طريقة عزل الفطريات entomopathogenic مهم لتطوير عوامل التحكم الميكروبية. يمكن استخدام هذا البروتوكول لعزل واختيار عزل الفطريات ذات الفوعة العالية من عينات التربة. وتشمل هذه التقنية ثلاثة محاور من فحص الإمراض ويجمع بين thermotolerance وconidia فحص الإنتاج لجعل ترتيب عدد كونيديا فعالة.
يمكن أن تساعد هذه الطريقة في اختيار الفوعة العالية والعزلات الفطرية الجديدة الواعدة للتسويق. هذا البروتوكول يركز على المكافحة البيولوجية ، ويمكن أيضا أن تستخدم لاكتشاف عزل الفطريات entomopathogenic لدراسة التفاعل بين الآفات والفطريات entomopathogenic. إثبات الإجراء سيكون ياو شيا ليو ونيان تونغ ني، طالب ماجستير من مختبري.
ابدأ بجمع عينة التربة عن طريق إزالة سنتيمتر واحد من التربة السطحية ثم جمع التربة ضمن عمق يتراوح بين خمسة و10 سنتيمترات من كل موقع لأخذ العينات باستخدام مجرفة. بعد تسجيل تفاصيل كل موقع أخذ العينات، وجمع والحفاظ على 100 غرام من عينة التربة في كيس من البلاستيك في درجة حرارة الغرفة لتنفيذ بروتوكول العزل الفطرية في غضون ثلاث ساعات. لعزل الفطريات المسببة للفطريات المسببة للفطريات المحتملة ، أو EPF ، أضف 100 جرام من عينة التربة في كوب بلاستيكي ووضع خمس ديدان موليتور Tenebrio على سطح التربة في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة أسبوعين مع مراقبة وتسجيل وفيات اليرقات والإصابة بالفطر العضلي يوميا.
احتفظ باليرقة الميتة في الكأس حتى أسبوعين للعزل الفطري. بعد أسبوعين ، نقل الحشرات الميتة إلى مقعد نظيف واستخدام مسواك معقمة لجمع كونيديا. للحصول على الثقافة الأولية للفطريات ، قم بإزالة كونيديا التي تم جمعها على متوسط Sabouraud dextrose agar ربع قوة أو SDA في لوحة 55 ملليمترا لاحتضانها عند 25 درجة مئوية لمدة سبعة أيام.
في اليوم الثامن، إعادة صياغة كل الفطريات الثقافة الأولية على لوحة واحدة SDA ربع قوة 55 ملليمتر في غطاء محرك السيارة تدفق صفح قبل احتضان الثقافة في 25 درجة مئوية لمدة سبعة أيام للحصول على مستعمرات واحدة من الفطريات. في أول فحص للأمراض ، ضع خمس يرقات Tenebrio موليتور مباشرة على سطح كل لوحة ثقافة فطرية نقية عند 25 درجة مئوية. بعد مراقبة وتسجيل الإصابة بالفطرة والوفيات لمدة 10 أيام ، حدد العزلات الفطرية لمزيد من التحليل.
لإجراء اختبار الفوعة الثاني ، احصد كونيديا كل عزل فطري عن طريق الدوامة لمدة دقيقة واحدة واحصاء عدد كونيديا باستخدام مقياس الدم. عند الانتهاء، قم بتعديل تعليق كونيديا إلى تركيز واحد × 10 إلى 1/7 كونيديا لكل ملليلتر في محلول 0.03٪ من السطحي قبل نشر 10 ميكرولترات من التعليق الفطري على لوحة SDA بقوة ربع 55 ملليمترا للنمو لمدة سبعة أيام عند 25 درجة مئوية في الظلام. في اليوم الثامن ، ضع خمس يرقات Tenebrio molitor مباشرة على سطح كل لوحة ثقافة فطرية نقية وختم اللوحات مع فيلم Parafilm لاحتضانها أثناء مراقبة الإصابة بالفطرة والوفيات كما هو موضح من قبل.
بعد تكرار اختبار الفوعة الثاني في ثلاثية لكل عزل فطري ، حدد العزلات لإجراء اختبار الفوعة الثالث للآفات المستهدفة مثل Spodoptera litura. جمع حوالي واحد ملليمتر مربع EPF من لوحة SDA لمدة سبعة أيام ربع قوة لاستخراج الحمض النووي الجينوم الفطرية باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي الجينوم الفطرية. بعد ذلك، تضخيم فاصل منسوخ داخلي فطري أو منطقة ITS بواسطة PCR لعينة الحمض النووي بعد برنامج PCR الموصوف في المخطوطة النصية.
بعد تسلسل المنتج تضخيم PCR عن طريق خدمة التسلسل التجاري، واستخدام الانفجار NCBI للبحث عن الفطريات مماثلة في قاعدة بيانات NCBI واختيار الأنواع الفطرية النسبية للتحليل النباتي. قم بمحاذاة التسلسلات المتعددة وتقليم منطقة التسلسل المحفوظة يدويا مع GeneDoc. إجراء التحليل النباتي على أساس التطور الأدنى، والانضمام الجار، وأساليب احتمال أقصى.
