تم دعم هذا العمل من الميزانية الأساسية من P53lab (BMSI ، A * STAR) ومنحة JCO VIP (A * STAR).

HEK293 تم استخدام خط الخلية للبروتوكول وكان مثقفا في دولبيكو تعديل النسر المتوسطة تكملها 10٪ مصل البقر الجنيني، 2 MM L-الجلوتامين، و 100 U/mL البنسلين / العقديبتوميسين. تم استزراع الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون فيبيئة رطبة.
1. التقييم الكمي للاضطراب المعقد eIF4F عن طريق eIF4E:eIF4G604-646 اختبار الاستكمال
<ol><li>زراعة الخلايا والإصابة العابرة ل eIF4E:eIF4G604-646 اختبار الاستكمال<ol>
<li>استخدم خلايا مذابة حديثا مع أقل من 20 مقطعا لجميع التجارب. في اليوم الأول، حدد رقم الخلية باستخدام عداد خلية قياسي واحسب إجمالي الخلايا القابلة للحياة باستخدام طريقة استبعاد Trypan الزرقاء13.</li>
		<li>لوحات البذور 6-جيدا مع 0.9 - 1.2 × 106 من خلايا HEK 293 لكل بئر في 2 مل من متوسط النمو القياسي. ملاحظة: من أجل تحقيق أفضل كفاءة في العدوى داخل خطوط الخلية المشار إليها أعلاه، تأكد من أن الخلايا المطلية هي التقاء 70-90٪ في اليوم التالي للبذر.</li>
		<li>في صباح اليوم 2، خلايا العدوى المشتركة مع SubA-eIF4E و eIF4G604-646-SubB plasmid باستخدام كاشف العدوى القائم على الدهون (انظر جدول المواد)كما هو موضح أدناه.<ol>
<li>تمييع 9 ميكرولتر من محلول الليبوسوم القائم في أنبوب يحتوي على 125 ميكرولتر من متوسط المصل المنخفض بدون فينول أحمر (انظر جدول المواد)لكل عملية إصابة واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.</li>
			<li>إعداد مزيج رئيسي من الحمض النووي عن طريق تخفيف 3 ميكروغرام من كلplasmid في 125 ميكروغرام من انخفاض متوسط المصل لكل أنبوب العدوى.</li>
			<li>إضافة 12 ميكرولتر من الكواشف محسن إلى أنبوب مزيج الحمض النووي الرئيسي، مزيج جيدا وإضافة الحمض النووي على الفور: محسن مزيج رئيسي إلى كل أنبوب من الليبوسومات المخففة في نسبة 1:1. حضانة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.</li>
			<li>إضافة مجمع الحمض النووي الدهون إلى كل بئر واحتضان الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة.</li>
		</ol>
</li>
		<li>في صباح اليوم 3، شطف كل بئر مع 1 مل من برنامج تلفزيوني.</li>
		<li>إزالة برنامج تلفزيوني واحتضان الخلايا في كل بئر مع 0.3 مل من التريبسين لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية.</li>
		<li>تحييد التربسين بإضافة 2 مل من متوسط المصل المنخفض دون فينول أحمر يحتوي على 0٪ FCS في كل بئر ونقل الخلايا المصابة إلى أنبوب 15 مل. ملاحظة: فينول الأحمر يمكن أن تتداخل مع نشاط لوسيفيراز; لذلك، يجب معالجة الخلايا من هذه الخطوة فصاعدا في المتوسط دون فينول الأحمر.</li>
		<li>قم بتدبير الخلايا لمدة 5 دقائق عند 290 × ز ونسخ الوسط. Resuspend الخلايا في 2 مل من المتوسط المصل انخفاض دون فينول الأحمر التي تحتوي على 0٪ FCS. عد كما هو موضح في الخطوة 1.1.</li>
		<li>البذور المصابة HEK 293 الخلايا في 96 لوحات مبهمة جيدا في كثافة 30،000 خلية لكل بئر في 90 ميكرولتر من المتوسط دون فينول الأحمر التي تحتوي على 0٪ FCS. من أجل الحصول على 3 تكرارات تقنية في نفس التجربة ل 3 مركبات مختلفة ، بذور 60 بئرا من اللوحات مع خلايا باستثناء الآبار على الحواف.</li>
		<li>مباشرة بعد البذر الخلايا المصابة، إضافة 10 ميكرولتر من محلول مركب DMSO 10٪ (انظر الخطوة 1.2).</li>
	</ol></li>
	<li>إعداد المركب<ol>
<li>إعداد 1 MM حلول المخزون المركب عن طريق حل مجمع الفائدة في 100٪ DMSO (v/v). من أجل الحصول على 3 نسخ متماثلة لكل معيرة مركبة ، استخدم 8 ميكرولتر من محلول المخزون المركب 1 mM. ملاحظة: حجم مركب المخزون 1 mM المستخدمة هو أكثر من ما هو مطلوب. ويتم ذلك لتأخذ في الاعتبار أخطاء ماصة إن وجدت.</li>
		<li>تنفيذ 2 أضعاف المخفف التسلسلي للمحلول مركب الأسهم مع 4 ميكرولتر من المخزون 1 mM إلى 4 ميكرولتر من DMSO 100٪ لكل نقطة المعايرة. ملاحظة: للحصول على المعايرة المركبة كاملة، تنفيذ 9 المخففات التسلسلية من المخزون بدءا في DMSO 100٪. إذا كانت هناك حاجة إلى اختبار مركبات متعددة، استخدم لوحة بئر 96 وماصة متعددة القنوات لتسهيل هذه الخطوة والتخفيفات اللاحقة.</li>
		<li>إضافة 36 ميكرولتر من HPLC الصف المياه العقيمة لكل نقطة من تخفيف المسلسل 2 أضعاف لإعداد 40 ميكرولتر من حلول العمل 10x في 10٪ DMSO (v/v) (أي. 100 μM إلى 0.39 ميكرومتر 10٪ سلسلة أسهم DMSO ستؤدي إلى حل نهائي من 10 ميكرومتر إلى 0.039 ميكرومتر، في 1٪ DMSO عند إضافتها إلى الخلايا). أما بالنسبة للسيطرة على العلاج، وإعداد أيضا 10٪ DMSO الأسهم الحل فقط في المياه العقيمة HPLC الصف.</li>
		<li>إضافة 10 ميكرولتر من حلول العمل 10x إلى الخلايا في لوحة 96 مبهمة جيدا من أجل تحقيق التركيز النهائي المقصود مع تركيز DMSO المتبقية من 1٪ (v/v) في حجم إجمالي قدره 100 ميكرولتر واحتضان لمدة 3 ساعة في 37 درجة مئوية مع 5٪ v/vCO2في الغلاف الجوي .</li>
	</ol></li>
	<li>لوكيفيراز تكملة وثبات البقاء<ol>
<li>بعد 3 ساعة من المخدرات، والبدء في إعداد كاشف الركيزة لوسيفيراز عن طريق الجمع بين 1 حجم الركيزة مع 19 مجلدا من كاشف التخفيف (انظر تعليمات الشركة المصنعة). ملاحظة: يتم إجراء المقايسة لوسيفيراز باستخدام عدة متوفرة تجاريا (انظر جدول المواد).</li>
		<li>استخدم ماصة متعددة القنوات لإضافة 25 ميكرولتر من كاشف الركيزة على الفور.</li>
		<li>يهز لوحة في 350 دورة في الدقيقة لمدة 50 دقيقة على شاكر المدارية في درجة حرارة الغرفة.</li>
		<li>تقييم التلألؤ باستخدام قارئ لوحة. للقيام بذلك، تعيين قارئ المرآة على التلألؤ ومرشح الانبعاثات على 455. استخدم ارتفاع قياس 6.5 مم مع وقت قياس قدره 1 s.</li>
		<li>من أجل تقييم صلاحية الخلية ، أضف 33 ميكرولتر من كاشف فحص الجدوى ثم إعادة قياس التلألؤ مرة أخرى بعد 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، باستخدام قارئ اللوحة.</li>
		<li>تقييم التلألؤ مع قارئ لوحة عن طريق وضع قارئ المرآة على التلألؤ ومرشح الانبعاثات على 600 نانومتر. استخدم ارتفاع قياس 6.5 مم مع وقت قياس قدره 1 s. ملاحظة: يتم تقييم الجدوى عن طريق قياس مستوى ATP داخل الخلايا عند تحلل الخلية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تعدد ممكن في هذه الحالة منذ المقايسة صلاحية يستخدم لوسيفيراز مختلفة مع الطول الموجي انبعاث مختلفة.</li>
		<li>استخدم البيانات لتحديد قيم IC50 لكل مركب بواسطة منحنى يتناسب مع البيانات إلى معادلة منحنى 4 معلمات مناسبة: Y = ((A-D)/(1+((x/C)^B))) + D يجب تقييد القيم الرقمية D و A في عملية تركيب المنحنى: D = القيمة الإنارة على محور ص للحصول على الحد الأدنى من المنحنى غير المكتئب أو الحد الأدنى من المستوى النظري للاستجابة المتوقع من مقايسة الإكمال eIF4E:4G. A = قيمة الإنارة على محور Y للحصول على أقصى قدر من المنحنى غير المكتئب أو استجابة المستوى النظري الأقصى المتوقعة من مقايسة التكامل eIF4E:4G. ملاحظة: يتم اشتقاق قيمة الاستجابة الأدنى من علاج التحكم DMSO (v/v) 1٪ ويتم اشتقاق قيمة الاستجابة القصوى من الاستجابة القصوى لمثبط mTOR عالي التقارب الذي استقر دون أي تأثير على صلاحية الخلية.</li>
