هذا الفيديو سوف توفر بروتوكولات مفصلة للتجارب شكل في المختبر لتحديد الهيكل الثانوي لتسلسل الحمض النووي الريبي من الفائدة في وجود الجيش الملكي النيبالي استهداف جزيء صغير. في شكل المختبر هو وسيلة فعالة من حيث التكلفة لفهم ديناميات كل النيوكليوتيد على عنصر الحمض النووي الأمينية الحجم الذي عادة ما يكون أقل من 200 النيوكليوتيدات. بعد إعداد قالب RNA كما هو موضح في المخطوطة، فإنّ التسمية الراديوية تعكس الاعتياءات باضافة جهاز غاما 32P ATP، معكوسة النص التمهيدي.
10XPNK العازلة التفاعل, كيناز متعدد النوكليوتيد والمياه RNA الحرة في أنبوب microcentuge 1.7 ملليلتر في حجم إجمالي قدره 20 ميكرولترات. ثم احتضان في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. ثم تقوم بتنشيط العينات لمدة 20 دقيقة منذ 65 درجة مئوية ثم تصفية العينات في عمود إزالة التشبع والطرد المركزي في 1000 مرة G.Add 25 ميكرولترات من 2XTBE عينة العازلة ومزيج.
خفض هذه المنتجات المسمى في هلام 10٪ الاكريلاميد وتأكد من تجنب نزيف النشاط الإشعاعي في الخزانات العليا. تشغيل الجل في 20 واط لمدة ساعة واحدة. بعد الركض، قم بإزالة اللوحات الزجاجية من الكاسيت الجل.
وضع الجل على قطعة من البلاستيك التفاف. أضعاف البلاستيك على الجزء العلوي من هلام لجعل شطيرة الهواء ضيق. ضع شطيرة هلام على شاشة الفوسفور الكالسيوم tungstate وفضح مع أداة تخيل.
صورة هلام مرة أخرى مع الضوء العادي لمعرفة أين حواف هلام هي. استخدم برنامج معالجة الصور لتراكب الصورتين وتراكب الصور الفاتحة والمظلمة. ثم جعل الصورة العليا معتمة قليلا من أجل رؤية كل من الصور في وقت واحد.
تأكد من أن الصورة المطبوعة بنفس حجم الجل الفعلي. ثم قم بمحاذاة الجل على الصورة المطبوعة. وأخيرا، استخدام شفرة حلاقة معقمة لقطع الانحناءات المطلوبة من هلام ووضع كل قطعة من هلام في أنبوب منفصل 1.7 ملليلتر microcentrifuge.
لاستعادة الحمض النووي من شريحة هلام عن طريق elution السلبي، إضافة 0.3 ملليلتر من مزيج هطول الأمطار elution إلى كل أنبوب 1.7 ملليلتر. احتضان الأنابيب في وعاء آمن بالإشعاع على دوار عند أربع درجات مئوية لمدة 16 ساعة. بعد الحضانة، نقل السائل إلى أنبوب جديد 1.7 ملليلتر.
إضافة 2.5x الجليد البارد 200 الايثانول واقية وعكس الأنابيب ست مرات لخلط السائل. احتضان الأنابيب في ناقص 80 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل. بعد الطرد المركزي في 10، 000g وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق، وإزالة فائقة بعناية عن طريق الأنابيب.
إضافة ملليلتر واحد من 80٪ الإيثانول لغسل بيليه. دوامة لمدة 15 ثانية والطرد المركزي مرة أخرى في ظل نفس الظروف. بعد إزالة المناط عن طريق الأنابيب، والهواء الجافة بيليه الحمض النووي لمدة خمس دقائق.
إضافة 50 ميكرولترات من المياه RNA مجانا واخلط عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا 10 مرات. تطبيع تركيز الحمض النووي إلى حوالي 100،000 العد في الدقيقة لكل ميكرولتر في عداد التلألؤ. لإعداد أربع عينات للتعديل الكيميائي، إضافة ثمانية picomoles من الجيش الملكي النيبالي في 32 ميكرولترات من 0.5 XTE العازلة إلى أنبوب microcentuge 1.7 ملليلتر.
