تم تطوير هذا البروتوكول لتوفير طريقة قوية لقياس إجمالي أكسدة بيتا للميتوكوندريا والأحماض الدهنية البيروكسيزومية في خلايا الكبد الأولية للفئران. يحافظ استخدام الخلايا السليمة على سلامة العضيات والآليات التنظيمية المعمول بها. بالإضافة إلى ذلك ، فإن فحص خلايا الكبد المعزولة حديثا يقلل من التغيرات في التعبير الجيني فيما يتعلق بكبد المنشأ.
يمكن أن تكون الجراحة صعبة. عليك أن تكون واثقا ومجتهدا ومركزا. بمجرد نجاح القنية ، حاول الاسترخاء ، ولكن انتبه وراقب جودة التروية.
لبدء الإجراء ، قم برش بطن وصدر الفأر المخدر بحرية باستخدام 70٪ من الإيثانول. ثم استخدم الملقط لسحب الجلد وجدار البطن بالقرب من قاعدة البطن وقطعه أفقيا على جانبي خط الوسط وحتى الحجاب الحاجز لفضح الأعضاء. كشف الوريد الأجوف السفلي ، أو IVC ، عن طريق تحريك الأمعاء إلى الجانب الأيمن وقلب فصوص الكبد بلطف لأعلى.
أدخل جسما أسطوانيا صغيرا ، مثل غطاء إبرة ، تحت الجزء الخلفي من الماوس لإمالة IVC قليلا وتسهيل التعليب. بعد بدء تشغيل المضخة باستخدام المخزن المؤقت بأقل سرعة ، أدخل الإبرة في IVC. ثم قطع الوريد البابي لتخفيف الضغط والسماح بتصريف الدم والمخازن المؤقتة للتروية.
قبل زيادة معدل التدفق إلى سبعة مل في الدقيقة. قم بدمج الكبد بمخزن مؤقت دافئ وتأكد من أن الخط الذي يتم إدخاله في الأنبوب الذي يحتوي على المخزن المؤقت الأول يظل مغمورا باستمرار لتجنب إدخال فقاعات الهواء. أثناء حدوث التروية ، أضف 130 ميكرولتر من محلول الكولاجيناز لتخزين اثنين مؤقتا ، واخلطه عن طريق السحب باستخدام ماصة مصلية.
عندما ينخفض الحجم في الأنبوب الذي يحتوي على المخزن المؤقت واحد إلى حوالي خمسة مل ، أضف ببطء خمسة مل من المخزن المؤقت اثنين إلى التخزين المؤقت واحد عن طريق السحب على جانب الأنبوب. كرر الإضافة مرتين قبل إضافة المخزن المؤقت المتبقي إلى الأنبوب. أوقف التروية عند ترك حوالي 5 إلى 10 مل من المخزن المؤقت اثنين في الأنبوب.
ثم قم باستئصال الكبد ونقله إلى طبق زراعة 100 مل الذي يحتوي على 20 مل من المخزن المؤقت للثلج والبارد اثنين. تحت غطاء التدفق الرقائقي، قم بتكسير أنسجة الكبد بلطف باستخدام المقص الجراحي والملقط. بعد ذلك ، أضف حوالي 20 مل من المخزن المؤقت M199 البارد إلى تعليق خلايا الكبد وقم بتصفيته من خلال مصفاة خلايا 100 ميكرون باستخدام مكبس حقنة لتعزيز إطلاق خلايا كبدية إضافية بلطف من قطع الكبد الأكبر.
اغسل طبق زراعة 100 مل ومصفاة الخلية باستخدام المخزن المؤقت M199 لجمع تعليق الخلية حتى يمتلئ أنبوب التجميع. ثم الطرد المركزي للتعليق عند 50 × g لمدة دقيقتين عند أربع درجات مئوية. قم بشفط المادة الفائقة قبل إعادة تعليق بيليه خلايا الكبد في 30 مل من M199 البارد عن طريق الدوام .
كرر الغسيل مرة واحدة. قم بإذابة حمض البالمتيك وألبومين مصل البقر ، أو BSA ، قبل تحضير خليط الركيزة لتفاعلات متعددة. Aliquot 13.5 ميكرولتر من محلول BSA لكل تفاعل في أنبوب الطرد المركزي الدقيق.
بعد تسخين الأنبوب إلى 41 درجة مئوية ، أضف ميكرولتر واحد من محلول حمض البالمتيك 200 mM لكل تفاعل. دوامة الأنبوب بقوة قبل وأثناء الحضانة عند 41 درجة مئوية لمدة 20 إلى 30 دقيقة لتسهيل تكوين مركب حمض البالمتيك BSA القابل للذوبان. خلال هذا الوقت ، أليكوت 133 ميكرولتر من 1 م من حمض البيركلوريك الذي سيتم استخدامه لوقف التفاعلات في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المنفصلة 1.5 مل.