	</ol></li>
</ol>2. ربط eIF4E: eIF4G604-646 تثبيط المقايسة مع اضطراب eIF4F المعقدة في الخلايا
<ol><li>للتأكد من أن الإشارة التي يتم قياسها بالتقييس تتوافق مع التعطيل المادي لتفاعل eIF4E-eIF4G من قبل المركب ، خلايا البذور كما هو موضح في الخطوة 1.1.</li>
	<li>في اليوم التالي، استبدل الوسط ب 1 مل من متوسط المصل المخفض الذي لا يحتوي على الفينول الأحمر واحتضانه لمدة 4 ساعة مع مركب الفائدة. ضمان تركيز DMSO المتبقي بنسبة 1٪ (v/v) في حجم إجمالي قدره 1 مل. ملاحظة: من أجل السماح بسهولة ارتباط مع النتيجة, استخدام تركيزات مركب في بداية, نقطة الوسط ونقطة النهاية من قياس الاستكمال المقايسة منحنى المعايرة.</li>
	<li>خلايا الليس وأداء M7GTP سحب لأسفل لعزل eIF4F و eIF4E: 4EBP1 المجمعات. ويمكن الاطلاع على إجراءات مفصلة حول كيفية تنفيذ M7GTP سحب أسفل التجربة في مكان آخر14.</li>
	<li>الكشف عن M7GTP ملزمة eIF4G, eIF4E و 4EBP1 مستويات البروتين عن طريق تحليل لطخة الغربية, ومن ثم ترتبط تعطل eIF4F المعقدة مع تثبيط إشارة المقايسة التكميلية.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+cancer.">Translational control in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 10 (4), 254-266 (2010).</li><li>Gebauer, F., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Mechanism+of+translational+control.">Molecular Mechanism of translational control.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 827-835 (2004).</li><li>Bhat, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+translation+machinery+in+cancer.">Targeting the translation machinery in cancer.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 14 (4), 261-278 (2015).</li><li>Pelletier, J., Graff, J., Ruggero, D., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+eIF4F+translation+initiation+complex:+a+critical+nexus+for+cancer+development.">Targeting the eIF4F translation initiation complex: a critical nexus for cancer development.</a> Cancer Research. 75 (2), 250-263 (2015).</li><li>Montanaro, L., Pandolfi, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+mRNA+translation+in+oncogenesis:+the+role+of+eIF4E.">Initiation of mRNA translation in oncogenesis: the role of eIF4E.</a> Cell Cycle. 11, 1387-1389 (2004).</li><li>Merrick, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=eIF4E:+A+retrospective.">eIF4E: A retrospective.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (40), 24091-24099 (2015).</li><li>Marcotrigiano, J., Gingras, A. C., Sonenberg, N., Burley, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap-dependent+translation+initiation+in+eukaryotes+is+regulated+by+a+molecular+mimic+of+eIF4G.">Cap-dependent translation initiation in eukaryotes is regulated by a molecular mimic of eIF4G.</a> Molecular Cell. 3 (6), 707-716 (1999).</li><li>Umenaga, Y., Paku, K. S., In, Y., Ishida, T., Tomoo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+function+of+the+second+eIF4E-binding+region+in+N-terminal+domain+of+eIF4G:+comparison+with+eIF4E-binding+protein.">Identification and function of the second eIF4E-binding region in N-terminal domain of eIF4G: comparison with eIF4E-binding protein.</a> Biochemical and Biophysical Research Communication. 414 (3), 462-467 (2011).</li><li>Gr&#252;ner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Structures+of+eIF4E-eIF4G+Complexes+Reveal+an+Extended+Interface+to+Regulate+Translation+Initiation.">The Structures of eIF4E-eIF4G Complexes Reveal an Extended Interface to Regulate Translation Initiation.</a> Molecular Cell. 64 (3), 467-479 (2016).</li><li>Gingras, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+phosphorylation+of+the+translation+inhibitor+4E-BP1.">Hierarchical phosphorylation of the translation inhibitor 4E-BP1.</a> Genes and Development. 15 (21), 2852-2864 (2001).</li><li>Dixon, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoLuc+Complementation+Reporter+Optimized+for+Accurate+Measurement+of+Protein+Interactions+in+Cells.">NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells.</a> ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).</li><li>Sun, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR+kinase+inhibitors+as+potential+cancer+therapeutic+drugs.">mTOR kinase inhibitors as potential cancer therapeutic drugs.</a> Cancer Letters. 340 (1), 1-8 (2013).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocols in Immunology. , (2001).</li><li>Sekiyama, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+of+the+dual+activity+of+4EGI-1:+Dissociating+eIF4G+from+eIF4E+but+stabilizing+the+binding+of+unphosphorylated+4E-BP1.">Molecular mechanism of the dual activity of 4EGI-1: Dissociating eIF4G from eIF4E but stabilizing the binding of unphosphorylated 4E-BP1.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 112 (30), e4036-e4045 (2015).</li><li>Muller, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4E-BP+restrains+eIF4E+phosphorylation.">4E-BP restrains eIF4E phosphorylation.</a> Translation. 1 (2), e25819 (2013).</li><li>Frosi, Y., Usher, R., Lian, D. T. G., Lane, D. P., Brown, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+flux+in+signalling+pathways+through+measurements+of+4EBP1-mediated+eIF4F+complex+assembly.">Monitoring flux in signalling pathways through measurements of 4EBP1-mediated eIF4F complex assembly.</a> BMC Biology. (1), 40 (2019).</li><li>Ran, X., Gestwicki, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+protein-protein+interactions+(PPIs):+An+analysis+of+scaffold+choices+and+buried+surface+area.">Inhibitors of protein-protein interactions (PPIs): An analysis of scaffold choices and buried surface area.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 44, 75-86 (2018).</li></ol>

