نود أن نعترف مارسيلو تورو للمساعدة مع التدفق الخلوي. وأيد هذه الدراسة السويدية القلب والرئة مؤسسة، مفوضية الاتحاد الأوروبي &quot;CardioCell&quot; FP7، السويدية مجلس البحوث والتأمينات AFA ومؤسسة آنا ليند. وأيد OB بواسطة جمعية الألمانية للبحوث.

1. العزلة من نوى القلب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنابيب منبذة فائقة معطف (أنابيب الطرد المركزي بيكمان # 363664) مع 10 مل من 1٪ حل طلاء جيش صرب البوسنة / برنامج تلفزيوني. تتويج الأنابيب والسماح لهم بالتناوب لمدة 30 دقيقة في محور دوار أنبوب. إزالة حل طلاء، والسماح مطلوب من أجهزة الطرد المركزي أنابيب الهواء الجاف (أنبوب واحد في قلب فأر لتحليل قلوب ماوس واحدة، قلوب بالتناوب الماوس تصل إلى 5 أو 1 غرام من أنسجة القلب من مختلف الأنواع ويمكن (على سبيل المثال الإنسان) يمكن معالجتها في أنبوب واحد). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجب أن يتم تنفيذ كافة الخطوات التالية على الجليد. تشريح البطين الأيسر من القلب الماوس طازجة أو مجمدة مبكرة مع مشرط. علما، هو الأمثل لهذا البروتوكول قلب فأر ولكن يمكن أيضا أن تتكيف مع الفئران أو قلب الإنسان. بدلا من ذلك، استخدام ما يصل الى 1 غرام من أنسجة القلب من مختلف الأنواع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقليم عينة في مقصورات صغيرة مع مشرط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل القطع الأنسجة في أنبوب 50 مل مليئة الصقر 15 مل من عازلة تحلل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجانسأنسجة القلب مع T-25 الخالط مسبار الترا Turrax (IKA) في 24000 دورة في الدقيقة لمدة 10 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع جناسة مع حجم مساو من عازلة تحلل إلى 30 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام douncer زجاج (40 مل) إلى مزيد من التجانس والأنسجة وخالية من النواة. أداء 8 السكتات الدماغية مع مدقة تخليص كبير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمرير نواة عزل الخام من خلال 100 ميكرون و 70 ميكرومتر شبكة النايلون مصفاة خلية دينار بحريني (العلوم البيولوجية)، على التوالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور باستمرار على عزل نواة الخام في جهاز للطرد المركزي المبردة (4 درجة مئوية) في 700 x ج لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف بعناية بواسطة أنابيب للقلب ومسح داخل أنبوب مع منشفة ورقية. يجب الحرص على عدم تعكير صفو كريات النوى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل نوى الخام عزل في 5ml من عازلة السكروز بواسطة pipetting الحل عدة مرات صعودا ونزولا. إضافة مزيد من 25 مل من عازلة السكروز إلى بيليه المنحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 مل من عازلة السكروز الطازجة إلى أنبوب منبذة فائقة المغلفة (انظر الخطوة 1.1). &lt;/ لى&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> تراكب بعناية المضافة 10 مل من عازلة السكروز مع بيليه نوى معلق في حل العازلة السكروز من الخطوة 1.9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقيق التوازن في أنابيب الطرد المركزي قبل وضعها في الدوار مجانا JS13.1 يتأرجح ووضع الدوار في جهاز الطرد المركزي عالية السرعة (بيكمان أفانتي S-25). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور عينة النوى في 13000 XG في 4 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما تدور انتهت، وإزالة الأنابيب بعناية من الدوار وتجاهل طاف بواسطة أنابيب للقلب والقضاء على ما تبقى من الحطام داخل الأنابيب مع منشفة ورقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل كريات النوى في 1ml من المخزن تخزين النوى (NSB زائد عازلة). ملاحظة: NSB زائد يحتوي على 1.5 ملي السبيرمين باعتبارها عامل استقرار الحمض النووي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المضي قدما في الخطوة 2.1، المناعية من نوى cardiomyocyte. </li></ol> 2. المناعية عن التدفق الخلوي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد سيطرة سلبية على المناعية. يأخذ قسامة من خارج ميكرولتر 20 من عينة نوى وDD 980 ميكرولتر من جهاز الأمن القومي بالإضافة إلى العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة مادة مضادة للمحيط بالمريكز 1 الأضداد (أرنب المضادة للPCM-1، الأجسام المضادة أطلس) لعينة النوى في التخفيف من 1:500 إلى نوى immunolabel cardiomyocyte. إضافة الجسم المضاد isotype في تخفيف نفس الأجسام المضادة لمكافحة PCM-1 لسيطرة السلبية، التي أعدت في الخطوة 2.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان سيطرة السلبية وأنبوب عينة عند 4 درجات مئوية خلال الليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل سيطرة السلبية وعينة على الأقل مرة واحدة مع جهاز الأمن القومي بالإضافة إلى المخزن المؤقت (تدور أسفل الأنابيب في جهاز الطرد المركزي المبردة (4 درجة مئوية) في 700 x ج لمدة 10 دقيقة. تجاهل طاف وحل كريات النوى في 1 مل من جهاز الأمن القومي بالإضافة إلى المخزن المؤقت). