، واحتضان على الجليد لمدة خمس دقائق. بعد الطرد المركزي عند 10،000 G ، اجمع الطافي وقم بتقييم تركيز حمض التوروكوليك داخل الخلايا باستخدام مجموعة مقايسة حمض taurocholic ELISA. لغسل الخلايا والمحقنة في كالوريمتر المعايرة بالتحليل الحجمي متساوي الحرارة أو أداة ITC ، قم بتشغيل برنامج ITC.
ضمن علامة التبويب تمييز تجربة التشغيل ، حدد طريقة micro cal ل 19 نقطة حقن ITCM وانقر فوق فتح. عند فتح نافذة جديدة ، انقر فوق علامة التبويب النظيفة وفي نافذة طريقة التنظيف ، حدد زر الغسيل لطريقة تنظيف الخلايا وزر الشطف لطريقة تنظيف الحقن. انقر فوق التالي واتبع التعليمات التي تظهر على الشاشة.
بعد تحميل العينة في ITC ، انقر فوق زر التحميل الموجود أسفل علامة تبويب تشغيل التجربة. ثم انقر فوق التالي واتبع تعليمات الفيديو حتى تكتمل خطوة التحميل هذه. باستخدام حقنة ، املأ الخلية المرجعية بمخزن محلول في خلية العينة ب 15 ميكرومولار NTCP في المخزن المؤقت.
قم بإزالة المحلول الزائد ، ثم املأ المحقنة بمحلول 150 Micromolar Curcumin Ligand ، وتجنب فقاعات الهواء. قم بتشغيل العينة بالنقر فوق زر التشغيل ضمن علامة التبويب تشغيل التجربة. سيتم عرض المعلومات والإعدادات التجريبية على الجانب الأيسر.
أدخل تركيزات البروتين الليجند وتفاصيل درجة الحرارة. انقر فوق ابدأ لإجراء عملية الحقن. انتظر لمدة 1.4 ساعة حتى يكتمل تفاعل ليجند البروتين.
بمجرد اكتمال الحقن ، حدد زر التحليل المميز لتحليل البيانات الأولية باستخدام برنامج التحليل. ثم ، انقر فوق نظرة عامة لعرض البيانات الأولية واختيار نموذج التركيب كمجموعة واحدة من موقع الربط. لوحظت سمات النضج الكبدي بما في ذلك الخلايا ثنائية النواة والتشكل متعدد الأضلاع ، خاصة في المرحلة المتمايزة من MHC.
لوحظت زيادة كبيرة في تعبير NTCP في HepaRG المتمايز و MHC المتمايز. تم الكشف عن الشكل عالي الغليكوزيلاتي من NTCP في MHC المتمايز أكثر من HepaRG المتمايز. كانت مستويات NTCP أعلى في خلايا MHC المتمايزة منها في الخلايا غير المتمايزة.
قام تلطيخ الفيروس المناعي بتقييم أنشطة دخول مضادات فيروس التهاب الكبد B في اليوم السابع بعد الإصابة وتم تقييم مستوى ارتباط الفيروس بمستقبل سطح الخلية عن طريق تفاعل البلمرة المتسلسل في الوقت الفعلي. اقترح تحليل امتصاص حمض Taurocholic أن النشاط المثبط العقابي للمركبات المرشحة قلل من ارتباط فيروس التهاب الكبد B من خلال NTCP. تم الكشف عن التغيير اللوني من خلال الحقن المستمر لخلية العينة.
تم رسم انحدار قياسي للمربعات الصغرى غير الخطية بناء على موقع ربط واحد مناسب جيدا للبيانات. أشار الخط المتصل إلى أفضل ملاءمة للقيم التجريبية لربط SBB ك a وأن الخلايا والجسيمات الفيروسية لالتهاب الكبد B يتم تحضينها عند أربع درجات مئوية. يمكن تقييم تحديث حمض Taurocholic باستخدام التقنية المشعة.
يمكن قياس مستوى حمض التوروكوليك المشع باستخدام عداد محاكاة سائل. هذه التقنية بسيطة وسريعة للكشف عن دخول الفيروس في نشاط الاستفسار لأي نظام مضاد للفيروسات من شأنه أن يساعد في منع العدوى أو الإصابة مرة أخرى.
