مسارات الإشارات التي تتحكم في الأنظمة متعددة الخلايا ديناميكية. لفهم وظيفة هذه الديناميكيات ، من الضروري أن تكون قادرا على تعديل هذه الديناميكيات بمهارة دون التأثير على نشاط الإشارات الإجمالي. يستخدم هذا البروتوكول نظام الموائع الدقيقة الذي يسمح بالتشريح الوظيفي لتذبذبات الإشارات في تطوير أجنة الفئران.
تم العثور على ديناميكيات الإشارات في العديد من الأنسجة بما في ذلك الأنسجة البالغة. الموائع الدقيقة هي أداة متعددة الاستخدامات يمكن تكييفها لتناسب العديد من الأنظمة النموذجية بما في ذلك الخلايا والأنسجة والثقافات العضوية. للبدء ، قم بإعداد الكمية المطلوبة من PDMS عن طريق خلط المونومر مع المحفز بنسبة تسعة إلى واحد للحث على البلمرة.
استخدم الأدوات التي يمكن التخلص منها وتأكد من تحقيق الخلط بشكل صحيح. ضع خليط PDMS في مجفف واستخدم المكنسة الكهربائية لمدة 30 دقيقة تقريبا لإزالة الهواء. صب طبقة PDMS من حوالي ثلاثة إلى خمسة ملليمترات في قالب الرقاقة وضعها مرة أخرى في المجفف لمدة 30 دقيقة تقريبا.
علاج القالب عن طريق وضعه في فرن بين عشية وضحاها عند 65 درجة مئوية أو أقل اعتمادا على مادة القالب. قطع رقاقة من القالب باستخدام مشرط. ثقب مدخل ومخرج ثقب مع لكمة خزعة ملليمتر واحد بدءا من داخل غرفة الموائع الدقيقة.
نظف الشريحة الزجاجية بالهواء المضغوط. لربط الشريحة بالشريحة الزجاجية ، ضع الشريحة والزجاج في فرن البلازما مع توجيه الجانبين لأعلى. قم بتوليد البلازما باستخدام البروتوكول الخاص بالآلة المستخدمة ، ثم قم بربط الشريحة بالزجاج عن طريق وضع الأسطح المنشطة على بعضها البعض وتطبيق الضغط بالتساوي.
لإعداد الأنابيب والرقاقة للتجربة ، قم بقطع الأنابيب بزاوية 45 درجة وإرفاق إبرة واحدة بكل من الأنابيب. ضع الأنبوب مع الإبر والرقاقة والمقابس في طبق وقم بتعقيمها عن طريق تعريضها للأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة تقريبا. لطلاء الشريحة بالفيبرونيكتين ، ضع الشريحة في كوب يحتوي على PBS بالإضافة إلى 1٪ من البنسلين أو الستربتومايسين في درجة حرارة الغرفة.
اغسل الشريحة باستخدام PBS لإزالة الهواء باستخدام ماصة P200. قم بتحميل حقنة سعة ثلاثة ملليلتر لكل غرفة من الشريحة. قم بتوصيل الإبرة بالحقنة التي تحتوي على الفيبرونيكتين وقم بتوصيل المحقنة بمضخة المحقنة.
اغسل الأنابيب يدويا لإزالة الهواء. قم بتوصيل أنبوب المخرج بمخرج الشريحة. تأكد من دفع الأنابيب على طول الطريق إلى الأسفل وتعيين معدل تدفق منخفض لتغطية الشريحة.
دع مضخة المحقنة تعمل لمدة ساعتين على الأقل أو طوال الليل. عند الانتهاء ، أوقف المضخة واقطع الأنابيب مباشرة بعد الإبرة. تحضير المحاقن المملوءة بالوسط للتجربة وإزالة كل من وسط الثقافة والرقاقة داخل PBS.