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة المضادة للأرنب الأجسام المضادة الثانوية فلوري (FITC أو APC) إلى سيطرة السلبية وأنبوب عينة في التخفيف من 1:1000. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان سيطرة السلبية وأنبوب العينة في درجة مئوية 4 ل 1 ح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل سيطرة السلبية وعينة على الأقل مرة واحدة مع جهاز الأمن القومي بالإضافة إلى المخزن المؤقت (تدور أسفل الأنابيب في جهاز الطرد المركزي المبردة (4 درجة مئوية) في 700 x ج لمدة 10 دقيقة. تجاهل طاف وحل كريات النوى في 1 مل من جهاز الأمن القومي بالإضافة إلى المخزن المؤقت). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المضي قدما في تحليل تدفق cytometric والفرز. </li></ol> 3. تدفق الخلوي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنابيب معطف جمع النوى (فالكون 15 مل) مع حل جيش صرب البوسنة / PBS 1٪ قبل البدء في التدفق الخلوي الفرز كما هو موضح في الخطوة 1.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصفية العينة ومراقبة سلبية من خلال مصفاة ميكرومتر الخلية 30 و تحميل لأول مرة سيطرة السلبية على تدفق عداد الكريات دينار بحريني (تدفق). تعريف البوابة الأولى والثانية لتحديد نوى و singlets (نواة واحدة)، استنادا إلى الأمام مبعثر (FSC)، إلى الأمام عرض نبض مبعثر (FS نبض العرض) والتشرذم الجانب (SSC) (الشكل 2a و ب). ويمكن إضافة الحمض النووي وصمة عار (DRAQ5 (1:500)) إلى نموذج يساعد على التعرف على سكان نوى في البداية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل عينة immunolabeled وتحديد بوابة ثالثة لعزل نواة cardiomyocyte (PCM-1-positve) من غير cardiomyocyte نوى (PCM-1-سلبية). بدء الفرز(الشكل 2C ود). </li></ol> اختياري: من أجل تحليل محتوى الحمض النووي (الصيغة الصبغية) وإجراء تحليل دورة الخلية إضافة الحمض النووي المناسب وصمة عار على النوى (على سبيل المثال هويشت 33342 أو DRAQ5) (الشكل 2E). <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الفرز التدفق الخلوي، ووضع نواة على الجليد وإعادة تحليل لتحديد نقاء فرز (الشكل 3A و ب). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور باستمرار نوى فرزها في أنابيب جمع في 1500 XG في جهاز للطرد المركزي المبردة لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل كريات النوى في منطقة عازلة متوافقة مع تطبيق المصب. </li></ol> 4. ممثل النتائج ويمكن تقييم التشكل نوى وسلامتها من قبل بقع الحمض النووي وتصور بواسطة المجهر (الشكل 1). ويمكن تقييم نجاح PCM-1 وضع العلامات بواسطة المجهر epifluorescence والتدفق الخلوي (الشكل 1 والشكل 2C ود). PCM-1-positiهاء، وينبغي أن يفصل تماما من السكان سلبية عن بعضها البعض (الشكل 2C ود). في البطين الأيسر الفئران يجب أن حوالي 30٪ من جميع نوى أن تكون نواة cardiomyocyte (الشكل 2D). ويمكن فرز نقاء يتم تقييمها من خلال إعادة تحليل نوى فرزها (الشكل 3A و ب). وينبغي على حد سواء السكان نواة لديها نقاء فرز تتجاوز 95٪. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/4205/4205fig1.jpg" /> الشكل 1. PCM-1 يحدد الأنوية cardiomyocyte. ملطخة نوى القلب (أ) مع الأجسام المضادة للPCM-1 (ب) وNkx2.5 (ج) في قلب فأر بالغ. (د) وتحيط PCM-1-وصفت من قبل نواة السيتوبلازم cardiomyocyte (ميوسين الثقيلة سلسلة (MHC))، وأعرب عن عامل النسخ Nkx2.5، وتوثيق وتحديد دقيق للنوى cardiomyocyte بواسطة تلطيخ-1 PCM (الحانات نطاق 20 ميكرون و 10 ميكرومتر (د، أقحم)). (ه) العزلات نوى القلب تصور مع الحمض النووي وصمة DRAQ5. (و و ز) Cardiomyocوصفت نوى yte مع الأجسام المضادة ضد PCM-1 (مقياس شريط 10 ميكرون). علما، ونمط تلطيخ epinuclear من PCM-1 في نواة خلية عضلية في قسم الأنسجة ومعزولة في نوى (سهام). <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/4205/4205fig2.jpg" /> الشكل 2. فرز تدفق cytometric من نوى cardiomyocyte. (أ) يتم تحديد نوى القلب بواسطة المبعثر إلى الأمام (FSC) والجانب مبعثر (SSC). (ب) من بوابة ثانية يحدد نواة واحدة من قبل FSC ونبض FS عرض 5. (ج، د) النابضة نيون يسمح للفصل من نوى cardiomyocyte (PCM-1-إيجابي)، وغير cardiomyocyte-(PCM-1-سلبية) نواة من أنسجة القلب. (ه) cardiomyocyte الفأر هي في معظمها (&gt; 80٪) مضاعفا (2N)، فقط مجموعة فرعية صغيرة من رباعي الصيغة الصبغية (4N) 6. علما، العضلية الإنسان تحتوي على تردد أعلى من نوى تعدد الصيغ الصبغية (&gt; 2N) 7،8. <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/4205/4205fig3.jpg" /> <stroنانوغرام&gt; الشكل 3. تحليل نقاء فرز النوى cardiomyocyte وغير cardiomyocyte. إعادة تحليل فرز النوى غير cardiomyocyte (أ) و cardiomyocyte (ب). على حد سواء من السكان وتظهر نقاء فرز تتجاوز 99٪.

