يعرض هذا البروتوكول دليلا خطوة بخطوة لقياس صلابة الهلاميات المائية والخلايا باستخدام nanoindenter المتاح تجاريا ويقدم أيضا برنامجا مفتوح المصدر لتحليل البيانات المكتسبة بشكل متكرر. يسمح لنا البروتوكول بالحصول على بيانات تشبه المجهر للقوة الذرية ، ومع ذلك ، في جزء بسيط من التعقيد. لذلك سيكون هذا البروتوكول مفيدا للعلماء المهتمين بدراسة الخواص الميكانيكية للعينات الصحية والمريضة ، لكننا نعتقد أيضا أنه سيكون قابلا للتطبيق على نطاق أوسع في سياق المسافة البادئة النانوية للمواد اللينة.
بعد تشغيل الأداة وتركيب المسبار المحدد للتجربة ، ابدأ في معايرة المسبار. انقر فوق تهيئة في نافذة البرنامج الرئيسية. في قائمة المعايرة التي تظهر، أدخل تفاصيل المسبار في مربعات الإدخال.
بعد ذلك ، املأ طبق بتري زجاجي سميك بقاع مسطح بنفس وسيط طبق العينة ، وقم بمطابقة درجة حرارة الوسط مع درجة حرارة العينة. ثم ضع طبق المعايرة تحت المسبار. للمعايرة في السائل ، قم بترطيب المسبار مسبقا بقطرة من 70٪ من الإيثانول أو الأيزوبروبانول مع نهاية الماصة في ملامسة خفيفة مع الطويق الزجاجي ، بحيث تنزلق القطرة فوق الطرف الكابولي والكروي.
بعد ذلك ، حرك ذراع nanoindenter يدويا لأسفل حتى يتم غمر المسبار بالكامل ولكن لا يزال بعيدا عن قاع طبق بتري. انتظر لمدة خمس دقائق للسماح بالوصول إلى ظروف التوازن في السائل. بعد ذلك ، في قائمة تهيئة البرنامج ، انقر فوق مسح الطول الموجي.
ستعرض شاشة مقياس التداخل شريط تقدم. تحقق مما إذا كان الفحص البصري ناجحا بالانتقال إلى لوحة مسح الطول الموجي في صندوق مقياس التداخل. ثم ، في قائمة التهيئة ، انقر فوق Find Surface لخفض المسبار تدريجيا.
يتوقف المسبار عن الحركة عندما يلامس طبق بتري الزجاجي. بمجرد ملامسة المسبار للسطح ، حرك المسبار لأسفل بمقدار ميكرومتر واحد باستخدام زر السهم المتجه لأسفل y في نافذة البرنامج الرئيسية. راقب الإشارة الخضراء في النافذة الحية للتغييرات في خط الأساس مع كل خطوة ميكرومتر واحد.
ثم انقر فوق معايرة من قائمة التهيئة. عند اكتمال المعايرة، تحقق من عوامل المعايرة القديمة والجديدة في النافذة المنبثقة المعروضة. إذا كان عامل المعايرة الجديد في النطاق الصحيح ، كما هو موضح في المخطوطة ، فانقر فوق استخدام عامل جديد.
بعد ذلك ، حرك بيزو بمقدار 500 ميكرومتر. بعد ذلك ، تحقق مما إذا كانت دائرة إزالة التشكيل قد تمت معايرتها بشكل صحيح بالانتقال إلى علامة التبويب Demodulation على سطح مكتب مقياس التداخل. اضغط برفق على الطاولة البصرية أو nanoindenter لإحداث ضوضاء كافية.
يجب أن تغطي الدائرة البيضاء من نقاط البيانات المنفصلة الدائرة الحمراء تقريبا. قم بتحميل طبق بتري الذي يحتوي على العينة على مرحلة المجهر ، وانقل مسبار nanoindenter يدويا إلى الموضع المطلوب فوق العينة. حرك المسبار في محلول ، مع الحرص على ترك ملليمتر إلى مليمترين بين المسبار وسطح العينة.
انتظر خمس دقائق حتى يتوازن المسبار في المحلول. ركز على المسبار باستخدام المجهر الضوئي. لقياس معامل يونغ للمواد اللينة، انقر فوق تكوين التجربة.