سخني 80 درجة مئوية لمدة دقيقتين واتئم بالبرد على الجليد لمدة دقيقة واحدة على الأقل. ثم إضافة ثمانية ميكرولترات من 5x المزيج للطي، مزيج تخصيص تسعة ميكرولترات من هذا الخليط الحمض النووي الريبي في كل من أنابيب PCR الأربعة، وصفت من واحد إلى أربعة. إضافة ميكرولتر واحد من 10٪ DMSO في أنبوب ملحوظ كواحد، ميكرولتر واحد من محلول جزيء صغير مركزة في أنبوب اثنين، ميكرولتر واحد من محلول جزيء صغير مخفف في أنبوب ثلاثة وميكر واحد من الماء في أنبوب أربعة.
احتضان جميع أنابيب PCR في 37 درجة مئوية في دورة حرارية لمدة 30 دقيقة. مباشرة قبل اثنين من رئيس التفاعل تعديل OH، تمييع ميكرولتر واحد من اثنين من محلول الأسهم NAI المولار في ثلاثة microliters من المياه المعالجة DEPC لتحقيق حل العمل المول 0.5. على الفور إضافة ميكرولتر واحد من هذا الحل في أنابيب واحد واثنين وثلاثة.
إضافة ميكرولتر واحد من 25٪ DMSO في أنبوب أربعة واحتضان في دورة حرارية في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. إعداد أربعة أنابيب 1.7 ملليلتر microcentuge الطازجة وإضافة 100 ميكرولترات من مزيج هطول الأمطار elution واثنين من microliters من الجليكوجين إلى كل أنبوب. ثم في كل من هذه الأنابيب نقل كل السائل من أنابيب PCR المقابلة.
إضافة 0.34 ملليلتر من الجليد البارد 200 الايثانول واقية في كل أنبوب ومزيج من دوامة لمدة خمس ثوان. ضع الأنابيب في ثلاجة ناقص 80 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل. ثم الطرد المركزي الأنابيب لمدة 15 دقيقة في 14،000 مرات G في أربع درجات مئوية.
دون إزعاج بيليه RNA، وإزالة عظمى من كل أنبوب. إضافة 0.5 ملليلتر من 80٪ الإيثانول في أنبوب لغسل بيليه الحمض النووي الريبي ودوامة لمدة 15 ثانية. بعد الطرد المركزي في نفس الظروف مرة أخرى، وإزالة عظمى والهواء الجاف بيليه الجيش الملكي النيبالي لمدة خمس دقائق.
إضافة تسعة ميكرولترات من المياه والبيب رنا مجانا أن صعودا وهبوطا 10 مرات لخلط. نقل الحمض النووي الريبي المعدلة إلى أربعة أنابيب PCR جديدة وتسمية لهم واحد إلى أربعة كما في الخطوة السابقة. إضافة اثنين picomoles من الحمض النووي الريبي في سبعة ميكرولترات من المياه المعالجة DEPC إلى كل من أربعة أنابيب PCR إضافية وتسمية لهم مع أرقام من خمسة إلى ثمانية.
إضافة اثنين microliters من التمهيدي radiolabeled تعافى إلى كل من ثمانية أنابيب PCR ملحوظ واحد إلى ثمانية. بعد تسخين في 65 درجة مئوية لمدة خمس دقائق، على الفور يبرد إلى أربع درجات مئوية في دورة الحرارية. إضافة أربعة ميكرولترات من 5x RT العازلة، وميكر واحد من 0.1 داتولير واحد microliter من مزيج DNTP إلى كل من الأنابيب.
ثم إضافة اثنين من microliters من المياه المعالجة DEPC إلى أنابيب واحد إلى أربعة. إضافة أربعة microliters من خمسة ملليمولار ddATP إلى أنبوب خمسة, أربعة microliters من خمسة ملليمتر ddTTP إلى أنبوب ستة وأربعة ميكرولترات من خمسة الغمولار DdCTP إلى أنبوب سبعة وميكر واحد من خمسة ملليمتر ddGTP وثلاثة ميكرولترات من المياه المعالجة DEPC إلى أنبوب ثمانية وماصة أربع مرات لخلط. بعد تسخين جميع أنابيب PCR في 52 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة في دورة حرارية، إضافة ميكرولتر واحد من النسخ العكسي لكل أنبوب وأنابيبه صعودا وهبوطا أربع مرات لخلط.