<ol>
	<li>Ang, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+conventional+approaches+to+identify+myocyte+nuclei+in+histologic+sections+of+the+heart.">Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart.</a> American journal of physiology. Cell physiology. , 298-1603 (2010).</li><li>Bergmann, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+cardiomyocyte+nuclei+and+assessment+of+ploidy+for+the+analysis+of+cell+turnover.">Identification of cardiomyocyte nuclei and assessment of ploidy for the analysis of cell turnover.</a> Experimental cell research. 327, 188-194 (2011).</li><li>Bergmann, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+Cardiomyocyte+Renewal+in+Humans.">Evidence for Cardiomyocyte Renewal in Humans.</a> Science. 324, 98-102 (1126).</li><li>Walsh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+cell+cycle+control+and+growth+estimation.">Cardiomyocyte cell cycle control and growth estimation.</a> Cardiovascular Research. , 1-31 (2010).</li><li>Spalding, K., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B., Druid, H., Frisén, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrospective+birth+dating+of+cells+in+humans.">Retrospective birth dating of cells in humans.</a> Cell. 122, 133-143 (2005).</li><li>Adler, C. P., Friedburg, H., Herget, G. W., Neuburger, M., Schwalb, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variability+of+cardiomyocyte+DNA+content,+ploidy+level+and+nuclear+number+in+mammalian+hearts.">Variability of cardiomyocyte DNA content, ploidy level and nuclear number in mammalian hearts.</a> Virchows Arch. 429, 159-164 (1996).</li><li>Herget, G. W., Neuburger, M., Plagwitz, R., Adler, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+content,+ploidy+level+and+number+of+nuclei+in+the+human+heart+after+myocardial+infarction.">DNA content, ploidy level and number of nuclei in the human heart after myocardial infarction.</a> Cardiovascular Research. 36, 45-51 (1997).</li><li>Adler, C. P., Friedburg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+DNA+content.+ploidy+level+and+cell+number+in+geriatric+hearts:+postmortem+examinations+of+human+myocardium+in+old+age.">Myocardial DNA content. ploidy level and cell number in geriatric hearts: postmortem examinations of human myocardium in old age.</a> Mol. Cell Cardiol. 18, 3953-39 (1986).</li><li>Dubois, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIRPA+is+a+specific+cell-surface+marker+for+isolating+cardiomyocytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells.">SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells.</a> Nature. 29, 1011-1018 (2011).</li><li>Hattori, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nongenetic+method+for+purifying+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Nongenetic method for purifying stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 7, 61-66 (2010).</li><li>Fransioli, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+c-kit-Positive+Cell+Response+to+Pathological+Challenge+in+the+Myocardium.">Evolution of the c-kit-Positive Cell Response to Pathological Challenge in the Myocardium.</a> Stem Cells. 26, 1315-1324 (2008).</li><li>Elliott, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NKX2-5(eGFP/w)+hESCs+for+isolation+of+human+cardiac+progenitors+and+cardiomyocytes.">NKX2-5(eGFP/w) hESCs for isolation of human cardiac progenitors and cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 8, 1037-1040 (2011).</li><li>Laflamme, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+Cardiomyocyte+Repopulation+by+Extracardiac+Progenitors+in+Transplanted+Human+Hearts.">Evidence for Cardiomyocyte Repopulation by Extracardiac Progenitors in Transplanted Human Hearts.</a> Circulation Research. 90, 634-640 (2002).</li><li>Srsen, V., Fant, X., Heald, R., Rabouille, C., Merdes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome+proteins+form+an+insoluble+perinuclear+matrix+during+muscle+cell+differentiation.">Centrosome proteins form an insoluble perinuclear matrix during muscle cell differentiation.</a> BMC cell biology. 10, 28 (2009).</li><li>Spoelgen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+flow+cytometry-based+technique+to+measure+adult+neurogenesis+in+the+brain.">A novel flow cytometry-based technique to measure adult neurogenesis in the brain.</a> Journal of neurochemistry. 119, 165-175 (2011).</li><li>Soonpaa, M. H., Kim, K. K., Pajak, L., Franklin, M., Field, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+DNA+synthesis+and+binucleation+during+murine+development.">Cardiomyocyte DNA synthesis and binucleation during murine development.</a> The American journal of physiology. 271, H2183-H2189 (1996).</li><li>Olivetti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging,+cardiac+hypertrophy+and+ischemic+cardiomyopathy+do+not+affect+the+proportion+of+mononucleated+and+multinucleated+myocytes+in+the+human+heart.">Aging, cardiac hypertrophy and ischemic cardiomyopathy do not affect the proportion of mononucleated and multinucleated myocytes in the human heart.</a> J Mol Cell Cardiol. 28, 1463-1477 (1996).</li><li>Okada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+sorting+of+neuronal+and+glial+nuclei+from+central+nervous+system+tissue.">Flow cytometric sorting of neuronal and glial nuclei from central nervous system tissue.</a> Journal of cellular physiology. 226, 552-558 (2011).</li><li>Matevossian, A., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+Nuclei+Isolation+from+Human+Postmortem+Brain+Tissue.">Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue.</a> J. Vis. Exp. (20), e914 (2008).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