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

تستخدم الطريقة الموضحة في هذه المقالة م المقايسة التكميلية المستندة إلى لوسيفيراز لرصد التجميع المعقد eIF4F كميا من خلال القياس المباشر لتفاعل eIF4G-eIF4E في الخلايا الحية. لقد قدمنا تفاصيل لاستخدام نظام إكمال eIF4E-eIF4G وأظهرنا أيضا أن النظام دقيق للغاية في قياس التفكك بوساطة 4EBP1 الناجم عن المخدرات للتفاعل eIF4E-eIF4G16. من أجل تسهيل الإنتاجية لهذا المقايسة، تم تصميم الإعداد التجريبي الموصوف في هذه المقالة لاستخدام تنسيق 96 microplate جيدا.
للحصول على أفضل النتائج، ينبغي النظر في خطوتين حاسمتين عند إجراء الفحص. أولا، ينبغي أن تظل كفاءة العدوى بين التجارب متشابهة. ويمكن ضمان ذلك من خلال استخدام خلايا عدد المرور المنخفض، ومن خلال عد الخلايا بدقة في يوم البذر. وينبغي أيضا تقييم التقاء الخلايا قبل إجراء نقل الحمض النووي، حيث لا ينصح بإصابة الخلايا مع كاشف العدوى القائم على الدهون إذا كان التقاء الخلايا أقل من 70-90٪. ثانيا، من المهم مضاعفة المقايسة التكميلية مع اختبار صلاحية الخلية. قد تؤثر بعض المركبات على إشارة لوسيفيراز في المقام الأول عن طريق تقليل عدد الخلايا القابلة للحياة من خلال الآثار الضارة. ولذلك، من المهم قياس صلاحية الخلية مباشرة بعد إجراء اختبار الاستكمال eIF4E:eIF4G604-646 لمعالجة الآثار غير المستهدفة وغير المحددة.
واجهات البروتين والبروتين، مثل واحد بين eIF4E و eIF4G، التي تخلو من الشقوق الكارهة للماء وكبيرة نسبيا وبلانار، تعتبر عموما أن تكون "غير مخدرة" من قبل العلاجية جزيء صغير التقليدية (< 500 ميغاواط)17. وبالتالي، هناك اهتمام متزايد في تطوير طرائق جديدة تتفاعل بكفاءة مع هذا النوع من السطوح (مثل المركبات الكلية الكيسية والبيبتيدوميميتيك). ومع ذلك ، فإن العديد من هذه الطرائق الجديدة ليست قادرة بشكل فطري على عبور غشاء الخلية وإشراك هدفها. وللالتفاف على هذه القضايا، تجري العديد من مجموعات البحث أبحاثا حول تحسين المواد الكيميائية الجديدة واستراتيجيات توصيل الخلايا. ونحن نتصور أن eIF4E:eIF4G604-646 فحص PPI الخلية الحية وغيرها من المقايسات المماثلة PPI المستمدة سوف تلعب دورا محوريا في تعزيز هذه الاستراتيجيات والتحقق من صحتها.

