هذا البروتوكول يسمح لنا بإجراء التلاعب الجيني في الجسم الحي في نموذج حيواني رئيسي يسمح لنا بدراسة توسع وطى القشرة الجديدة النامية. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي في استخدام خصوصية مكانية وزمنية عالية في استهداف الخلايا الجذعية العصبية التي هي نوع الخلية الرئيسية لتنمية الدماغ. قبل البدء في الإجراء، سحب الشعيرات الدموية الزجاجية على سحب ماصة صغيرة واستخدام ملقط لقطع الجزء من الشعرية لضبط قطر طرف شعري.
في اليوم الجنيني 33، إضافة التركيز المناسب من الحمض النووي في برنامج تلفزيوني، تستكمل مع 0.1٪ الأخضر سريع مع خلط لطيف، ووضع 3 ساعة صيام، تخدير، نمس الإناث الحوامل على طاولة عملية مع وسادة الحرارة. تأكد من المستوى المناسب من التخش عن طريق لمس الجلد حول العين وقرص الجلد بين أصابع قدم الثاني والثالث أو الثالث والرابع لكلا الطرفين الخلفيين. يمكن أن يسبب ايزوفلوران آثار ضارة, بما في ذلك الغثيان والدوخة.
عند التعامل مع ايزوفلوران في شكل سائل، واستخدام معدات الحماية. أثناء الجراحة، استخدم العبوات المناسبة لالتقاط الغاز. حقن الحيوان تحت الجلد مع المسكنات والمضادات الحيوية والجلوكوز، ووضع مرهم على عيون الحيوان.
استخدام مقصات لحلاقة البطن، وتنظيف الجلد المكشوفة مع محلول الماء والصابون واليود. ثم جفف الجلد بمسحات الشاش وتطهيرها بالكحول واليود الدعك. في الإلكتروبور الرحمي، ضع ستارة معقمة على الحيوان واستخدم مشرطًا لعمل شق جلدي يبلغ طوله حوالي 5 سنتيمترات في ألبا linea.
استخدام مقص لقطع من خلال طبقة العضلات ووضع مسحات الشاش حول موقع شق. الرطب الشاش مع برنامج تلفزيوني ووضع الرحم على مسحات. باستخدام ماصة مع طرف طويل، تحميل واحدة من الشعيرات الدموية الزجاجية المسحوبة مع 5 ميكرولترات من محلول الحمض النووي لكل جنين ليتم حقنه.
إرفاق الشعيرية محملة إلى حامل وربط الجانب الآخر من حامل إلى أنبوب وساعة. حدد موقع رأس الجنين الأول ووضع مصدر ضوء الألياف البصرية بجوار الرأس. باستخدام القزحية المصطبغة كنقطة مرجعية ، اختراق الجلد والجمجمة والأنسجة الدماغية مع غيض من الشعرية الزجاجية واستخدام الأنابيب الفم لتسهيل تسليم 3-5 ميكرولترات من محلول الحقن في البطين من واحد من نصفي الكرة الدماغية.
لأن الحل المحقون يحتوي على 0.1٪ أخضر سريع، فإن الحقنة الناجحة ستؤدي إلى تلطيخ أخضر داكن للبطين المحقون، والذي سيكون مرئيًا الآن كبنية على شكل كلية. بعد الحقن ، ضع أقطاب الملاقط على الرحم فوق رأس الجنين مع القطب الإيجابي فوق المنطقة التي سيتم استهدافها والقطب السلبي تحت المنطقة المحقونة. تعيين طول النبض من الأقطاب الكهربائية إلى 50 مللي ثانية، والجهد نبض إلى 100 فولت، وفترة النبض إلى ثانية واحدة، وعدد النبضات إلى خمسة.
عندما تم تعيين كل من المعلمات، اضغط نبض"وإسقاط بسرعة عدة قطرات من برنامج تلفزيوني دافئ على الجنين الكهربائي. عندما تكون جميع الأجنة الكهربية ، عد الرحم إلى تجويف الصفاق واستخدم خياطة 4-0 لإغلاق طبقة العضلات مع البريتوني. أغلق الجلد بطريقة مماثلة وغطي الجرح برذاذ الألمنيوم.
ثم إعادة الحيوان إلى قفصه مع مصدر الحرارة والمراقبة حتى إعادة شغل كامل. بعد أربعة أيام من الكهربة في اليوم الجنيني 37، معظم الخلايا المستهدفة وذريتها لا تزال في المناطق الجرثومية ونادرا ما لوحظت الخلايا أكثر بallyallyally داخل لوحة القشرية. يمكن فحص هوية السلف عن طريق الفلوروس المناعي لعلامات خلايا الدراجات ، مثل PCNA ، في حين يمكن عرض مجموعة فرعية من السلف الذين يخضعون للتصلب بواسطة علامات مثل فوسفو-هيستون 3.
في اليوم التالي للولادة صفر، بعد ثمانية أيام من الصعق الكهربائي، انتشرت ذرية الخلايا المستهدفة إلى جميع الطبقات النسيجية. باستخدام مزيج من علامات عامل النسخ ، يمكن الكشف عن مجموعات مختلفة من السلف القاعدي. على سبيل المثال، Sox2 هو علامة على الخلايا السلف التكاثري، بما في ذلك glia شعاعي القاعدي.
وتي مربع بروتين الدماغ 2 هو علامة على السلف القاعدية العصبية، والتي هي أساسا ذرية وسيطة. بحلول يوم ما بعد الولادة 16، توقف غالبية الخلايا المستهدفة عن الانقسام والتفريق إلى الخلايا العصبية والغليا، مع النمس بعد الولادة يوم 16 نيوكورتيكس عرض نمط طي مميزة. في كهربائي الرحم من الأجنة النمس هو وسيلة قوية للغاية لدراسة وظيفة الجينات.
وقد سمح لنا بدراسة الجينات التي تورطت في توسع القشرة الجديدة في التطور، بما في ذلك الجينات البشرية الخاصة. وباستخدام هذه الطريقة القوية، تمكنا بالفعل من معرفة السمات الرئيسية لكيفية عمل التوسع التطوري للكورتكس الجديد البشري على الأرجح.