تحديد دقيق للنوى cardiomyocyte هو أمر حاسم لتحليل عمليات التجدد في عضلة القلب 2،3. تقوم أساسا التقنيات التقليدية لعزل العضلية من الأنسجة جديدة على الهضم الأنزيمي من البروتينات المصفوفة خارج الخلية، وتنقية لاحق من الخلايا الخلالي عن طريق الطرد المركزي بسرعة منخفضة. لا يمكن أن يؤديها تنقية مزيد من العضلية الحية من الخلايا الجذعية الجنينية (ESC) بواسطة الوسم المناعي مع علامات سطح مثل سيربا 9 أو الأصباغ الميتوكوندريا 10، يمكن تحديد العضلية الثابتة علامات السيتوبلازمية مثل سلسلة ميوسين الثقيلة (MHC) أو البروتينات النووية مثل GATA4 أو Nkx2.5. ومع ذلك، لا يقتصر على التعبير عن Nkx2.5 وGATA4 إلى العضلية الناضجة، ولكن يمكن اكتشافها أيضا في الخلايا الاصلية خلال التنمية، وبعد احتشاء عضلة القلب 11،12. الاستراتيجيات الجينية لتحديد العضلية تظهر أعلى التحديد، ولكن جتطبق annot في النماذج الحيوانية الكبيرة أو البشر 1. وقد أدت القيود المفروضة على الاستراتيجيات القائمة على الاستنتاجات المثيرة للجدل التي تعتمد على القياس الكمي للأحداث نادرة مثل موت الخلايا المبرمج، والانتشار والخيمرية 1،13. وبالتالي، هناك حاجة إلى وضع استراتيجية دقيقة لتحديد وتنقية ناضجة نوى cardiomyocyte متباينة. هنا، نحن تصف تقنية تنقية استنادا إلى المواد محيط بالمريكز 1 (PCM-1). سابقا، عززنا صلاحية عزل نواة لدينا من خلال اظهار ان ثلاثة علامات نووية مستقلة، PCM-1، القلب تروبونين تي وأنا، وتحديد عدد السكان نفسه cardiomyocyte. 2،3 السكان المنقى وأظهرت لتخصيب عالية من cardiomyocyte منتجات جينية معينة مثل كما troponins القلب، والميوسين بروتين سلسلة ثقيلة وعامل النسخ Nkx2.5 و 2،3 GATA4. وقد البروتوكول الحالي، بناء على PCM-1، طبقت بنجاح وأو تحليل دوران cardiomyocyte الإنسان والفأر 2،4 فضلا عن تحليل للوضع النسخي cardiomyocyte 2. ونحن نتوقع أن يمكن أيضا أن الاستراتيجية المقدمة تكييفها لعزل الخلايا العضلية من الأنواع الأخرى. PCM-1، وهو بروتين الجسيم المركزي، وإعادة يموضع إلى الغشاء النووي حيث يتراكم ويشكل مصفوفة غير قابلة للحل إلا في myocytes متباينة 2،14 (الشكل 1). التدفق الخلوي يسمح للتحليل سريع غير منحاز من عدد كبير من الخلايا، وهو مطلوب لتحديد أحداث نادرة في العضلية مثل موت الخلايا المبرمج ودورة الخلية اعادة الدخول 15. وعلاوة على ذلك، يمكن أن نظائرها النوكليوتيدات (على سبيل المثال BrdU) أن المقايسات الانتشار القائمة على تطبيقها بسهولة باستخدام تقنية لدينا قدم 4. أسلوبنا له ميزة أنه يمكن تحليل محتوى الحمض النووي لنواة cardiomyocyte واحد (الصيغة الصبغية النووية) في العضلية 16،17 متعدد النوى، والذي يوفر معلومات هامةعلى التمييز بين الازدواجية وcardiomyocyte polyploidisation 6-8. ومع ذلك، نظرا لطبيعة استراتيجيتنا، وهو توصيف multinucleation cardiomyocyte غير ممكن. مزيد من الطلبات من طريقة عرض من الدراسات التي تركز على تغييرات جينية من لونين، البروتينيات النووية، التفاعلات protein-DNA/RNA وعلى transcriptome النووية 18،19. بسبب استقرار النوى في تجميد إذابة الأنسجة، ويمكن أيضا عزل نواة قدم استراتيجية يمكن تطبيقها على الأنسجة المجمدة، مما يجعل من الممكن للاستفادة من المواد المؤرشفة من biobanks.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> 1. تحلل الواق </td></tr><tr><td> اسم كاشف </td></tr><tr><td> 0،32 م السكروز </td></tr><tr><td> تريس 10 ملم، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني = 8) </td></tr><tr><td> 5 مم CaCl 2 </td></tr><tr><td> 5 خلات ملي المغنيسيوم </td></tr><tr><td> 2.0 مم EDTA </td></tr><tr><td> 0.5 مم EGTA </td></tr><tr><td> 1 مم DTT </td></tr></tbody></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> 2. السكروز العازلة </td></tr><tr><td> اسم كاشف </td></tr><tr><td> 2.1 متر السكروز </td></tr><tr><td> تريس 10 ملم، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني = 8) </td></tr><tr><td> 5 خلات ملي المغنيسيوم </td></tr><tr><td> 1 مم DTT </td></tr></tbody></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> 3. نوى عازلة للتخزين (جهاز الأمن القومي زائد) </td></tr><tص&gt; <td> اسم كاشف </td></tr><tr><td> 0،44 م السكروز </td></tr><tr><td> تريس 10 ملم، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني = 7.2) </td></tr><tr><td> 70 ملم بوكل </td></tr><tr><td> 10 ملي MgCl 2 </td></tr><tr><td> 1.5 ملم السبيرمين </td></tr></tbody></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> الكواشف والمعدات </td><td> شركة </td></tr><tr><td> Isotype أرنب مفتش رقاقة الصف، # ab37415 </td><td> Abcam </td></tr><tr><td> أرنب المضادة للPCM-1 الأضداد، # HPA023374 </td><td> الأجسام المضادة أطلس </td></tr><tr><td> حمار ثانية. الأجسام المضادة، المضادة للأرنب ترتيب 488 فلور، # A-21206 ثانية أو ما يعادلها. فلوري الأضداد </td><td> الحياة تكنولوجيز </td></tr><tr><td> DRAQ5 </td><td> Biostatus </td></tr><tr><td> مصافى الخلية 30 ميكرون، ميكرومتر 70 و 100 ميكرون </td><td> العلوم البيولوجية دينار بحريني </td></tr><tr><td> زجاج douncer (40 مل)، والمدقه &quot;L&quot; </td><td> VWR (ويتون للصناعات المحدودة) </td></tr><tr><td> T-25 الترا Turrax الخالط </td><td> IKA ألمانيا </td></tr><tr><td> أداة تفريق S25 N-18 G </td><td> IKA ألمانيا </td></tr><tr><td> بيكمان أفانتي جهاز طرد مركزي </td><td> بيكمان كولتر </td></tr><tr><td> صقر أنابيب 15 مل و 50 مل </td><td> VWR </td></tr><tr><td> أنابيب الطرد المركزي بيكمان # 363664 </td><td> بيكمان كولتر </td></tr><tr><td> JS13.1 مجانا الدوار يتأرجح </td><td> بيكمان كولتر </td></tr><tr><td> تدفق عداد الكريات </td><td> بيكمان كولتر </td></tr><tr><td> أنبوب الدوار </td><td> VWR </td></tr></tbody></table>