تلعب السيطرة على التعبير الجيني دورا محوريا في التنفيذ الصحيح للبرامج الخلوية مثل انتشار النمو والتمايز. يمكن أن تمارس آلية الرقابة التنظيمية إما على مستوى النسخ الجيني أو على مستوى ترجمة الحمض النووي الريبي. في العقد الماضي ، أصبح من الواضح بشكل متزايد أن التحكم التحويلي عن طريق تعديل عملية البدء بدلا من الخطوات اللاحقة للاستطالة والإنهاء يمكن أن ينظم بدقة تركيب مجموعات فرعية محددة من البروتينات التي تلعب مجموعة واسعة من الوظائف البيولوجية.
وقد تورطت زيادة ترجمة mRNAs المشاركة في البقاء على قيد الحياة، والاستجابات المضادة ل autophagic ومكافحة المبرمج في العديد من أنواع السرطان وارتبطت أيضا بشكل سببي إما تنشيط منحرفة أو أكثر من التعبير عن عوامل بدء الترجمة1.
مجمع eIF4F هو المنظم الرئيسي لبدء الترجمة. من خلال ربط هيكل الحد الأقصى على نهاية 5 'من mRNAs، eIF4F يقود التوظيف الأولي مرنا-ريبوسوم وبالتالي زيادة كفاءة الترجمة مرنا من mRNAs eukaryotic ترجمة ضعيفة2. تم الإبلاغ عن ترجمة eIF4F بوساطة من mRNAs المرتبطة بالسرطان للعديد من نماذج السرطان التي تؤوي التنشيط الشاذ لمسارات RAS /MAPK أو AKT / TOR ، مما يشير إلى أن الخلايا السرطانية ترفع eIF4F لتعزيز نشاطها المؤيد للأورام. تعطيل هذه الحلقة تغذية إلى الأمام عن طريق تثبيط تشكيل eIF4F المعقدة وبالتالي استراتيجية علاجية واعدة جدا3،4.
يتكون مجمع eIF4F من (i) eIF4E ، الوحدة الفرعية الملزمة للغطاء eIF4F التي تتفاعل مع هيكل الغطاء الموجود في UTR 5 من mRNA ، (ii) eIF4A ، وحقيبة طائرات RNA و (3) eIF4G ، بروتين السقالة الذي يتفاعل مع كل من eIF4A و eIF4E والذي يجند في نهاية المطاف 40S ribosomal subunit5. ارتباط eIF4G مع eIF4E هو خطوة الحد من معدل لتجميع المجمعات eIF4F وظيفية وينظم سلبا من قبل eIF4E ملزمة البروتينات (4EBPs، أعضاء 1 و 2 و 3))6. من خلال التنافس مع ربط eIF4G إلى eIF4E من خلال واجهة تتكون من تسلسلات ربط eIF4E الكنسية وغير الكنسية7و8و9 (منطقة تمتد aa 604-646 على eIF4E البشري) ، يقلل 4EBP من مجموعة eIF4E المشاركة بنشاط في الترجمة ومنع تشكيل eIF4F المعقد. يتم تنظيم التفاعل بين هذه التفاعلات البروتين البروتين أساسا من قبل هدف الثدييات من راباميسين (mTOR) بوساطة الفوسفور من 4EBP. على المحفزات mitogenic، mTOR الفوسفور مباشرة أعضاء الأسرة البروتين 4E-BP، وخفض ارتباطهم مع eIF4E، وبالتالي، وتعزيز التفاعل eIF4E-eIF4G وتشكيل مجمعات eIF4F وظيفية10.
على الرغم من الجهد الكبير في تطوير المركبات التي تستهدف سلامة eIF4F المعقدة ، فإن عدم وجود مقايسات تقيس التعطيل المباشر لتفاعل eIF4E-eIF4G في الخلايا الحية قد حد من البحث عن مركبات ضرب نشطة خلوية. لقد طبقنا فحص لوسيفيراز على أساس تناظري coelenterazine (على سبيل المثال، فحص التكامل القائم على Nanoluc) لمراقبة حالة سلامة eIF4F في الوقت الحقيقي من خلال تفاعل eIF4E-eIF4G. يتكون نظام بروتين مكمل لوسيفيراز من جزء بروتين 18 kDa (SubA) و 11 جزء ببتيد من الأحماض الأمينية (SubB) تم تحسينه لتحقيق الحد الأدنى من الارتباط الذاتي والاستقرار11. مرة واحدة أعرب عن منتج الانصهار مع eIF4E طول الإنسان الكامل والمجال التفاعل eIF4E من eiF4G1 الإنسان (aa 604-646)، واثنين من البروتينات التفاعل سوف تجلب SubA وS subB جزء في القرب من بعضها البعض، وسوف تحفز على تشكيل لوسيفيراز النشطة التي، في وجود خلية نفاذية الركيزة، وسوف تولد في نهاية المطاف إشارة مضيئة(الشكل 1). لقد أبلغنا في مكان آخر عن بناء وإقرار eIF4E:eIF4G604-646 نظام استكمال16.
هنا، نقوم بوصف كيف يمكن تطبيق نظام إكمال eIF4E:eIF4G604-646 (متوفر عند الطلب) لقياس اضطراب eIF4E-eIF4G بوساطة 4EBP1 بدقة في الخلايا الحية. بالإضافة إلى ذلك، فإننا نثبت فائدتها من خلال قياس آثار العديد من مثبطات mTOR التي تخضع حاليا للتجارب السريرية والأدوية العلاجية المحتملة للسرطان12. ولأن الآثار خارج الهدف غالبا ما تخفي نشاطا خاصا بالعقاقير، فإننا نصف أيضا كيف يمكن توسيع نطاق تعدد استخدامات قياس نظام eIF4E:eIF4G604-646 مع القياسات المتعامدة للقدرة على البقاء الخلوية لأخذ هذه القياسات في الاعتبار.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>293FT cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R70007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture microplate 96 well, F-Bottom</td>
			<td>greiner bio-one</td>
			<td>655083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell titer Glo 2.0</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>G9241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Envision Multilabel Reader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>not applcable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 30-300 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4662070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 5-50 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4662050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FUGENE6</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>E2692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L3000015" target="_blank">L3000015</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoBiT PPI Starter Systems</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>N2014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimem I Reduced Serum Mediun, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11058021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>not appicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#947;-Aminophenyl-m7GTP (C10-spacer)-Agarose</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>AC-155S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring eif4f assembly by measuring eif4e-eif4g interaction in live cells

