لا يزال التوليد السيبراني هو أحدث بروتوكول لفهم الدور الممرض لأي طفرة جديدة في الحمض النووي للميتوكوندريا وربط النسبة المئوية للاتروبلاز بشدة المرض. تسمح هذه التقنية بإجراء تحقيق كيميائي حيوي في نظام نووي متجانس ، حيث تكون مساهمة الخلفية النووية للمريض غائبة. تسمح هذه التقنية بالتحقق من صحة الإمراضية لطفرة في الحمض النووي للميتوكوندريا.
ويجعل من الممكن دراسة تأثيره على المستوى الكيميائي الحيوي غسل الأطباق 35 ملم التي تحتوي على الخلايا الليفية مرتين باستخدام ملليلتر من 1X PBS دون الكالسيوم والمغنيسيوم. نظف السطح الخارجي للأطباق بنسبة 70٪ من الإيثانول ، وانتظر حتى يتبخر الكحول. قم بإزالة الأغطية من الأطباق والأغطية اللولبية من الزجاجات.
ضع كل طبق بدون الغطاء رأسا على عقب في الجزء السفلي من كل زجاجة طرد مركزي سعة 250 ملليلتر. أضف ببطء 32 ملليلتر من وسط النوى إلى كل زجاجة مما يسمح للوسط بدخول الطبق وملامسة الخلايا. قم بإزالة أي فقاعات من الأطباق باستخدام ماصة مراعي زجاجية طويلة ، مع تقويس الطرف في لهب بنسن.
أغلق كل زجاجة بغطاء المسمار ، وانقلها إلى جهاز الطرد المركزي. جهاز طرد مركزي لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 8،000 × G.Aspirate الوسط من الزجاجات والتخلص منه. قم بإزالة الأطباق عن طريق عكس الزجاجات على شاش معقم تم رشه مسبقا بالإيثانول بنسبة 70٪.
نظف السطح الخارجي للأطباق وأغطيتها بنسبة 70٪ من الإيثانول ، وأغلق الأطباق بعد تبخر الإيثانول. قبل المتابعة تحقق من تكوين cytoplast باستخدام المجهر المقلوب للخلايا الحية. ابحث عن الخلايا الليفية الممدودة للغاية بسبب بثق نواتها التي يسببها السيتوكالاسين.
لكل طبق 35 ملم إضافة 1،000،143 صف صفر خلايا. أعيد تعليقه في ملليلتر من وسط الثقافة مع استكمال 5٪ FBS. اترك الأطباق لمدة ثلاث ساعات في حاضنة ثاني أكسيد الكربون الرطبة لتسوية الخلايا الصفرية المكونة من 143 صفا على الأشباح.
بعد ثلاث ساعات من الحضانة ، قم بشفط الوسط والتخلص منه. اغسل خلايا الالتصاق مرتين بملليلتر من وسط الجلوكوز العالي DMEM بدون مصل أو MEM ، ثم قم بشفط الوسط والتخلص منه. أضف 500 ميكرولتر من محلول البولي إيثيلين جلايكول إلى الخلايا واحتضنها لمدة دقيقة واحدة بالضبط.
شفط والتخلص من محلول البولي إيثيلين جلايكول. اغسل الخلايا ثلاث مرات بملليلترين من الجلوكوز العالي DMEM بدون مصل أو مع MEM. أضف ملليلترين من وسط الاندماج ، واحتضن بين عشية وضحاها في الحاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون.
التربسين الخلايا في أطباق الثقافة المتبقية عدها وزرعها في واحد أو أكثر من أطباق بتري أضف 50 إلى 100 خلية لكل طبق في الثقافة المكملة حتى تظهر المستنسخات. ثم دعهم ينمون لعدة أيام. باستخدام مجهر ستيريو ، التقط الحيوانات المستنسخة من طبق بتري باستخدام أسطوانات استنساخ أو طرف ماصة.
حاول تجنب تجميع نسخ مختلفة ونقلها إلى طبق بئر 96 ، يحتوي كل بئر على 200 ميكرولتر من وسط الثقافة المكملة. تم توليد Cybrids بدءا من الخلايا الليفية المشتقة من مريض يحمل M2343A2G غير المتجانسة واحدة من أكثر طفرات الحمض النووي الميتوكوندريا شيوعا المرتبطة باعتلال عضلة الميتوكوندريا ، والحماض اللبني الدماغي ، والنوبات الشبيهة بالسكتة الدماغية. أظهر تحليل عدد متغير من التكرارات الترادفية أن الحمض النووي السيبراني مطابق للخلايا الصفرية التي تؤكد استبدال الحمض النووي السيبراني للمريض بجينوم 143 B.
يمكن استخدام تعدد الأشكال لطول الشظايا المقيدة ، أو تحليلات التسلسل ، لتقييم وجود طفرة الحمض النووي للميتوكوندريا والنسبة المئوية غير المتجانسة. عند محاولة هذا البروتوكول ، من المهم التحقق من الأصل الوراثي الصحيح للحمض النووي للنيوكليون والميتوكوندريا ، وكذلك كمية الحمض النووي للميتوكوندريا في السايبريدات المعاد توطينها.