isolation of cardiomyocyte nuclei from post-mortem tissue

وقد تم تحديد نوى cardiomyocyte تحديا في المقاطع النسيجية حيث أن معظم استراتيجيات الاعتماد فقط على البروتينات علامة حشوية 1. أحداث نادرة في myocytes القلب مثل انتشار وموت الخلايا المبرمج يحتاج الى تحديد دقيق للنواة خلية عضلية قلبية على تحليل تجديد الخلوية في التوازن وفي الحالات المرضية 2. هنا، ونحن نقدم وسيلة لعزل نواة cardiomyocyte من الأنسجة بعد الوفاة بواسطة الترسيب كثافة والوسم المناعي مع أجسام مضادة ضد مادة محيط بالمريكز 1 (PCM-1) واللاحقة الفرز التدفق الخلوي. هذه الاستراتيجية تسمح للتحليل إنتاجية عالية والعزلة مع الاستفادة من العمل بشكل جيد على قدم المساواة في الأنسجة الطازجة والمجمدة المواد الأرشيفية. هذا يجعل من الممكن لدراسة المواد التي تم جمعها بالفعل في biobanks. هذه التقنية قابلة للتطبيق واختبارها في مجموعة واسعة من الأنواع ومناسبة للتطبيقات المصب متعددة مثل الكربون 14 التي يرجع تاريخها 3، خلية-CYCLE تحليل 4، تصور من نظائرها ثيميدين (على سبيل المثال BrdU وإيدو) 4، وتحليل transcriptome وجينية.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue at JoVE.com

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

يتم عزل نواة القلب عن طريق الترسيب وكثافة immunolabeled مع الأجسام المضادة ضد مادة محيط بالمريكز 1 (PCM-1) لتحديد وفرز النوى cardiomyocyte بواسطة التدفق الخلوي.

العزلة نوى Cardiomyocyte من الأنسجة بعد الوفاة

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

isolation-of-cardiomyocyte-nuclei-from-post-mortem-tissue

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

16.9K Views.  University of Lund. يتم عزل نواة القلب عن طريق الترسيب وكثافة immunolabeled مع الأجسام المضادة ضد مادة محيط بالمريكز 1 (PCM-1) لتحديد وفرز النوى cardiomyocyte بواسطة التدفق الخلوي.

Video: Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients

Investigations into the pathogenesis of type 2 diabetes and islets of Langerhans malfunction 1 have been hampered by the limited availability of type 2 diabetic islets from organ donors2. Here we share our protocol for isolating islets from human pancreatic tissue obtained from type 2 diabetic and non-diabetic patients who have undergone partial pancreatectomy due to different pancreatic diseases (benign or malignant pancreatic tumors, chronic pancreatitis, and common bile duct or duodenal tumors). All patients involved gave their consent to this study, which had also been approved by the local ethics committee. The surgical specimens were immediately delivered to the pathologist who selected soft and healthy appearing pancreatic tissue for islet isolation, retaining the damaged tissue for diagnostic purposes. We found that to isolate more than 1,000 islets, we had to begin with at least 2 g of pancreatic tissue. Also essential to our protocol was to visibly distend the tissue when injecting the enzyme-containing media and subsequently mince it to aid digestion by increasing the surface area.
To extend the applicability of our protocol to include the occasional case in which a large amount (&gt;15g) of human pancreatic tissue is available , we used a Ricordi chamber (50 ml) to digest the tissue. During digestion, we manually shook the Ricordi chamber3 at an intensity that varied by specimen according to its level of tissue fibrosis. A discontinous Ficoll gradient was then used to separate the islets from acinar tissue. We noted that the tissue pellet should be small enough to be homogenously resuspended in Ficoll medium with a density of 1.125 g/ml. After isolation, we cultured the islets under stress free conditions (no shaking or rotation) with 5% CO2 at 37 &deg;C for at least 48 h in order to facilitate their functional recovery. Widespread application of our protocol and its future improvement could enable the timely harvesting of large quantities of human islets from diabetic and clinically matched non-diabetic subjects, greatly advancing type 2 diabetes research.