أضف خطوة Find Surface ومسافة بادئة واحدة في التحكم في الإزاحة لتحديد المعلمات التجريبية لاستخدامها لاحقا في فحص المصفوفة التلقائي. إذا نجحت المسافة البادئة الفردية ، فقم بتكوين فحص مصفوفة يحتوي على 50 إلى 100 نقطة متباعدة من 10 إلى 100 ميكرومتر. بعد التأكد من تحديد مربع البحث التلقائي عن السطح ، انقر فوق استخدام موضع المرحلة لبدء مسح المصفوفة من موضع المرحلة الحالي.
قم بإعداد ملف تعريف مسح المصفوفة في التحكم في الإزاحة. اترك عدد المقاطع إلى خمسة، واستخدم ملف تعريف الإزاحة الافتراضي. إذا لزم الأمر ، قم بتغيير ملف تعريف الإزاحة والوقت لكل مقطع مائل.
لا تتجاوز معدلات الإجهاد أكبر من 10 ميكرومتر في الثانية. احفظ التجربة التي تم تكوينها في مسار التجربة المطلوب. انقر فوق تشغيل التجربة ، وانتظر حتى تكتمل.
عند الحصول على جميع البيانات ، قم بتنظيف المسبار وإيقاف تشغيل الأداة كما هو موضح في النص. لفحص منحنيات إزاحة القوة وإنتاج مجموعة بيانات نظيفة بتنسيق JSON ، قم بإعداد الإطلاق. py من سطر الأوامر على كمبيوتر المختبر.
حدد تنسيق بيانات Optics11 من القائمة المنسدلة. إذا لم يتم تحميل البيانات بشكل صحيح ، فأعد تشغيل واجهة المستخدم الرسومية وحدد Optics11 Old. ثم ، انقر فوق تحميل مجلد ، وحدد مجلدا يحتوي على البيانات المراد تحليلها.
قم بتنظيف مجموعة البيانات باستخدام علامات التبويب الموجودة على يمين واجهة المستخدم الرسومية. ثم ، انقر فوق حفظ JSON ، وأدخل اسما مناسبا لمجموعة البيانات التي تم تنظيفها. أرسل ملف JSON إلى الكمبيوتر حيث تم تثبيت برنامج NanoAnalysis ، إذا كان مختلفا عن الكمبيوتر الحالي.
قم بتشغيل النانو. py من سطر الأوامر. في الجزء العلوي الأيسر من واجهة المستخدم الرسومية ، انقر فوق تحميل التجربة وحدد ملف JSON.
سيؤدي هذا إلى ملء قائمة الملفات والرسم البياني للمنحنيات الأولية الذي يوضح مجموعة البيانات من حيث منحنيات إزاحة القوة. في مربع الإحصائيات ، تحقق من قيم المعلمات الثلاثة ، N مفعل ، N فشل ، و N مستبعد. لتصور منحنى معين بمزيد من التفصيل ، انقر فوق المنحنى.
سيؤدي ذلك إلى تمييزه باللون الأخضر وإظهاره على الرسم البياني للمنحنى الحالي. بمجرد تحديد منحنى واحد ، سيتم ملء معلمات R و k في مربع الإحصائيات. بمجرد تنظيف مجموعة البيانات بشكل أكبر، قم بتصفية أي ضوضاء في المنحنيات باستخدام المرشحات المنفذة في مربع التصفية.
بعد ذلك ، افحص المنحنيات التي تمت تصفيتها في الرسم البياني للمنحنى الحالي. المنحنى المصفى باللون الأسود ، في حين أن الإصدار غير المصفى أخضر. للعثور على نقطة الاتصال، من المربع نقطة الاتصال، اختر واحدا من سلسلة من الإجراءات الرقمية التي تم تنفيذها في البرنامج.
اضبط معلمات الخوارزمية لتناسب مجموعة البيانات بحيث يتم تحديد نقطة الاتصال بشكل صحيح ، كما هو موضح في المخطوطة. لعرض مكان العثور على نقطة الاتصال على منحنى واحد ، حدد المنحنى بالنقر فوقه. ثم انقر فوق فحص.
تحقق من النافذة المنبثقة التي تظهر لتحديد مكان وجود نقطة الاتصال. بعد ذلك ، انقر فوق تحليل هرتز. سيؤدي هذا إلى إنشاء ثلاثة رسوم بيانية.
