تولد هذه الطريقة بصمة إصبع كارديوليبين من الكريات البيض بواسطة قياس الطيف الكتلي MALDI-TOF وتسمح بقياس النسبة بين أحادي الوسوكارديوليبين والكارديوليبين للتشخيص السريع لمتلازمة بارث. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي الكشف عن أنواع الدهون التشخيصية عن طريق جولة واحدة من مطياف الكتلة مباشرة بعد عزل الكريات البيض من ملليلتر واحد من الدم. هذه وحساسية العين وخصوصيتها تجعل هذا الفحص اختبارا تشخيصيا مناسبا ليتم دمجه في العمل الروتيني للمختبرات السريرية للكشف عن متلازمة بارث.
ابدأ بوضع عينات الدم على شاكر مداري لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، إلى 0.9 ملليلتر من الدم الكامل في أنبوب 1.5 ملليلتر ، أضف 0.1 ملليلتر من 20٪ دكستران. الآن ماصة وتفريق التعليق بلطف 20 مرة مع تجنب فقاعات الهواء والسماح RBCs الرواسب لمدة ساعة واحدة تقريبا في درجة حرارة الغرفة.
باستخدام حقنة ، قم بجمع ونقل السوبر نات الأصفر إلى أنبوب 15 ملليلتر ثم جهاز طرد مركزي عند 400 مرة G لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد التخلص من السوبرناتانت ، أعد تعليق الكريات التي تحتوي بشكل رئيسي على الكريات البيض و RBCs المتبقية في 0.6 ملليلتر من الماء المقطر المزدوج البارد الجليدي. بعد حوالي 15 ثانية ، أضف 0.2 ملليلتر من 0.6 كلوريد البوتاسيوم المولي إلى تعليق الخلية لاستعادة الأسمولية الصحيحة.
الصدمة الأسموزية القصيرة سوف تتحلل RBC وتترك الكريات البيض سليمة. ثم اضبط الحجم النهائي إلى 2.5 ملليلتر باستخدام PBS أحادي القوة. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للتعليق عند 400 مرة G لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
ويتبع ذلك التخلص من supernatant وإعادة غسل بيليه الكريات البيض مع 2.5 ملليلتر من PBS قوة واحدة. كرر جهاز الطرد المركزي وتخلص من المادة الفائقة كما هو موضح سابقا وأعد تعليق الكريات البيض التي تحتوي على الكريات البيض في 200 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج المعقم. قم بتجميد التعليق عند 80 درجة مئوية تحت الصفر أو قم بإجراء استخراج الدهون مباشرة.
ابدأ الاستخراج عن طريق نقل 20 ميكرولتر من تعليق الكريات البيض إلى أنبوب 1.5 ملليلتر وتدور عند 16،000 مرة G لمدة 30 ثانية. بعد التخلص من السوبر ناتانت ، أضف 10 ميكرولترات من الكلوروفورم إلى الكريات المتبقية وماصة بشكل متكرر لتعزيز استخراج الدهون. الآن ، أضف 10 ميكرولترات من محلول مصفوفة 9-aminoacridine إلى الكريات في الكلوروفورم.
ماصة وتشتت مرارا وتكرارا للخلط. قم بتدوير المحلول الذي يحتوي على الدهون والكلوروفورم ومحلول مصفوفة 9-aminoacridine عند 16،000 مرة G لمدة 30 ثانية. أخيرا ، قم بإيداع supernatant كقطرات من 0.35 ميكرولتر على هدف MALDI ليتم تحليلها وترك القطرات تجف في الهواء لمدة 10 إلى 15 دقيقة على الأقل.
لتحليل الدهون ، احصل على أطياف كتلة من العينات في ثلاثة أضعاف على مطياف الكتلة MALDI-TOF. بعد المعايرة باستخدام معايير الدهون ، قم بتعيين التحليلات في وضع الأيونات السالبة وتحسين نطاق نسبة الكتلة إلى الشحنة للكشف من 200 طومسون إلى 2000 طومسون لتحليل الجزيئات الصغيرة. حافظ على طلاقة الليزر 5٪ فوق العتبة للحصول على نسبة إشارة إلى ضوضاء جيدة.
لكل طيف كتلي ، قم بتطبيق ما معدله 2000 لقطة ليزر واحدة. احصل على الطيف في وضع العاكس باستخدام الاستخراج النبضي المتأخر. ضع نظام تعليق مصفوفة مسور على 400 طومسون لمنع تشبع الكاشف.
يوضح الشكل أن العيوب في جين TAFAZZIN تحدد عادة ملف تعريف الدهون الخاص بمتلازمة بارث المشار إليه من خلال ظهور أشكال monolysocardiolipin و cardiolipin غير الناضجة جنبا إلى جنب مع تقليل أشكال cardiolipin الناضجة في بصمة cardiolipin. علاوة على ذلك ، يوضح الشكل أيضا أن تحليلات MALDI-TOF / MS لكريات الدم البيضاء لمواضيع المراقبة عادة ما تظهر نوعين فقط من الكارديوليبين الناضج. يوضح الشكل أن أحادي السوليسوبروليبين بالإضافة إلى الكارديوليبين غير الناضج على نسبة الكارديوليبين الناضجة لمرضى متلازمة بارث كان أعلى من الأشخاص الأصحاء ومرضى قصور القلب.
هنا ، يتم فصل المجموعات الضابطة ومرضى متلازمة بارث بأكثر من ترتيب واحد من الحجم ، مما يدل على أن هذه الطريقة لديها قدرة تشخيصية قوية لمتلازمة بارث. لضمان نتيجة فحص جيدة ، من الأهمية بمكان اتباع جميع خطوات البروتوكول بعناية من عزل الكريات البيض إلى حساب نسبة monolysocardiolipin إلى cardiolipin. يعد قياس الطيف الكتلي MALDI-TOF مفيدا للحصول على ملامح الدهون لكميات صغيرة من العينات البيولوجية المختلفة لتحديد المؤشرات الحيوية للدهون أو التغيرات المرضية.