The supply of type 2 diabetic islets for research is insufficient. Here we share our protocol for isolating islets from patients undergoing partial pancreatectomy. This approach represents a unique venue for obtaining islets from type 2 diabetic and clinically matched non-diabetic subjects in adequate numbers for basic and clinical studies.

عزلة الإنسان الفشوت من المرضى مستأصل البنكرياس جزئيا

Investigations into the pathogenesis of type 2 diabetes and islets of Langerhans malfunction 1 have been hampered by the limited availability of type 2 ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly isolated from human tissues and serially propagated in immunodeficient mice, typically through antibody labeling of subpopulations of cells and fractionation by flow cytometry. However, the unique clinical features of prostate cancer have considerably limited the study of prostate CSCs from fresh human tumor samples. We recently reported the isolation of prostate CSCs directly from human tissues by virtue of their HLA class I (HLAI)-negative phenotype. Prostate cancer cells are harvested from surgical specimens and mechanically dissociated. A cell suspension is generated and labeled with fluorescently conjugated HLAI and stromal antibodies. Subpopulations of HLAI-negative cells are finally isolated using a flow cytometer. The principal limitation of this protocol is the frequently microscopic and multifocal nature of primary cancer in prostatectomy specimens. Nonetheless, isolated live prostate CSCs are suitable for molecular characterization and functional validation by transplantation in immunodeficient mice.

The isolation of cancer stem cells (CSCs) directly from human tissues is requisite for their biological characterization. This manuscript describes a methodology for the isolation of prostate CSCs from human tissues, while also providing tips on troubleshooting difficult steps.

عزل الخلايا الجذعية للسرطان من العينات البشرية سرطان البروستاتا

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Establishment of Human Epithelial Enteroids and Colonoids from Whole Tissue and Biopsy

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem cells (ISCs) and progeny that progressively migrate and differentiate toward the tip of the villi. These processes, essential for gastrointestinal homeostasis, have been extensively studied using multiple approaches. Ex vivo technologies, especially primary cell cultures have proven to be promising for understanding intestinal epithelial functions. A long-term primary culture system for mouse intestinal crypts has been established to generate 3-dimensional epithelial organoids. These epithelial structures contain crypt- and villus-like domains reminiscent of normal gut epithelium. Commonly, termed &#8220;enteroids&#8221; when derived from small intestine and &#8220;colonoids&#8221; when derived from colon, they are different from organoids that also contain mesenchyme tissue. Additionally, these enteroids/colonoids continuously produce all cell types found normally within the intestinal epithelium. This in vitro organ-like culture system is rapidly becoming the new gold standard for investigation of intestinal stem cell biology and epithelial cell physiology. This technology has been recently transferred to the study of human gut. The establishment of human derived epithelial enteroids and colonoids from small intestine and colon has been possible through the utilization of specific culture media that allow their growth and maintenance over time. Here, we describe a method to establish a small intestinal and colon crypt-derived system from human whole tissue or biopsies. We emphasize the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

We describe a method to establish human enteroids from small intestinal crypts and colonoids from colon crypts collected from both surgical tissue and biopsies. In this methodological article, we present the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

إنشاء الإنسان الظهارية Enteroids وColonoids من الأنسجة كامل وخزعة

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem ...

Isolation and Profiling of MicroRNA-containing Exosomes from Human Bile

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic uses.
Exosomes have recently been shown to contain microRNAs (miRs). MiRs themselves have arisen as valuable biomarkers for diagnostic purposes. As specimen collection in clinics and hospitals is quite variable, miRNA isolation from whole bile varies substantially. To achieve robust, accurate and reproducible miRNA profiles from collected bile samples in a simple manner required the development of a high-quality protocol to isolate and characterize exosomes from bile. The method requires several centrifugations and a filtration step with a final ultracentrifugation step to pellet the isolated exosomes. Electron microscopy, Western blots, flow cytometry and multi-parameter nanoparticle optical analysis, where available, are crucial characterization steps to validate the quality of the exosomes. For the isolation of miRNA from these exosomes, spiking the lysate with a non-specific, synthetic miRNA from a species like Caenorhabditis elegans, i.e., Cel-miR-39, is important for normalization of RNA extraction efficiency. The isolation of exosome from bile fluid following this method allows the successful miRNA profiling from bile samples stored for several years at -80 &#176;C.

Bile fluid is a valuable source of extracellular vesicles/exosomes that contain potentially important biomarkers. This protocol represents a robust method to isolate exosomes from human bile for further analyses including miRNA profiling.

العزلة ومن التنميط Exosomes من الصفراء الإنسان التي تحتوي على الرنا الميكروي

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic ...