احتضان ردود الفعل في 52 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة في دورة الحرارية. لhylyze الجيش الملكي النيبالي، إضافة ميكرولتر واحد من خمسة هيدروكسيد الصوديوم الضرس في كل من الأنابيب وتسخينها في 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. ثم إضافة خمسة ميكرولترات من حمض الهيدروكلوريك مولر واحد لتحييد التفاعل وتكرار هطول الأمطار الإيثانول كما هو موضح سابقا.
بعد تجفيف الهواء بيليه الحمض النووي لمدة خمس دقائق، إضافة 10 ميكرولترات من الماء و 10 ميكرولترات من 2xTBE عينة اليوريا تحميل العازلة في أنابيب 1.7 ملليلتر والأنابيب عنه صعودا وهبوطا 10 مرات إلى redissolve. سخني العينات على حرارة 70 درجة مئوية لمدة خمس دقائق، ثم ضع الأنابيب على الجليد، قبل تحميلها على الجل. تحميل 10 ميكرولترات من العينة التي تم وضعها على الجليد على 8٪ polyacrylamide التسلسل هلام.
تشغيل الجل في 65 واط لمدة ساعتين أو حتى صبغة أسفل تصل إلى 3/4ths من هلام. إزالة المسافة وإدراج بلطف ملعقة لإزالة لوحة الزجاج السيليكون العلوي. غطّي الجل بقطعة من ورق التصفية الكبير واضغط بلطف للسماح للجل بالتمسك بورق التصفية.
بدءا من نهاية أسفل، ورفع ورقة تصفية وإزالة هلام من لوحة زجاجية جنبا إلى جنب مع ورقة. بعد نقل الجل إلى ورق التغليف كما كان يحدث من قبل، جففه عند درجة 70 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة مع فراغ، مع التأكد من استخدام العديد من أوراق التصفية بين الجل والمجفف. نقل شطيرة هلام على كاسيت تخزين الفوسفور الصورة المبيضة وفضح النشاط الإشعاعي من هلام إلى الشاشة لمدة أربع إلى 16 ساعة.
وأخيرًا، ضع شاشة تخزين الفوسفور على جهاز تصوير وامسح ضوئيًا بدقة متوسطة لمدة 30 دقيقة تقريبًا. بعد تعريض هلام تسلسل البولي أكريلاميد إلى شاشة تخزين الفوسفور، وأظهرت تجربة شكل ناجحة منحنى واحد وأشد كثافة في الجزء العلوي من هلام والانحناءات في جميع أنحاء هلام في قرار النيوكليوتيد واحد دون مسحة. كما أظهر الجل أن شدة بعض الانحناءات تغيرت في وجود جزيئات صغيرة ، مما يشير إلى تغييرات في قوة الاقتران الأساسي.
مشكلة شائعة في تحليل الصفحة هي أن منطقة مسحة تعرف باسم جبهة الملح قد تظهر في منتصف الجل، ربما بسبب تركيز عال من الملح، DMSO أو غيرها من المواد غير المرغوب فيها في عينة التحميل. يمكن تجنب ذلك عن طريق إزالة المادة غير المرغوب فيها عن طريق هطول الإيثانول. يفضل قالب الحمض النووي الريبي المتجانس للشكل في المختبر.
نحن نستخدم الريبوسومات في كل من خمسة رئيس الوزراء وثلاثة نهايات رئيس للحصول على مثل هذا الحمض النووي الريبي. يمكن أيضاً أن يتم تنفيذ شكل الخلية للحصول على بنية ثانوية RNA في سياق الخلوي. تذكر, في شكل المختبر قد لا تتكخي في التفاعلات البروتين الربط الحمض النووي الريبي في الجسم الحي.
في شكل المختبر هو وسيلة قوية للكشف عن التغيرات في بنية الحمض النووي الريبي بسبب وجود جزيء صغير. ويتم ذلك عن طريق قياس التغيرات في قوة النقش من توقف النسخ العكسي. كن حذراً من أن جميع التجارب الموصوفة في هذا الفيديو يتم إجراؤها في مكان عمل مشع معتمد مع الحماية الشخصية المناسبة والتدريع الزجاجي.
