يمكن استخدام هذا البروتوكول لدراسة الحركات المختلفة في الحشرات ، ووظائف بروتينات الحشرات ، والتفاعلات بين الفيروس والحشرة الناقلة في الجسم الحي. هذه الطريقة فعالة وغنية بالمعلومات. يتم تصور هياكل أمعاء الحشرات والخلايا المساعدة بوضوح عند عرضها باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر للمسح بالليزر.
سيكون إظهار الإجراء لو تشانغ ، دكتوراه من مختبرنا. للبدء ، انقل الحشرات غير الخبيثة من الأكواب الزجاجية إلى فيروس قزم أسود مخطط للأرز الجنوبي الطازج ، SRBSDV ، نباتات الأرز المصابة المغطاة بشبكة مقاومة للحشرات لفترة الوصول إلى اكتساب الفيروس لمدة يومين. ثم جمع الحشرات في أكواب زجاجية تحتوي على شتلات الأرز الطازجة.
بعد يومين ، اجمع الحشرات من الأكواب الزجاجية باستخدام شفاط يدوي لتشريح واستئصال الأمعاء. قم بإعداد 0.01 مولار PBS و 4٪ بارافورمالدهايد و 2٪ Triton X-100 كما هو موضح في مخطوطة النص. استخدم جهاز سحب لوضع 100 ميكرولتر من PBS على شريحة زجاجية ووضع الشريحة على مسرح المجهر الضوئي.
استخدم الشافطة اليدوية لجمع البالغين المصابين ب SRBSDV من الكئوس الزجاجية ووضعها في أنبوب سعة 1.5 ملليلتر على الثلج لشل الحشرات. نقل شخص بالغ مشلول إلى 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني على الشريحة مع البطن لأعلى. استخدم الملقط لتثبيت الجسم وإزالة الرأس بمجموعة أخرى من الملقط.
باستخدام مجموعة واحدة من الملقط ، قم بتثبيت جانبي البطن وتثبيت ovipositor أو العضو التناسلي للذيل مع المجموعة الأخرى ، ثم اسحب بعناية الغشاء البيني لجزء واحد من البطن لفضح الأمعاء ببطء في البطن. استمر في تمزيق الغشاء واسحب الأمعاء بالكامل تدريجيا من البطن. اسحب الذيل المتصل بنهاية القناة الهضمية برفق لإزالة القناة الهضمية بالكامل.
ضع الشجاعة المستأصلة في أنبوب طرد مركزي سعة 200 ميكرولتر. أضف 200 ميكرولتر من PBS إلى الأنبوب واستخدم ماصة لغسل الشجاعة جيدا. استخدم جهاز سحب لوضع 100 ميكرولتر من PBS على شريحة زجاجية ووضع الشريحة على مسرح المجهر الضوئي.
استخدم الشافطة اليدوية لجمع الحوريات المصابة ب SRBSDV من أكواب زجاجية ووضعها في أنبوب سعة 1.5 ملليلتر يوضع على الثلج لشل الحشرات. انقل حورية مشلولة إلى 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت على الشريحة مع توجيه البطن لأعلى. افصل ذيل الحورية ، ثم قم بتثبيت جسم الحشرة لإصلاحه برفق واستخدم الزوج الآخر لتثبيت الرأس.
اسحب الرأس برفق بعيدا عن الجسم مع الحفاظ على ارتباطه بالقناة الهضمية بحيث يتم فصل الرأس عن الجسم ، لكن القناة الهضمية لا تزال متصلة بالصدر والبطن. مع استمرار الملقط في تثبيت الجسم ، استخدم الزوج الآخر لتحريك الرأس بعناية وسحب القناة الهضمية تدريجيا. افصل القناة الهضمية عن الرأس للحصول على أمعاء سليمة دون الإضرار بالجسم.
ضع الأحشاء المستأصلة في أنبوب. أضف برنامج تلفزيوني إلى الأنبوب وامتصه برفق حرر المحلول باستخدام ماصة لغسل الأحشاء جيدا. تحضير الأجسام المضادة ووسط التركيب كما هو موضح في مخطوطة النص.
ضع أحشاء WBPH المستأصلة حديثا والمغسولة في 100 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهيد في أنبوب طرد مركزي سعة 200 ميكرولتر في درجة حرارة الغرفة. بعد ساعتين ، استبدل محلول بارافورمالدهايد ب 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. بعد 10 دقائق ، قم بإزالة PBS للتخلص من أي بارافورمالدهيد وكرر خطوة غسل PBS مرتين.
بعد غسلتين من PBS ، أضف 200 ميكرولتر من المنظفات غير الأيونية Triton X-100 لاختراق العينات في درجة حرارة الغرفة. بعد 30 دقيقة ، قم بإزالة Triton X-100 واغسل أي منظف متبقي بثلاث غسلات لمدة 10 دقائق باستخدام PBS. تمييع الأجسام المضادة المسمى واحد إلى 50 مع 50 ميكرولتر من ألبومين مصل الثور.
أضف الأجسام المضادة المخففة إلى الأنبوب واحتضن العينات طوال الليل عند أربع درجات سلزية. في صباح اليوم التالي لإزالة الجسم المضاد ، اغسل مخفف الجسم المضاد المتبقي بثلاث غسلات لمدة 10 دقائق باستخدام برنامج تلفزيوني. تمييع ميكرولتر واحد من DyLight 633-Phalloidin مع 50 ميكرولتر من PBS وإضافة 50 ميكرولتر من phalloidin المخفف إلى الأنبوب لمدة ساعتين الحضانة في درجة حرارة الغرفة.
بعد إزالة phalloidin ، اغسل القضيب المتبقي جيدا بثلاث غسلات لمدة 10 دقائق باستخدام PBS. ضع قطرة من وسيط التثبيت الذي يحتوي على DAPI على شريحة مجهر. انقل الأحشاء إلى الوسط وضع غطاء الزجاج برفق فوق العينة دون إنشاء فقاعات.
أظهرت الصورة المجهرية التمثيلية للمسح بالليزر للأحشاء WBPH المستأصلة من البالغين بعد وضع العلامات باستخدام phalloidin ثلاثة أقسام: الأمعاء الأمامية والأمعاء الوسطى والأمعاء الخلفية. من بين هؤلاء ، الأمعاء الوسطى هي موقع العدوى الأولي ل SRBSDV. تسهل بنية الخلية الظهارية أحادية الطبقة للأمعاء دراسة التوطين الخلوي لبروتينات الحشرات والتوطين المشترك للبروتينات الفيروسية والحشرية.
يتم عرض أحشاء WBPH المستأصلة مع DyLight 488 المسمى مضاد VAMP-7 و SRBSDV virions مع DyLight 549 المسمى بالجسم المضاد ل SRBSDV هنا. تبين أن فيروسات VAMP-7 و SRBSDV تتركز بشكل مشترك في السيتوبلازم مما يشير إلى أن VAMP-7 قد يلعب دورا في انتقال الفيروس في الجسم الحي. يجب تنظيف الأمعاء المتداخلة جيدا بعد الحضانة باستخدام الأجسام المضادة المترافقة لوسيفيرين لتقليل الخلفية والربط غير المحدد.
هذه طريقة موثوقة لعرض توطين الفيروس ومسببات الأمراض الأخرى وبروتينات الحشرات في الحشرات. يوفر الأساس لمزيد من الدراسات حول العلاقة بين مسببات الأمراض والحشرات.