Sampling Strategies and Processing of Biobank Tissue Samples from Porcine Biomedical Models

In translational medical research, porcine models have steadily become more popular. Considering the high value of individual animals, particularly of genetically modified pig models, and the often-limited number of available animals of these models, establishment of (biobank) collections of adequately processed tissue samples suited for a broad spectrum of subsequent analyses methods, including analyses not specified at the time point of sampling, represent meaningful approaches to take full advantage of the translational value of the model. With respect to the peculiarities of porcine anatomy, comprehensive guidelines have recently been established for standardized generation of representative, high-quality samples from different porcine organs and tissues. These guidelines are essential prerequisites for the reproducibility of results and their comparability between different studies and investigators. The recording of basic data, such as organ weights and volumes, the determination of the sampling locations and of the numbers of tissue samples to be generated, as well as their orientation, size, processing and trimming directions, are relevant factors determining the generalizability and usability of the specimen for molecular, qualitative, and quantitative morphological analyses. Here, an illustrative, practical, step-by-step demonstration of the most important techniques for generation of representative, multi-purpose biobank specimen from porcine tissues is presented. The methods described here include determination of organ/tissue volumes and densities, the application of a volume-weighted systematic random sampling procedure for parenchymal organs by point-counting, determination of the extent of tissue shrinkage related to histological embedding of samples, and generation of randomly oriented samples for quantitative stereological analyses, such as isotropic uniform random (IUR) sections generated by the &#34;Orientator&#34; and &#34;Isector&#34; methods, and vertical uniform random (VUR) sections.

The practical application and performance of methods for generation of representative tissue samples of porcine animal models for a broad spectrum of downstream analyses in biobank projects are demonstrated, including volumetry, systematic random sampling, and differential processing of tissue samples for qualitative and quantitative morphologic and molecular analyses types.

استراتيجيات أخذ العينات وتجهيزها لعينات الأنسجة المصرف البيولوجي من النماذج الطبية الخنزير

In translational medical research, porcine models have steadily become more popular. Considering the high value of individual animals, particularly of ...

Isolation of Primary Human Decidual Cells from the Fetal Membranes of Term Placentae

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized stromal cells and immune cells, are responsible for the secretion of hormonal and inflammatory factors which are critical for successful blastocyst implantation, placental development and play a role in the initiation of labor at term and preterm. Many pregnancy complications can arise from perturbations of a fine balance of different cell populations comprising decidua. Alterations in the proportion of specific decidual cell types may disrupt these crucial processes and increase the risk of developing serious complications of pregnancy, such as embryo implantation failure, intrauterine growth restriction, preeclampsia and preterm labor. The protocol outlined here demonstrates a cost and time effective method for the isolation of primary human decidual cells collected from the fetal membranes of term placentae. By combining enzymatic digestion and gentle mechanical disruption of the decidual tissue, a high yield of decidual cells was obtained with virtually no chorion contamination. Importantly, isolated decidual cells were characterized (stromal cells (55-60%), leukocytes (35%), epithelial (1%) or trophoblast (0.01%) cells) and maintained high viability (80%) which was confirmed by multicolor imaging flow cytometry assay. This protocol is specific to the decidua parietalis and can be adapted to first and second trimester placentae. Once isolated, decidual cells can be used for a multitude of experimental applications aiming to understand the role of different decidual cell sub-populations in pregnancy complications.

This protocol demonstrates a method for the isolation of primary human decidual cells collected from the fetal membranes of term placentae which can be used for a variety of applications (i.e. immunocytochemistry, flow cytometry, etc.) aiming to study the role of different cell populations in pregnancy complications.

عزل خلايا Decidual البشرية الأولية من الأغشية الجنينية لمصطلح مترافق

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized ...

Isolation of Atrial Myocytes from Adult Mice

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents responsible for the action potential can cause pro-arrhythmic substrates that underlie arrhythmias, such as atrial fibrillation, which are highly prevalent in many conditions and disease states. Isolating adult mouse atrial cardiomyocytes for use in patch-clamp experiments has greatly advanced our knowledge and understanding of the cellular electrophysiology in the healthy atrial myocardium and in the setting of atrial pathophysiology. In addition, studies using genetic mouse models have elucidated the role of a vast array of proteins in regulating atrial electrophysiology. Here we provide a detailed protocol for the isolation of cardiomyocytes from the atrial appendages of adult mice using a combination of enzymatic digestion and mechanical dissociation of these tissues. This approach consistently and reliably yields isolated atrial cardiomyocytes that can then be used to characterize cellular electrophysiology by measuring action potentials and ionic currents in patch-clamp experiments under a number of experimental conditions.

This protocol is used to isolate single atrial cardiomyocytes from the adult mouse heart using a chunk digestion approach. This approach is used to isolate right or left atrial myocytes that can be used to characterize atrial myocyte electrophysiology in patch-clamp studies.

عزل الخلايا الماية الأذينية من الفئران البالغة

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents ...

