يعد إعداد خلية واحدة أو تعليق نواة واحدة خطوة حاسمة لـ transcriptome عالي الإنتاجية والتنميط epigenome. يوفر بروتوكولنا طريقة بسيطة وقابلة للاستنساخ وعالمية لعزل النوى الفردية. على عكس الطرق الأخرى التي تتطلب المنظفات لعزل النوى ، بروتوكول لدينا هو العمود القائم ، وهو المنظفات وخالية من الانزيم.
وهي تمكن من عزل النوى في أقل من 30 دقيقة. بروتوكولنا يبسط عزل النواة. ويوفر طريقة قوية لإعداد تعليق نواة واحدة من الأنسجة التي يصعب تفكيكها.
للبدء، العازلة قبل البرد A و B من مجموعة عزل نوى خالية من المنظفات عن طريق وضعها على الجليد لمدة 30 دقيقة على الأقل. أنابيب معطف ونصائح ماصة مع 5٪ BSA الحل، والتي سوف تعزز الانتعاش من النوى. لمعطف النصائح ماصة، ماص 5٪ BSA حل مرتين إلى ثلاث مرات والهواء الجافة لمدة ساعتين.
لتلطف الأنابيب، املأها بـ BSA وعكسها ثلاث مرات. إزالة الحل والهواء الجاف الأنابيب رأسا على عقب على ورق الأنسجة النظيفة لمدة ساعتين. معطف أنبوب جمع واحد واحد واحد 1.5 ملليلتر أنبوب لكل عينة.
استخدم ملقط لكسر بلطف فتح الجمجمة وإزالة الأنسجة الرخوة والجلد والعظام من الجانبين البطني والثلالي من الجمجمة. ثم نقل بلطف الدماغ إلى طبق 30 ملليمتر يحتوي على الجليد البارد PBS و mince الدماغ إلى قطع صغيرة باستخدام شفرة حلاقة. لعزل نواة واحدة، نقل الأنسجة المفروم إلى خرطوشة تصفية المقدمة في مجموعة العزل نوى وإزالة حل الزائدة وإضافة 200 ميكرولترات من المخزن المؤقت البارد A.Grind الأنسجة مع قضيب من البلاستيك لمدة دقيقتين.
إضافة 300 ميكرولترات من المخزن المؤقت البارد A إلى خرطوشة التصفية واحتضانه على الجليد مع الغطاء مفتوح لمدة 10 دقائق. ثم قم بغطاء الكارتريدج وإعادة تعليق الأنسجة عن طريق عكس الأنبوب خمس مرات. جهاز طرد مركزي أنبوب العينة في 16، 000 مرات ز لمدة 30 ثانية لتمزق الخلايا.
التدفق من خلال يحتوي على نوى سليمة، والتي تشكل بيليه عديم اللون في الجزء السفلي من الأنبوب. تجاهل مرشح ثم resuspend بيليه من قبل دوامة بقوة لمدة 10 ثانية. بيليه النووي مرة أخرى عن طريق الطرد المركزي الحل في 500 مرات ز لمدة ثلاث دقائق.
ثم تجاهل بعناية المابير. resuspend بيليه في 0.8 ملليلتر من المخزن المؤقت البارد B عن طريق الأنابيب مرتين إلى ثلاث مرات والطرد المركزي في النوى 600 مرة ز لمدة 10 دقائق، والتي سوف تفصلهم عن حطام الغشاء. تجاهل بعناية فائقة.
Resuspend النوى المعزولة في 500 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني مع 5 ٪ BSA والحفاظ على تعليق على الجليد حتى FACS. لتأكيد مورفولوجيا النووية مع تلطيخ HEX، نقل 100 ميكرولترات من تعليق نوى واحد إلى أنبوب جديد باستخدام نصائح المغلفة BSA. وصمة عار النوى بإضافة 0.1 ميكرولتر من HEX ودوامة بلطف الأنبوب.
نقل تعليق نوى إلى طبق أسفل الزجاج وصورة للنيات باستخدام المجهر الفلوري مع إعداد الإثارة بالليزر من 405 نانومتر. قبل إجراء FACS، قم بتصفية النوى بمزاج خلية 40 ميكرومتر في أنبوب مغلف بـ BSA. تخفيف التعليق الذي تمت تصفيته بإضافة PBS مع 5٪ BSA إلى حجم النهائي من 1،000 ميكرولترات.
تسمية اثنين من أنابيب FACS السفلي جولة كتحكم وملطخة ونقل 250 ميكرولترات من تعليق نوى في أنبوب التحكم باستخدام طرف ماص مغلفة BSA. نقل 750 ميكرولترات المتبقية من الحل إلى أنبوب FACS المسمى الملون وإضافة ميكرولتر واحد من صبغة HEX صبغة وصمة عار النوى. ثم اخلطه عن طريق الدوامة البطيئة.
تحميل نموذج عنصر تحكم غير مُطَرَّد إلى مُززّر الخلية وسجل أحداث 5000. ثم تحميل العينة الملطخة وسجل 5000 الأحداث. رسم بوابات FACS لتحديد النوى واحدة.
يمكن اختيار النوى من خلال مقارنة إشارة الفلورسنت HEX بين العينات الملطخة بالتحكم. ثم فرز هيكس النوى الإيجابية من أنبوب ملون إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر تحتوي على 50 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني مع 5٪ BSA. وقد استخدم هذا البروتوكول لتوليد تعليق نواة واحدة مباشرة من أنسجة الدماغ حمار وحشي.
كانت النوى المعزولة ملطخة بـ HEX ومتخيلة مع المجهر الفلوري. وبدا أنها سليمة، جولة، وفصل جيد. والأهم من ذلك أن التجميع النووي لم يكن موجودا.
تم تنفيذ إثراء النوى المعزولة مع عملية استئصال cytometry تدفق عن طريق الغاء على وجود إشارة فلورية HEX. أظهرت النوى غير المطهوة الفلورسي الخلفية في حين أظهرت النوى الملطخة إشارة فلورية قوية. كانت النوى غير الملطخة والملطخة منفصلة بشكل جيد في القناة البنفسجية.
أثناء محاولة هذا البروتوكول ، من المهم أن نتذكر أن النوى المفردة تميل إلى التمسك بالمواد البلاستيكية. لمنع فقدان محتمل للنيات وزيادة الكفاءة، ينصح بشدة طلاء الأساسية للمواد البلاستيكية. يمكن استخدام تعليق نواة واحدة معزولة كذلك لنوية واحدة RNA هذه التقنية توضيح التغاير الخلوي في النظم البيولوجية المعقدة وتساعد على تحديد الخلايا الفرعية وشبكات الجينات.
باستخدام المنظفات و الطريقة الخالية من الانزيمات يسجل الضوضاء التقنية والتحيز المقدمة أثناء إعداد العينة. وقد وضعت هذه الطريقة عزل نوى واحد مبسطة ولوجستية.