حاول طرد أو امتصاص معظم فقاعات الهواء من الشريحة ، ثم قم بتثبيت المحاقن في المضخات وإرفاق أنابيب المدخل بالمحاقن. لتحميل الأنسجة على الشريحة ، قم بتشريح الطرف الخلفي من الذيل. اغسل الشريحة بوسط الثقافة مع 25 HEPES ميكرومولار لإزالة PBS.
قم بتحميل الأنسجة في الشريحة باستخدام ماصة P200. بعد كل خطوة من خطوات تحميل الأنسجة، أغلق مدخل تحميل الأنسجة المقابل باستخدام قطعة من الأنابيب المملوءة ب PDMS. لتجميع إعداد الموائع الدقيقة ، قم بتوصيل الأنابيب بشريحة الموائع الدقيقة دون الحصول على فقاعات هواء في الداخل.
للقيام بذلك ، تأكد من وجود قطرة من الوسط في نهاية الأنابيب. بمجرد توصيل جميع الأنابيب بالرقاقة ، أخرجها من الكأس وضعها في طبق يحتوي على نسيج مبلل. ضع الطبق وحوالي 1.5 متر من أنابيب المدخل في حاضنة للثقافة بين عشية وضحاها.
ضمان رطوبة عالية لمنع تشكيل فقاعات الهواء أثناء الثقافة. بدلا من ذلك ، قم بتجفيف الجزء الخارجي من الشريحة ووضعه في حامل مجهر ، ثم ضع الحامل وحوالي 1.5 متر من أنابيب المدخل داخل غرفة الحضانة في المجهر المقلوب لإجراء تجربة تصوير حية. بعد 20 دقيقة على الأقل من التدفق المستمر ، ابدأ الضخ المخطط له للتجربة.
لتدريب إشارات الشق في جنين الفأر المجزأ ، استخدم برنامج ضخ لمدة 100 دقيقة متوسطة و 30 دقيقة من نبضات الدواء المتكررة حتى نهاية التجربة ، عادة لمدة 24 ساعة. للتصوير في الوقت الفعلي، ابدأ التصوير بعد 30 دقيقة على الأقل. لتأكيد تقييد تذبذبات الإشارات ، تتم محاذاة تجارب متعددة باستخدام توقيت نبضات الدواء وتصورها باستخدام صبغة Cascade Blue.
يمكن إلغاء اتجاه التذبذبات الكمية وعرضها كمتوسط ويمكن حساب الانحراف المعياري أو مراحل التذبذبات. يمكن تحليل علاقة الطور بين تذبذبات مزارع الأجنة الخلفية المستقلة لبعضها البعض ونبضات الدواء الخارجية. لتأكيد التقييد ، يمكن للمرء على سبيل المثال تحديد فترة تذبذبات الإشارات الداخلية باستخدام برنامج pyBOAT القائم على بايثون.
عند تطبيق النبضات لمدة 130 دقيقة ، تظهر تذبذبات إشارات الشق أيضا فترة 130 دقيقة. من الأهمية بمكان منع تبخر السائل أثناء تجربة الموائع الدقيقة. خلاف ذلك ، سوف تتشكل فقاعات الهواء في الشريحة التي تتداخل مع التدفق المتوسط.
لمنع ذلك ، قم بتفريغ الوسط والشريحة وتأكد من أن الرطوبة في الحاضنة عالية بما فيه الكفاية. باستخدام هذه الطريقة ، يمكن تعديل ديناميكيات الإشارات ويمكن تحليل آثارها عن طريق التصوير في الوقت الفعلي لمراسلي الفلورسنت أو تلطيخ المناعة أو التهجين في الموقع. علاوة على ذلك ، يمكن أيضا استخراج الأنسجة من الشريحة لمزيد من التحليل.
يمكن للمرء استخدام هذه الطريقة لدراسة وظيفة تذبذبات الإشارات في التطور الجنيني. تم تطبيقه لإثبات أهمية تحول الطور بين مسارين متذبذبين للإشارة لتجزئة جنين الفأر. وبشكل أعم، يمكن استخدامه الآن لتشريح آلية ترميز الإشارات الديناميكية في الأنظمة متعددة الخلايا.