قبل البدء في التفاعلات ، قم باحتضان 485.5 ميكرولتر من المخزن المؤقت M199 لكل تفاعل في أنبوب عند 37 درجة مئوية لتخفيف مركب حمض البالمتيك BSA-Palmitic المشع المحضر. بعد ذلك ، قم بتوزيع 750 ميكرولتر من M199 مع أو بدون مثبطات في الأنابيب السفلية المستديرة المنفصلة سعة 14 مل كعينات. أثناء خطوات غسل خلايا الكبد ، قبل 10 إلى 15 دقيقة من بدء التفاعلات ، انقل الأنابيب إلى حمام مائي مهتز مضبوط على 37 درجة مئوية عند 180 إلى 200 دورة في الدقيقة.
إذا كانت صلاحية خلايا الكبد 75٪ على الأقل ، أكمل إعداد مزيج الركيزة عن طريق نقل 0.8 ميكرولتر من حمض البالمتيك الكربون-14 لكل تفاعل إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق الذي يحتوي على محلول حمض البالمتيك BSA-Palmitic الموضح. دوامة قبل إعادة الأنبوب إلى الحمام المائي عند 41 درجة مئوية. مباشرة بعد إعادة التعليق النهائي لخلايا الكبد ، قم بنقل 750 ميكرولتر من تعليق خلايا الكبد إلى كل من الأنابيب السفلية المستديرة سعة 14 مل في الحمام المائي المهتز باستخدام ماصة واحدة مل ودوامة الأنابيب لفترة وجيزة بسرعة منخفضة قبل نقلها إلى حاضنة ، مما يذهل كل إضافة بمقدار 30 ثانية.
انقل أليكوت منفصل من خلايا الكبد إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل للدوران عند 3000 × جم لمدة خمس دقائق. قم بإزالة المادة الفائقة قبل تخزين الكريات عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لقياس إجمالي كمية البروتين في العينة لتطبيع النتائج. في حين أن خلايا الكبد تحت الحضانة قبل 37 درجة مئوية ، أضف مركب حمض البالمتيك BSA-Palmitic المشع إلى الوسط الدافئ للحفاظ عليه عند 37 درجة مئوية حتى يصبح جاهزا لبدء التفاعلات.
لبدء التفاعلات ، قم بإزالة خلايا الكبد من الحمام المائي وإضافة 500 ميكرولتر من مزيج الركيزة إلى خلايا الكبد. دوامة الخلايا بسرعة منخفضة لمدة خمس ثوان قبل العودة إلى الحمام المائي لاحتضانها لمدة 15 دقيقة. ابدأ مجموعة من التفاعلات وتوقف فورا لتحديد النشاط الإشعاعي في الخلفية.
انقل وخصص الأليكوتات المكررة من 200 إلى 250 ميكرولتر من مزيج الركيزة المتبقية في قوارير تلألؤ 6 مل لإجراء العد. لوقف التفاعلات ، قم بإزالة خلايا الكبد من الحمام المائي لإعادة تعليقها عن طريق الدوامة بسرعة معتدلة ثم نقل 400 ميكرولتر من تعليق خلايا الكبد إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة التي تحتوي على حمض البيركلوريك. قم بتغطية الأنابيب ودوامتها على الفور قبل تكرار التسلسل لجميع العينات ، مما يؤدي إلى التذبذب لمدة 30 ثانية.
بعد الدوران أسفل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل عند 13،000 × غرام لمدة 10 دقائق ، انقل 300 ميكرولتر من السوبرنات إلى قارورة تلألؤ 6 مل وأضف 4 مل من سائل التلألؤ لحساب النشاط الإشعاعي في العينات ومزيج الركيزة aliquots في عداد اللمعان. في الدراسة ، أنتجت تروية الكبد 30 إلى 40 مليون خلية لكل كبد ، بمتوسط صلاحية 80٪ لوحظ أيضا أن خفض تركيز الجلوكوز في مجموعة الصيام لم يكن له أي تأثير سلبي على غلة أو بقاء خلايا الكبد. تم فحص تعليق خلايا الكبد ، المعزولة عن الفئران الذكور التي تم تغذيتها وصيامها ، لقدرة أكسدة بيتا للأحماض الدهنية في وجود وغياب الإيتوموكسير ، وهو مثبط قوي ل CPT1 وأكسدة الأحماض الدهنية الميتوكوندريا.
تختلف الأعداد في الدقيقة ، أو CPM ، المرتبطة بالنشاط الإشعاعي في الخلفية مع دفعة حمض البالمتيك. ومع ذلك ، كان CPM لا يزال أقل بكثير من العينات المحتضنة مع مزيج الركيزة. تظهر خلايا الكبد المعزولة من الفئران الصائمة زيادة قوية في معدلات أكسدة بيتا للأحماض الدهنية الميتوكوندريا والبيروكسيزوما.
تمت دراسة البيانات بشكل أكبر لتحديد معدل أكسدة حمض البالمتيك في خلايا الكبد المعزولة من الفئران التي تتغذى وتصوم. منع الفقاعات من دخول الخط. حافظ على ثبات الإبرة أثناء التروية.
كن لطيفا عند التعامل مع خلايا الكبد. احتفظ بها معلقة عند توزيعها. يمكن استخدام خلايا الكبد المعزولة من هذا الإجراء كتعليق لفحص المسارات الأيضية الأخرى ، مثل تخليق الأحماض الدهنية ، أو يمكن طلاؤها لتجارب زراعة الخلايا.