Electromechanical Assessment of Optogenetically Modulated Cardiomyocyte Activity

Over the past two decades, optogenetic tools have been established as potent means to modulate cell-type specific activity in excitable tissues, including the heart. While Channelrhodopsin-2 (ChR2) is a common tool to depolarize the membrane potential in cardiomyocytes (CM), potentially eliciting action potentials (AP), an effective tool for reliable silencing of CM activity has been missing. It has been suggested to use anion channelrhodopsins (ACR) for optogenetic inhibition. Here, we describe a protocol to assess the effects of activating the natural ACR GtACR1 from Guillardia theta in cultured rabbit CM. Primary readouts are electrophysiological patch-clamp recordings and optical tracking of CM contractions, both performed while applying different patterns of light stimulation. The protocol includes CM isolation from rabbit heart, seeding and culturing of the cells for up to 4 days, transduction via adenovirus coding for the light-gated chloride channel, preparation of patch-clamp and carbon fiber setups, data collection and analysis. Using the patch-clamp technique in whole-cell configuration allows one to record light-activated currents (in voltage-clamp mode, V-clamp) and AP (current-clamp mode, I-clamp) in real time. In addition to patch-clamp experiments, we conduct contractility measurements for functional assessment of CM activity without disturbing the intracellular milieu. To do so, cells are mechanically preloaded using carbon fibers and contractions are recorded by tracking changes in sarcomere length and carbon fiber distance. Data analysis includes assessment of AP duration from I-clamp recordings, peak currents from V-clamp recordings and force calculation from carbon fiber measurements. The described protocol can be applied to the testing of biophysical effects of different optogenetic actuators on CM activity, a prerequisite for the development of a mechanistic understanding of optogenetic experiments in cardiac tissue and whole hearts.

We present a protocol for evaluating the electromechanical effects of GtACR1 activation in rabbit cardiomyocytes. We provide detailed information on cell isolation, culturing and adenoviral transduction, and on functional experiments with the patch-clamp and carbon-fiber techniques.

التقييم الكهروميكانيكي لنشاط القلب المعمول وراثياً

Over the past two decades, optogenetic tools have been established as potent means to modulate cell-type specific activity in excitable tissues, including ...

Model of Ischemic Heart Disease and Video-Based Comparison of Cardiomyocyte Contraction Using hiPSC-Derived Cardiomyocytes

Ischemic heart disease is a significant cause of death worldwide. It has therefore been the subject of a tremendous amount of research, often with small-animal models such as rodents. However, the physiology of the human heart differs significantly from that of the rodent heart, underscoring the need for clinically relevant models to study heart disease. Here, we present a protocol to model ischemic heart disease using cardiomyocytes differentiated from human induced pluripotent stem cells (hiPS-CMs) and to quantify the damage and functional impairment of the ischemic cardiomyocytes. Exposure to 2% oxygen without glucose and serum increases the percentage of injured cells, which is indicated by staining of the nucleus with propidium iodide, and decreases cellular viability. These conditions also decrease the contractility of hiPS-CMs as confirmed by displacement vector field analysis of microscopic video images. This protocol may furthermore provide a convenient method for personalized drug screening by facilitating the use of hiPS cells from individual patients. Therefore, this model of ischemic heart disease, based on iPS-CMs of human origin, can provide a useful platform for drug screening and further research on ischemic heart disease.

We present a model of ischemic heart disease using cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells, together with a method for quantitative evaluation of tissue damage caused by ischemia. This model can provide a useful platform for drug screening and further research on ischemic heart disease.

نموذج من مرض القلب الإقفاري والمقارنة المستندة إلى الفيديو من انكماش القلبية من خلال استخدام هابسك المشتقة من القلب

Ischemic heart disease is a significant cause of death worldwide. It has therefore been the subject of a tremendous amount of research, often with ...

Isolation of Viable Adipocytes and Stromal Vascular Fraction from Human Visceral Adipose Tissue Suitable for RNA Analysis and Macrophage Phenotyping

Visceral adipose tissue (VAT) is an active metabolic organ composed mainly of mature adipocytes and stromal vascular fraction (SVF) cells, which release different bioactive molecules that control metabolic, hormonal, and immune processes; currently, it is unclear how these processes are regulated within the adipose tissue. Therefore, the development of methods evaluating the contribution of each cell population to the pathophysiology of adipose tissue is crucial. This protocol describes the isolation steps and provides the necessary troubleshooting guidelines for efficient isolation of viable mature adipocytes and SVF from human VAT biopsies in a single process, using a collagenase enzymatic digestion technique. Moreover, the protocol is also optimized to identify macrophage subsets and perform mature adipocyte RNA isolation for gene expression studies, which allows performing studies dissecting the interaction between these cell populations. Briefly, VAT biopsies are washed, minced mechanically, and digested to generate a single-cell suspension. After centrifugation, mature adipocytes are isolated by flotation from the SVF pellet. The RNA extraction protocol ensures a high yield of total RNA (including miRNAs) from adipocytes for downstream expression assays. Simultaneously, SVF cells are used to characterize macrophage subsets (pro- and anti-inflammatory phenotype) through flow cytometry analysis.

This protocol provides an efficient collagenase digestion method for isolation of viable adipocytes and stromal vascular fraction-SVF cells from human visceral fat in a single process, including methodology to obtain high-quality RNA from adipocytes and phenotypification of SVF-macrophages through staining of multiple membrane-bound markers for analysis by flow cytometry.

عزل الخلايا الشحمية القابلة للحياة وجزء الأوعية الدموية اللحمية من الأنسجة الدهنية الحشوية البشرية المناسبة لتحليل الحمض النووي الريبي والتنميط الظاهري للبلاعم

Visceral adipose tissue (VAT) is an active metabolic organ composed mainly of mature adipocytes and stromal vascular fraction (SVF) cells, which release ...