وقد تبين أن تشكيل مجمع eIF4F هو العقدة الرئيسية في المصب للتقارب بين مسارات الإشارات التي غالبا ما تخضع للتنشيط على نحو غير مركب في البشر. eIF4F هو مجمع ربط الحد الأقصى المشاركة في مرحلة التوظيف مرنا-ريبوسوم من بدء الترجمة. في العديد من النماذج الخلوية وما قبل السريرية للسرطانات ، يؤدي إلغاء تحرير eIF4F إلى زيادة ترجمة مجموعات فرعية محددة من الحمض النووي الريبي تشارك في انتشار السرطان والبقاء على قيد الحياة. eIF4F هو مجمع ثلاثي التريك مبني من وحدة ربط الغطاء الفرعية eIF4E ، وeIF4A helicase والوحدات الفرعية للسقالات eIF4G. حاسمة لتجميع مجمعات eIF4F النشطة هو التفاعل البروتين البروتين بين eIF4E والبروتينات eIF4G. في هذه المقالة، نقوم بوصف بروتوكول لقياس تجميع eIF4F الذي يراقب حالة تفاعل eIF4E-eIF4G في الخلايا الحية. كما يسمح اختبار التفاعل بين البروتين البروتيني القائم على الخلايا eIF4e:4G بتقييم التغيرات الناجمة عن المخدرات في سلامة eIF4F المعقدة بدقة وموثوقية. ونحن نتصور أن هذه الطريقة يمكن تطبيقها للتحقق من نشاط المركبات المتاحة تجاريا أو لمزيد من الفحص للمركبات أو الطرائق الجديدة التي تعطل بكفاءة تشكيل مجمع eIF4F.

من أجل التحقق من صحة حساسية eIF4E:eIF4G604-646 نظام الاستكمال، تم تقييم 4EBP1 تثبيط الجمعية المعقدة eIF4F باستخدام مثبطات mTOR. عن طريق تثبيط mTORC1 كيناز الفوسفور تعتمد على الأسرة البروتين 4EBP، تثبيط mTOR يعزز ارتباط 4EBP1 إلى eIF4E، وبالتالي، eIF4F تفكيك15. تم اختبار فئتين من مثبط مختلف ميكانيكيا من kinases mTOR: rapalogs (على سبيل المثال، Rapamycin) التي هي مثبطات allosteric من mTORC1 ولكن ليس mTORC2 ومثبطات ATP القائمة على المنافسة (على سبيل المثال، PP242) التي تم تصميمها لتثبيط على وجه التحديد كل من mTORC1 و mTORC2 كيناز النشاط الحفاز.
تم تحويل خلايا HEK293 مع eIF4E:eIF4G604-646 نظام استكمال كما هو موضح في الخطوة 1. بعد 24 ساعة من العدوى، تم إعادة زرع الخلايا وعلاجها بمثبطات mTOR PP242 و rapamycin (كما هو موضح في الخطوة 1.2). بعد أربع ساعات من العلاج، تم تقييم التلألؤ، كما هو موضح سابقا، تليها صلاحية الخلية. وكما هو مبين في الشكل 2، تنتج PP242 تثبيط تعتمد على الجرعة للإشارة مع IC50 محسوبة من 0.72 ± 0.04 ميكرومتر ، في حين يتم اشتقاق IC50 من 6.88 ± 0.88 ميكرومتر لراباميسين (الشكل 2A). لوحات ثم متعددة لقابلية البقاء الخلوية المقايسة (الشكل 2D). ويبين هذا التحليل أن لا PP242 ولا rapamycin تنتج انخفاضا كبيرا في صلاحية الخلية، مما يثبت أن الانخفاض في التلألؤ في eIF4E:eIF4G604-646 نظام استكمال ليس بسبب وفاة الخلية غير محددة ولكن بدلا من ذلك من خلال تعطيل التفاعل eIF4E:4G.
M7GTP سحب أسفل التجربة التي أجريت عن طريق احتضان الخلايا غير المصابة مع تركيزات مركبة التي تتوافق مع نقاط البداية والمتوسطة والنهاية من منحنى المعايرة المقاسة في الشكل 2A تظهر أن اضطراب 4EBP1 بوساطة من التفاعل eIF4E-eIF4G الذاتية يرتبط مع قياس eIF4E:eIF4G604-646 إشارة التماثل (الشكل 2B, 2C). بما يتفق مع هذه النتائج، يظهر PP242 أن يكون مثبط أكثر فعالية من مجموع الفوسفور 4EBP1 من راباميسين في ظل الظروف التجريبية التي تم اختبارها في خلايا HEK 293 (الشكل 3A)،في حين أظهرت كل من المثبطات تأثير على إشارات mTOR عادة، مع راباميسين يجري أكثر نشاطا ضد ركائز mTORC1 وPP242 تستهدف كل من mTORC1 و mTORC2 (الشكل 3B).
وأظهرت هذه النتائج مجتمعة أن PP242 هو أكثر فعالية في تعطيل تشكيل eIF4F المعقدة من راباميسين في خلايا HEK293 ومزيد من إثبات أن eIF4E:eIF4G604-646 نظام يمكن قياس بدقة eIF4F التجميع المعقد في الخلايا الحية.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60850/60850fig1.jpg"> الشكل 1: eIF4E:eIF4G604-646 نظام الاستكمال. تمثيل تخطيطي يبين كيف أن تفاعل البروتين X (eIF4E) والبروتين Y (eIF4G604-646)يمكن اندماجات SubA و SubB من الاقتراب من بعضها البعض وإعادة تشكيل لوسيفيراز النشط. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/60850/60850fig1large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60850/60850fig2.jpg"> الشكل 2: تعطيل مجمع eIF4F بوساطة 4EBP1. (أ)PP242 و rapamycin eIF4E:eIF4G604-646 المقايسة المعايرة نمذجة التفاعل بين eIF4E و eIF4G في خلايا HEK 293 المصابة. (B, C) تحليل لطخة الغربية التي تبين المستوى الداخلي من eIF4E، eIF4G و 4EBP1 في مقتطفات HEK 293 وفي M7GTP سحب أسفل بعد حضانة الخلايا المستزرعة مع تركيز مختلف من PP242 أو راباميسين على التوالي. (د)الخلايا المعالجة في A حيث تم تقييم تعدد مرات بقاء الخلية والتلألؤ. تمثل كافة القيم متوسط ± SD (n = 3). وقد تم تعديل هذا الرقم من16. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/60850/60850fig2large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60850/60850fig3.jpg"> الشكل 3: التأثير التفاضلي لتثبيط mTOR على 4EBP1 phoshorylation. (أ)تحليل لطخة الغربية لحالة الفوسفور من 4EBP1 في خلايا HEK293 غير المصابة تعامل مع تركيز المشار إليها من PP242 وراباميسين. (ب)تحليل لطخة الغربية من حالة الفوسفور AKT و S6 في خلايا HEK293 غير المصابة تعامل إما مع مثبطات الموقع النشط MTORC1/2 المزدوج PP242، أو مثبط الألستيريك من mTORC1 Rapamycin. تم تصور بيتا أكتين للتحكم في التحميل وكذلك إجمالي 4EBP1 و AKT و S6. وقد تم تعديل هذا الرقم من16. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/60850/60850fig3large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells at JoVE.com

Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells

هنا ، نقدم بروتوكولا لقياس تفاعل eIF4E-eIF4G في الخلايا الحية من شأنه أن يمكن المستخدم من تقييم الاضطراب الناجم عن المخدرات للديناميكيات المعقدة eIF4F في أشكال الفحص.

مراقبة تجميع eIF4F من خلال قياس تفاعل eIF4E-eIF4G في الخلايا الحية

Formation of the eIF4F complex has been shown to be the key downstream node for the convergence of signalling pathways that often undergo&#160;oncogenic ...

monitoring-eif4f-assembly-measuring-eif4e-eif4g-interaction-live

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Cancer Research

3.0K Views.  A*STAR (Agency for Science, Technology and Research). هنا ، نقدم بروتوكولا لقياس تفاعل eIF4E-eIF4G في الخلايا الحية من شأنه أن يمكن المستخدم من تقييم الاضطراب الناجم عن المخدرات للديناميكيات المعقدة eIF4F في أشكال الفحص.

Video: Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells

Live Imaging to Study Microtubule Dynamic Instability in Taxane-resistant Breast Cancers

Taxanes such as docetaxel belong to a group of microtubule-targeting agents (MTAs) that are commonly relied upon to treat cancer. However, taxane resistance in cancerous cells drastically reduces the effectiveness of the drugs' long-term usage. Accumulated evidence suggests that the mechanisms underlying taxane resistance include both general mechanisms, such as the development of multidrug resistance due to the overexpression of drug-efflux proteins, and taxane-specific mechanisms, such as those that involve microtubule dynamics. 
Because taxanes target cell microtubules, measuring microtubule dynamic instability is an important step in determining the mechanisms of taxane resistance and provides insight into how to overcome this resistance. In the experiment, an in vivo method was used to measure microtubule dynamic instability. GFP-tagged &#945;-tubulin was expressed and incorporated into microtubules in MCF-7 cells, allowing for the recording of the microtubule dynamics by time lapse using a sensitive camera. The results showed that, as opposed to the non-resistant parental MCF-7CC cells, the microtubule dynamics of docetaxel-resistant MCF-7TXT cells are insensitive to docetaxel treatment, which causes the resistance to docetaxel-induced mitotic arrest and apoptosis. This paper will outline this in vivo method of measuring microtubule dynamic instability.

In this paper, we report a protocol describing an in vivo method to measure microtubule dynamic instability in docetaxel-resistant breast cancer cells (MCF-7TXT). In this method, a deconvolution microscopy imaging system is used to detect the expression of GFP-tubulin in target cells.

تصوير لايف لدراسة أنيبيب عدم الاستقرار الديناميكي في سرطان الثدي المقاومة للالتاكسين

Taxanes such as docetaxel belong to a group of microtubule-targeting agents (MTAs) that are commonly relied upon to treat cancer. However, taxane ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric antigen receptor (CAR) redirected T cells obtained the most spectacular results, in particular with pediatric B-acute lymphoblastic leukemia (B-ALL). Classical validation methods of CAR T cells rely on the use of specificity and functionality assays of the CAR T cells against target cells in suspension and in xenograft models. Unfortunately, observations made in vitro are often decoupled from results obtained in vivo and a lot of effort and animals could be spared by adding another step: the use of 3D culture. The production of spheroids out of potential target cells that mimic the 3D structure of the tumor cells when they are engrafted into the animal model represents an ideal alternative. Here, we report an affordable, reliable and easy method to produce spheroids from a transduced colorectal cell line as a validation tool for adoptive cell therapy (exemplified here by CD19 CAR T cells). This method is coupled with an advanced live imaging system that can follow spheroid growth, effector cells cytotoxicity and tumor cell apoptosis.

This protocol is designed to assess immunotherapeutic redirected T-cell (CAR T-cell) cytotoxicity against 3D structured cancerous cells (spheroids) in real time.

مقايسة قتل كروي من خلايا تي السيارة

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular sub-classification and temporal monitoring of tumor response to therapy. Here, we describe our dPCR-based method for the detection of tumor somatic mutations in cell free DNA (cfDNA), readily available in&#160;patient biofluids. Although limited in the number of mutations that can be tested for in each assay, this method provides a high level of sensitivity and specificity. Monitoring of mutation abundance, as calculated by MAF, allows for the evaluation of tumor response to therapy, thereby providing a much-needed supplement to radiographic imaging.

Here, we present a protocol to detect tumor somatic mutations in circulating DNA present in patient biological fluids (biofluids). Our droplet digital polymerase chain reaction (dPCR)-based method enables quantification of the tumor mutation allelic frequency (MAF), facilitating a minimally invasive complement to diagnosis and temporal monitoring of tumor response.