لدراسة مورفولوجيا الفطريات ، التقط نمو مستعمرة الثقافة الفطرية لمدة سبعة أيام باستخدام كاميرا وسجل النمو والشكل: رقيق أو ثابت ولون المستعمرات. لمراقبة كونيديا في conidiophores، كشط كونيديا من مستعمرة الفطرية الثقافة النقية مع حلقة التطعيم ونقل الجراثيم إلى شريحة زجاجية تحتوي على 0.1٪ توين 80 الحل. استخدام مشرط لقطع كتلة أجار من مستعمرة فطرية ومن ثم نقل كتلة أجار إلى شريحة زجاجية وإضافة 0.1٪ توين 80 الحل لغسل معظم كونيديا الزائدة على أجار.
بعد ذلك ، قم بتغطية الشريحة بزلة غطاء للمراقبة المجهرية الخفيفة للكونيديا. قياس وتسجيل عرض وطول كونيديا وconidiophores لمقارنة الفرق بين عزل الفطرية المختلفة. ترتيب مقايسة الإنتاج مرتبة عن طريق زراعة عزل الفطرية المختارة على متوسط SDA ربع قوة في حوالي 25 درجة مئوية في الظلام لمدة 10 أيام.
ثم إعداد تعليق واحد ملليلتر conidial من عزل الفطرية في محلول السطحي 0.03٪تليها ضبط التركيز إلى مرة واحدة 10 إلى 1/7 كونيديا لكل ملليلتر كما هو موضح من قبل. بعد إضافة ثلاث قطرات من 10 ميكرولتر من التعليق المخروطي على لوحة SDA ربع قوة ، واحتضان الثقافة في 25 درجة مئوية في الظلام لمدة سبعة و 10 و 14 يوما لحساب sporulation من الفطريات. في كل نقطة زمنية، فصل كتلة أجار خمسة ملليمترات من وسط المستعمرة مع بورر الفلين ونقل الكتلة إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق 1.5 ملليلتر تحتوي على ملليلتر واحد من محلول سطح الماء 0.03٪.
بعد تدوير الأنبوب بمعدل 3000 دوران في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة، استخدم مقياس الدم لحساب عدد الكونيديا. لتقييس الحرارة، والثقافة عزل الفطرية المختارة وإعداد مرة واحدة 10 إلى تعليق 1/7 كونيديا لكل ملليلتر كما هو موضح سابقا. بعد الدوامة، سخني التعليق المخروطي في حمام جاف عند درجة حرارة 45 درجة مئوية لفواصل زمنية مختلفة.
بعد التعرض للحرارة، أضف ثلاث قطرات من خمسة ميكرولترات من التعليق المخروطي على لوحة SDA بقوة ربع 55 ملليمتر في كل نقطة زمنية ثم احتضان الصفائح عند حوالي 25 درجة مئوية لمدة 18 ساعة. لتحديد معدل الإنبات، عد عدد جراثيم كونيديا المنبتة مع خمسة حقول مختارة عشوائيا تحت المجهر الخفيف في التكبير 200 مرة. احسب العدد الإجمالي الفعال للكونيديا أو ECN باستخدام الصيغة، ثم احسب تحليل المكون الأساسي أو PCA للسلالات الفطرية كما هو موضح في المخطوطة.
حدد أفضل السلالات الفطرية أداء على أساس ECN أو PCA لإجراء اختبار الفوعة للآفات المستهدفة. في اختبار الفوعة الثاني ، تم تقييم ضراوة 26 عزلة فطرية ضد ديدان وجبة Tenebrio molitor. تم اختيار 12 عزل الفطرية مع الإمراض عالية لاختبار الفوعة ضد Spodoptera ليتورا.
لفهم أفضل للمواقف التصنيفية الفطرية ، تم إخضاع 26 عزلة من أول فحص للأمراض للتحليل الجزيئي استنادا إلى منطقة ITS. من خلال طريقة التنظيف من الملاحظات المورفولوجية الفطريات، يمكن رؤية هياكل conidiophores بوضوح مع 0.1٪ توين 80 الحل. تمت دراسة لون كونيديا وشكلها وترتيبها من خلال الملاحظات المجهرية لمستعمرة كونيديا.
تجمع ECN بين إنتاج كونيديا وبيانات طلول الحرارة لكل EPF. لوحظت الجدوى العالية لسلالة فطرية عندما كانت قيمة ECN عالية. كما تم الكشف عن تنسيق كبير بين الهيئة والهيئة، مما يشير إلى إمكانية استخدام ال ECN لتقييم التسلسل الهرمي للمعلمات المتعلقة بمقومات البقاء.
فحص الإمراض استخراج الحمض النووي الفطرية وزراعة عزل الفطرية مهمة في هذا الإجراء. باستخدام صيغة حساب ECN ، يمكن اختيار الفطريات المسببة للأمراض الداخلية المثالية. مزيج من أنواع الحشرات المختلفة ، مثل عثة الشمع الأكبر ودودة الوجبات معا لاصطياد الفطريات المسببة للأمراض الفطرية من عينات التربة قد يزيد من تنوع الفطريات المسببة للأمراض.
تنوع الكائنات الحية الدقيقة من التربة هو موضوع مثير جدا للاهتمام خلال عملية هذا البروتوكول. ويمكن أيضا مواصلة التحقيق فيه في المستقبل عن طريق هذا البروتوكول.