تحقق من بيانات المسافة البادئة لكل منحنى في مجموعة البيانات ، جنبا إلى جنب مع متوسط تناسب هرتز الموضح باللون الأحمر. بعد ذلك ، تحقق من منحنى المسافة البادئة لمتوسط القوة باستخدام نطاق خطأ يظهر انحرافا معياريا واحدا ، جنبا إلى جنب مع متوسط ملاءمة هرتز الموضح باللون الأحمر. بعد ذلك ، تحقق من مخطط التشتت لمعامل يونغ الناشئ عن تركيب نموذج هيرتز لكل منحنى فردي.
افحص مربع النتائج بحثا عن معامل المتوسط المحسوب ليونغ وانحرافه المعياري ، وتأكد من أنها معقولة للتجربة المحددة. ثم ، في مربع حفظ ، انقر فوق هرتز. في النافذة المنبثقة ، أدخل اسم الملف والدليل ، وانقر فوق حفظ.
سيتم إنشاء ملف tsv. افتح ملف tsv في أي برنامج إضافي للتحليل الإحصائي والمزيد من التخطيط. للحصول على بيانات المسافة البادئة النانوية للخلية ، انقر فوق تحليل أطياف المرونة.
افحص المخططين المنتجين ، وهما معامل يونغ كدالة لعمق المسافة البادئة لكل منحنى ومعامل يونغ المتوسط كدالة للمسافة البادئة التي تم تركيبها بواسطة نموذج ثنائي الطبقة. بمجرد الانتهاء من التحليل ، انقر فوق ES في مربع حفظ. سيؤدي هذا إلى تصدير ملف tsv في الدليل المحدد ، والذي يمكن فتحه ورسمه في أي برنامج آخر من اختيارك.
ينتج عن التجربة الناجحة جزء الاقتراب من منحنى إزاحة القوة ، مع وجود خط أساس واضح ومسطح ومنطقة انتقالية ومنطقة مائلة. تتم إزالة المنحنيات التي تظهر التعديلات من هذا الشكل بسهولة من مجموعة البيانات باستخدام NanoPrepare. يتم هنا عرض منحنيات المسافة البادئة للقوة مع متوسط نموذج هرتز لهيدروجيل بولي أكريلاميد ناعم وهيدروجيل صلب.
من خلال رسم القيم الفردية لمعامل يونغ ، تم استرداد متوسط معامل يونغ المتوقع لكلا الهلاميات المائية. بالنسبة لتجارب المسافة البادئة النانوية للخلايا، يوضح متوسط منحنى المسافة البادئة للقوة ونموذج هيرتز المتوسط المقابل أن نموذج هيرتز لا يلتقط بشكل كامل تطور القوة مع زيادة عمق المسافة البادئة لتجارب المسافة البادئة النانوية للخلية. يتم عرض متوسط أطياف المرونة المجهزة حتى مسافة بادئة تبلغ 200 نانومتر هنا.
يبدأ متوسط أطياف المرونة في الزيادة عند عمق مسافة بادئة يبلغ 200 نانومتر ، مما يشير إلى مساهمة الركيزة في معامل يونغ الظاهر الذي تم فحصه. لهذا السبب ، تم اختيار 200 نانومتر كنطاق مناسب لكل من نموذج Hertz و Bilayer. يسمح تركيب نموذج الطبقة الثنائية للمستخلص بمزيد من المعلومات حول الحالة الميكانيكية للخلية ، بما في ذلك سمك قشرة الأكتين الخلوي ، ومعامل قشرة الأكتين الخلوي ، ومعامل كتلة الخلية ، كما هو موضح في النص الرئيسي.
تكشف المقارنة المباشرة بين نموذج هيرتز ونهج أطياف المرونة من حيث توزيع معامل يونغ عن توزيعات متداخلة بوسائل مماثلة ، مما يدل على جدوى نهج أطياف المرونة. يعد تحديد نقطة الاتصال بدقة والحفاظ على اتساق معلمات الخوارزمية المختارة بين مجموعات البيانات التي يريد المرء مقارنتها أمرا بالغ الأهمية للحصول على مقارنات موثوقة بين العينات. هذه الطريقة قابلة للتطبيق بشكل عام لتحديد الخصائص المرنة المحلية للعينات البيولوجية ، بما في ذلك الأجسام الكروية والعضوية والأنسجة وبشكل عام جميع المواد اللينة.