الكشف عن ورصد الورم المرتبطة تعميم الحمض النووي في Biofluids المريض

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL of blood) warrant a poor prognosis and are correlated with shorter overall survival in several cancers (e.g., breast, prostate and colorectal). Currently, the anti-EpCAM-coated magnetic bead-based CTC capturing system is the gold standard test approved by the U.S. Food and Drug Administration (FDA) for enumerating CTCs in the bloodstream. This test is based on the use of magnetic beads coated with anti-EpCAM markers, which specifically target epithelial cancer cells. Many studies have illustrated that EpCAM is not the optimal marker for CTC detection. Indeed, CTCs are a heterogeneous subpopulation of cancer cells and are able to undergo an epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) associated with metastatic proliferation and invasion. These CTCs are able to reduce the expression of cell surface epithelial marker EpCAM, while increasing mesenchymal markers such as vimentin. To address this technical hurdle, other isolation methods based on physical properties of CTCs have been developed. Microfluidic technologies enable a label-free approach to CTC enrichment from whole blood samples. The spiral microfluidic technology uses the inertial and Dean drag forces with continuous flow in curved channels generated within a spiral microfluidic chip. The cells are separated based on the differences in size and plasticity between normal blood cells and tumoral cells. This protocol details the different steps to characterize the programmed death-ligand 1 (PD-L1) expression of CTCs, combining a spiral microfluidic device with customizable immunofluorescence (IF) marker set.

The characterization of circulating tumor cells (CTCs) is a popular topic in translational research. This protocol describes a semi-automatic immunofluorescence (IF) assay for PD-L1 characterization and enumeration of CTCs in non-small cell lung cancer (NSCLC) patient samples.

شبه التلقائي PD-L1 توصيف وتعداد الخلايا السرطانية المتداولة من غير الصغيرة خلية سرطان الرئة المرضى عن طريق الفلورة المناعية

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a malignant brain tumor with no cure, has up to a half the tumor mass TAMs. TAMs can be pro-tumoral or anti-tumoral, depending on the activation of specific genes in the cells. Genetic mutations in the tumors, through regulating cytokine expression, can affect recruitment of TAMs to the tumor microenvironment. Here, we describe a quantitative cell-based assay to assess macrophage recruitment by the conditioned medium from the tumor cells. This assay uses the human macrophage cell line MV-4-11 to study macrophage attraction by the conditioned medium from glioblastoma, allowing for high reproducibility and low variability. Data generated with this assay can contribute to a better understanding of the interaction between the tumor and the tumor microenvironment. Similar assay can be used to assess interaction between the tumor cells and other immune cells, including T cells and natural killer (NK) cells.

This article represents a useful in vitro assay to evaluate the capability of conditioned medium from tumor cells to attract macrophages.

في المختبر الاختبار لدراسة التفاعل الورم الضامة

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited number of assays allow for direct monitoring and mechanistic insights into the interactions between tumor and immune cells, amongst which, T-cells play a significant role in executing the cytotoxic response of the adaptive immune system to cancer cells. Most assays are based on two-dimensional (2D) co-culture of cells due to the relative ease of use but with limited representation of the invasive growth phenotype, one of the hallmarks of cancer cells. Current three-dimensional (3D) co-culture systems either require special equipment or separate monitoring for invasion of co-cultured cancer cells and interacting T-cells.
Here we describe an approach to simultaneously monitor the invasive behavior in 3D of cancer cell spheroids and T-cell cytotoxicity in co-culture. Spheroid formation is driven by enhanced cell-cell interactions in scaffold-free agarose microwell casts with U-shaped bottoms. Both T-cell co-culture and cancer cell invasion into type I collagen matrix are performed within the microwells of the agarose casts without the need to transfer the cells, thus maintaining an intact 3D co-culture system throughout the assay. The collagen matrix can be separated from the agarose cast, allowing for immunofluorescence (IF) staining and for confocal imaging of cells. Also, cells can be isolated for further growth or subjected to analyses such as for gene expression or fluorescence activated cell sorting (FACS). Finally, the 3D co-culture can be analyzed by immunohistochemistry (IHC) after embedding and sectioning. Possible modifications of the assay include altered compositions of the extracellular matrix (ECM) as well as the inclusion of different stromal or immune cells with the cancer cells.

The presented approach simultaneously evaluates cancer cell invasion in 3D spheroid assays and T-cell cytotoxicity. Spheroids are generated in a scaffold-free agarose multi-microwell cast. Co-culture and embedding in type I collagen matrix are performed within the same device which allows to monitor cancer cell invasion and T-cell mediated cytotoxicity.

رصد غزو الخلايا السرطانية والسمية الخلوية للخلايا T-Cell في الثقافة ثلاثية الأبعاد

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile conditions. Different tests seek to identify and quantify these hallmarks of cancerous cells; however, they often focus on a single aspect of cellular transformation and, in fact, multiple tests are required for their proper characterization. The purpose of this work is to provide researchers with a set of tools to assess cellular transformation in vitro from a broad perspective, thereby making it possible to draw sound conclusions.
A sustained proliferative signaling activation is the major feature of tumoral tissues and can be easily monitored under in vitro conditions by calculating the number of population doublings achieved over time. Besides, the growth of cells in 3D cultures allows their interaction with surrounding cells, resembling what occurs in vivo. This enables the evaluation of cellular aggregation and, together with immunofluorescent labeling of distinctive cellular markers, to obtain information on another relevant feature of tumoral transformation: the loss of proper organization. Another remarkable characteristic of transformed cells is their capacity to grow without attachment to other cells and to the extracellular matrix, which can be evaluated with the anchorage assay.
Detailed experimental procedures to evaluate cell growth rate, to perform immunofluorescent labeling of cell lineage markers in 3D cultures, and to test anchorage-independent cell growth in soft agar are provided. These methodologies are optimized for Breast Primary Epithelial Cells (BPEC) due to its relevance in breast cancer; however, procedures can be applied to other cell types after some adjustments.

