هذا هو بروتوكول لعزل الخلايا الجذعية الأولية عضلة الماوس لدراسة الأيض السابقين فيفو. يوفر هذا البروتوكول عددًا أكبر بكثير من الخلايا الجذعية مقارنة بالبروتوكولات الأخرى التي جربناها في الماضي. والأهم من ذلك، بمجرد أن نفرق هذه الخلايا الجذعية إلى ميوتوب، فإنها تظهر علم وظائف الأعضاء الطبيعي، لذلك أشياء مثل الإيقاعات الإيقاعية.
عند محاولة هذا الإجراء للمرة الأولى، أخذ ملاحظات مفصلة وحفظ عدة صور لأن كل explant الأنسجة تبدو مختلفة، وسوف يكون هناك اختلاف في الخروج من myoblasts. بدون مظاهرة مرئية، من الصعب معرفة ما إذا كنت تقوم بعزل الخلايا الصحيحة. لقد استفدنا من المساعدة السخية من الآخرين الذين أظهروا لنا هذه الطريقة عندما أنشأناها في مختبرنا.
بعد تحضير الطبق للتشريح وفقاً للمخطوطة، أعد غرفة رطبة بوضع ورقين إلى ثلاث أوراق سميكة من الماصات في كيس بلاستيكي واستخدام ماصة لتبلل سطح الورقة بالماء المعقم. ضع الغرفة تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة خمس دقائق لتعقيم. تشريح العضلات المطلوبة من ماوس يبلغ من العمر أربعة إلى ثمانية أسابيع وشطف بلطف في برنامج تلفزيوني يحتوي على 40 ميكروغرام لكل ملليلتر gentamycin لتعقيم.
استخدام ملقط العقيمة لنقل العضلات إلى طبق معقمة 10 سم غير المغلفة Petri. إضافة 0.5 إلى ملليلتر واحد من وسائل الاعلام الطلاء على العضلات بحيث الأنسجة رطبة ولكن ليس عائمة. استخدام مشرط عقيمة أو شفرة حلاقة لشريحة بلطف العضلات إلى أجزاء صغيرة.
استخدام ملقط أو ماصة لنقل شظايا العضلات على سطح لوحة ستة سنتيمترات المغلفة مسبقا. تراكب بلطف جدا إضافية 0.8 ملليلتر من وسائل الاعلام الطلاء على الأنسجة. ضع طبق الستة سنتيمترات الذي يحتوي على شظايا العضلات داخل الغرفة الرطبة وإعادته إلى حاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 48 ساعة.
إعداد وسائل الإعلام myoblast قبل ال وجميعه، التربسين وPBS-gentamycin في حمام مائي في 37 درجة مئوية. لمعطف قارورة T25 لكل مجموعة العضلات، إضافة ملليلترين من حل طلاء لسطح القارورة، يهز بلطف لخلق معطف حتى على السطح، واحتضان قارورة في أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة. الآن مع ماصة، وإزالة وسائل الاعلام الطلاء من explants العضلات وشطف بلطف explants العضلات مع ملليلتر اثنين من برنامج تلفزيوني-gentamycin.
إزالة بسرعة برنامج تلفزيوني وعدم السماح لوحة الجلوس في برنامج تلفزيوني. ثم يضاف بلطف ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني-gentamycin ووضع لوحة في الحاضنة درجة 37 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة. استخدام ماصة P1000 لجمع برنامج تلفزيوني مع الخلايا في أنبوب جهاز طرد مركزي 15 ملليلتر.
بعد ذلك، أضف ملليلتر واحد من التربسين إلى الطبق واعيده إلى حاضنة درجة 37 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق. اضغط بلطف على اللوحات لطرد القوالب. جمع التربسين مع الخلايا والجمع مع جمع برنامج تلفزيوني.
إضافة ثمانية ملليلتر من وسائل الاعلام myoblast إلى أنبوب الطرد المركزي وعكس بلطف لخلط. تراكب بلطف مليلترين من محلول الطلاء على لوحات العضلات وإعادة اللوحات إلى حاضنة درجة مئوية 37. تدور أنابيب الطرد المركزي التي تحتوي على خلايا في جهاز طرد مركزي لمدة ثلاث دقائق في 200 مرة ز.
استلهمت من فوق ونبقي ما يقرب من ملليلتر في الأنبوب. إضافة وسائط myoblast بلطف، ونقل الخلايا إلى قارورة المغلفة مسبقا ووضع القارورة في حاضنة درجة مئوية 37. استلهم وسائل الإعلام من قارورة P0 myoblast T25.
شطف الخلايا لفترة وجيزة مع ملليلترين من برنامج تلفزيوني دافئ-gentamycin ثم pirate برنامج تلفزيوني من القارورة. الماصات ملليلتر اثنين من PBS الدافئة في كل قارورة تحتوي على myoblasts. ضع القارورة مع برنامج تلفزيوني في حاضنة درجة مئوية 37 لمدة ثلاث دقائق.
ثم اضغط بقوة على جانب القارورة لطرد الخلايا. تحقق تحت مجهر خفيف لتعويم myoblasts بحرية. ضع القارورة تستقيم في غطاء لثقافة الأنسجة وشطف الجزء السفلي من القارورة مع 10 ملليلترات من وسائل الإعلام myoblast مرتين إلى ثلاث مرات لضمان طرد جميع الخلايا.
جمع خليط وسائط الخلية في أنبوب جهاز طرد مركزي 15 ملليلتر. جهاز طرد مركزي لمدة ثلاث دقائق في 200 مرة ز. التعرق وسائل الإعلام على ترك حوالي ملليلتر واحد في أنبوب يجري الحرص على تجنب بيليه الخلية.
أضف بلطف حجمًا مناسبًا من وسائط myoblast إلى أنبوب الطرد المركزي واخلط بلطف. توزيع خليط الخلية على قارورة T75 جديدة ستة ملليلتر لكل من. أضف 10 ملليلترات من وسائط myoblast إلى كل قارورة T75 جديدة.
هز القارورة أفقياً بلطف لتوزيع الخلايا ووضعها في الحاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في هذا البروتوكول، تم رصد الخلايا الأولية من explants تحت مجهر ضوء قياسي. وبدا الحصاد المبكر من myoblasts كما جولة صغيرة والمجالات مشرق.
استغرق التمايز من myoblasts أربعة إلى ستة أيام خلالها مورفولوجيا الخلايا تغيرت من مجالات جولة واحدة إلى ألياف طويلة طويلة متعددة نوات. تم إنتاج شتّى ميوتوبات مختلفة تماماً والتي كانت جاهزة لقياس معدلات استهلاك الأكسجين. يمكن استخدام هذه الخلايا لعدد من التطبيقات المتلقين للمعلومات.
على سبيل المثال، نحن كثيرا ما تستخدم لهم لدراسة تدفق الركيزة في الصكوك Seahorse.