This protocol provides experimental in vitro tools to evaluate the transformation of human mammary cells. Detailed steps to follow-up cell proliferation rate, anchorage-independent growth capacity, and distribution of cell lineages in 3D cultures with basement membrane matrix are described.

في المختبر تقييم التحول Oncogenic في الخلايا الظهارية ماماري الإنسان

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

A Three-Dimensional Spheroid Model to Investigate the Tumor-Stromal Interaction in Hepatocellular Carcinoma

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver cancer, rationalize its rank as the second most common cause of cancer-related death. Preclinical models need to be adapted to recapitulate the human conditions to select the best therapeutic candidates for clinical development and aid the delivery of personalized medicine. Three-dimensional (3D) cellular spheroid models show promise as an emerging in vitro alternative to two-dimensional (2D) monolayer cultures. Here, we describe a 3D tumor spheroid&#160;model which exploits the ability of individual cells to aggregate when maintained in hanging droplets, and is more representative of an in vivo environment than standard monolayers. Furthermore, 3D spheroids can be produced by combining homotypic or heterotypic cells, more reflective of the cellular heterogeneity in vivo, potentially enabling the study of environmental interactions that can influence progression and treatment responses. The current research optimized the cell density to form 3D homotypic and heterotypic tumor spheroids by immobilizing cell suspensions on the lids of standard 10 cm3 Petri dishes. Longitudinal analysis was performed to generate growth curves for homotypic versus heterotypic tumor/fibroblasts spheroids. Finally, the proliferative impact of fibroblasts (COS7 cells) and liver myofibroblasts (LX2) on homotypic tumor (Hep3B) spheroids was investigated. A seeding density of 3,000 cells (in 20 &#181;L media) successfully yielded Huh7/COS7 heterotypic spheroids, which displayed a steady increase in size up to culture day 8, followed by growth retardation. This finding was corroborated using Hep3B homotypic spheroids cultured in LX2 (human hepatic stellate cell line) conditioned medium (CM). LX2 CM triggered the proliferation of Hep3B spheroids compared to control tumor spheroids. In conclusion, this protocol has shown that 3D tumor spheroids can be used as a simple, economical, and prescreen in vitro tool to study tumor-stromal interactions more comprehensively.

Comprehensive in vitro models that faithfully recapitulate the relevant human disease are lacking. The current study presents three-dimensional (3D) tumor spheroid creation and culture, a reliable in vitro tool to study the tumor-stromal interaction in human hepatocellular carcinoma.

نموذج كروي ثلاثي الأبعاد للتحقيق في التفاعل الورمي-السترومالي في سرطان الكبد

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver ...

Modeling Brain Metastasis by Internal Carotid Artery Injection of Cancer Cells

Brain metastasis is a cause of severe morbidity and mortality in cancer patients. Critical aspects of metastatic diseases, such as the complex neural microenvironment and stromal cell interaction, cannot be entirely replicated with in vitro assays; thus, animal models are critical for investigating and understanding the effects of therapeutic intervention. However, most brain tumor xenografting methods do not produce brain metastases consistently in terms of the time frame and tumor burden. Brain metastasis models generated by intracardiac injection of cancer cells can result in unintended extracranial tumor burden and lead to non-brain metastatic morbidity and mortality. Although intracranial injection of cancer cells can limit extracranial tumor formation, it has several caveats, such as the injected cells frequently form a singular tumor mass at the injection site, high leptomeningeal involvement, and damage to brain vasculature during needle penetration. This protocol describes a mouse model of brain metastasis generated by internal carotid artery injection. This method produces intracranial tumors consistently without the involvement of other organs, enabling the evaluation of therapeutic agents for brain metastasis.

Brain metastasis is a cause of severe morbidity and mortality in cancer patients. Most brain metastasis mouse models are complicated by systemic metastases confounding analysis of mortality and therapeutic intervention outcomes. Presented here is a protocol for internal carotid injection of cancer cells that produces consistent intracranial tumors with minimal systemic tumors.

نمذجة ورم خبيث في الدماغ عن طريق حقن الشريان السباتي الداخلي للخلايا السرطانية

Brain metastasis is a cause of severe morbidity and mortality in cancer patients. Critical aspects of metastatic diseases, such as the complex neural ...

Multiparametric Tumor Organoid Drug Screening Using Widefield Live-Cell Imaging for Bulk and Single-Organoid Analysis

Patient-derived tumor organoids (PDTOs) hold great promise for preclinical and translational research and predicting the patient therapy response from ex vivo drug screenings. However, current adenosine triphosphate (ATP)-based drug screening assays do not capture the complexity of a drug response (cytostatic or cytotoxic) and intratumor heterogeneity that has been shown to be retained in PDTOs due to a bulk readout. Live-cell imaging is a powerful tool to overcome this issue and visualize drug responses more in-depth. However, image analysis software is often not adapted to the three-dimensionality of PDTOs, requires fluorescent viability dyes, or is not compatible with a 384-well microplate format. This paper describes a semi-automated methodology to seed, treat, and image PDTOs in a high-throughput, 384-well format using conventional, widefield, live-cell imaging systems. In addition, we developed viability marker-free image analysis software to quantify growth rate-based drug response metrics that improve reproducibility and correct growth rate variations between different PDTO lines. Using the normalized drug response metric, which scores drug response based on the growth rate normalized to a positive and negative control condition, and a fluorescent cell death dye, cytotoxic and cytostatic drug responses can be easily distinguished, profoundly improving the classification of responders and non-responders. In addition, drug-response heterogeneity can by quantified from single-organoid drug response analysis to identify potential, resistant clones. Ultimately, this method aims to improve the prediction of clinical therapy response by capturing a multiparametric drug response signature, which includes kinetic growth arrest and cell death quantification.

This protocol describes a semi-automated method for medium- to high-throughput organoid drug screenings and microscope-agnostic, automated image analysis software to quantify and visualize multiparametric, single-organoid drug responses to capture intratumor heterogeneity.

فحص المخدرات العضوية متعددة المعلمات للورم باستخدام تصوير الخلايا الحية واسع المجال للتحليل السائب والعضوي الفردي

Patient-derived tumor organoids (PDTOs) hold great promise for preclinical and translational research and predicting the patient therapy response from ex ...