لدينا بروتوكول لفيرو نسخها الحمض النووي الريبي القائم على luciferase المقايس يساعد على دراسة تنظيم الترجمة في الخلايا المصابة فيروس الجدري. بالإضافة إلى ذلك، يسمح طول بولي (A) لتر مخصص لدراسة آثاره التنظيمية على الترجمة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بدراسة تنظيم الترجمة من قبل عناصر رابطة الدول المستقلة مثل 5'UTR و 3'UTR في مرنا وطيف واسع من بدء الترجمة.
قد تكون مقايسة مراسل luciferase التي تستند إلى الحمض النووي الريبي في المختبر مصممة خصيصًا لدمج التعديل على الحد الأقصى والتعديل الآخر واستخدامها لاختبار التأثير على الترجمة. للبدء ، وتصميم إلى الأمام وعكس التمهيدي لتوليد ابر ابر ابر تحتوي على العناصر التالية في 5'to 3'direction : T7 - المروج ، Poly(A) liter, اليرا فيتر لوسيفيراز ORF في بولي (A) الذيل المشار إليها باسم T7_12A فلوك, وتشمل عدة نيوكليوتيدات اضافية في التمهيدي إلى الأمام تليها T7-المروج بولي (A) لتر أو المطلوب 5'UTR تسلسل وتقريرا 20 النيوكليوتيدات المقابلة ل5'نهاية من ORF الجينات مراسل. ضبط طول التمهيدي على أساس ذوبان درجة الحرارة المقابلة ل5'نهاية من مورون مراسل ORF ضمان أن المنطقة المقابلة في التمهيدي مطابقا لخيطا الإحساس من الجين.
ثم تصميم التمهيدي العكسي لتشمل بولي (A) الذيل وحوالي 20 النيوكليوتيدات. ضبط على أساس ذوبان درجة الحرارة المقابلة ل3'نهاية من ORF الجينات مراسل ضمان أن المنطقة المقابلة من التمهيدي مطابقا لخيطا antisense من الجين وتوقف في الإطار كودون موجود قبل بولي (A) الذيل. للرقابة الداخلية، تصميم مجموعة أخرى من التمهيديات التي تحتوي على العناصر التالية في 5'إلى 3'direction: T7-Promoter، وهو تسلسل الترميز 5'UTR عشوائي يحتوي على تسلسل كوزاك، رينيه لوسيفراز ORF، وبولي (A) الذيل، ويشار إلى T7_Kozak-Rluc.
لإعداد رد فعل، إضافة الكواشف بالترتيب التالي إلى أنبوب PCR: DNase المياه الحرة، 2X عالية الدقة الحمض النووي البوليمرات، التمهيديات وتسلسل أكد luciferase قالب الحمض النووي. بعد دورة PCR القياسية من ثلاث خطوات لتوليد قالب الحمض النووي، والكشف عن المنتج PCR عن طريق تشغيل 5-10٪ من تفاعل PCR في 1٪ agarose TAE هلام electrophoresis جنبا إلى جنب مع معيار الوزن الجزيئي. لتحديد حجم المنتج PCR، تصور هلام تحت إضاءة الأشعة فوق البنفسجية.
بعد تحديد الحجم الصحيح للمنتج PCR، تنقية باستخدام طقم تنقية PCR المتاحة تجاريا باستخدام 100 ميكرولترات من المياه الحرة النوى ل elute الحمض النووي. تحقق من تركيز الحمض النووي المنقى باستخدام مقياس الطيف وتخزينه عند ناقص 20 درجة مئوية للاستخدام في النسخ في المختبر على الفور. لتجميع RNA من المنتج PCR، إضافة الكواشف التالية إلى أنبوب microcentrifuge: DNase-RNase المياه الحرة، ومزيج العازلة NTP، كاب التناظرية، PCR قالب المنتج، و T7-RNA البوليميراز مزيج من في مجموعة النسخ في المختبر.
اخلطي جيداً. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة ساعتين ومن ثم المضي قدما في تنقية الحمض النووي الريبي توليفها باستخدام طقم تنقية RNA. للتحقق من الحمض النووي الريبي المنقى، سخني الحمض النووي الريبي عند 70 درجة لمدة خمس دقائق لإزالة الهيكل الثانوي وتشغيله على هلام 1.5 agarose TBE.
ثم تصور هلام تحت مضيئة الأشعة فوق البنفسجية. تحقق من تركيز الحمض النووي الريبي المنقى باستخدام مقياس الطيف الضوئي. Aliquot ذلك وتخزينها في ناقص 80 درجة مئوية.
بذور خلايا HeLa في 24 بئر لوحة لتحقيق 80-90٪ التقاء في اليوم التالي واحتضان بين عشية وضحاها في حاضنة في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. تصيب خلايا HeLa مع فيروس Vaccinia في تعدد العدوى من خمسة والحفاظ على خلايا HeLa غير المصابة للمقارنة. ثم احتضان لوحة في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 10 إلى 12 ساعة.
بعد الساعات المطلوبة بعد العدوى، مزيج 480 نانوغرام من 12A تسلسل تحمل اليراعات Luciferase مرنا و 20 نانوغرام من تسلسل كوزاك تحمل رينيه لوسيفراز مرنا في أنبوب واحد microcentrifuge. في أنبوب آخر microcentrifuge، إضافة 1.1 ميكرولترات من مُكشف نقل الدهون الموجبة. إضافة 55 ميكرولترات من وسائل الإعلام المصل خفضت إلى كل من الأنابيب، مزيج واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.
ثم إضافة 55 microliters مبيد الدهون الموجبة transfection التي تحتوي على وسائل الاعلام المصل مخفضة لممر RNA التي تحتوي على أنبوب. تخلط بلطف ولكن بدقة مع ماصة واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. أثناء الحضانة، وإزالة متوسطة ثقافة الخلية من الخلايا وإضافة 400 ميكرولترات من متوسطة المصل المخفضة في البئر.
عند الانتهاء من الحضانة، إضافة 100 ميكرولترات من الخليط قطرة الحكمة وبصفة في بئر من 24 لوحة جيدا. خمس ساعات بعد المشاركة مع 12A فلوك وكوزاك Rluc مرنا، وإزالة متوسطة المصل خفضت من الخلايا وlyse الخلايا عن طريق إضافة 150 ميكرولترس 1X تحلل العازلة من مجموعة المقايسة لوسيفرايز قادرة على أداء اثنين من المقايسات مراسل. بعد احتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، كشط الخلايا باستخدام حقنة مطاطية ومعقمة ونقلها إلى أنبوب microcentrifuge.
إلى بيليه خلية الحطام، الطرد المركزي في 12، 000 مرات ز لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية. نقل 30 ميكرولترات من السوبر في بئر من لوحة مُعَرَضِة مُبَرَّحة 96 مُعَلَّمَة بيضاءً أيضاً مع قاع صلب. استخدم مجموعة أدوات فحص Luciferase ومقياس إضاءة قارئ لوحة متعدد المستويات لقياس الإنارة المزدوجة باستخدام وظيفة الحركية كما هو موضح في المخطوطة.
بعد تصدير بيانات قراءة الإنارة إلى تنسيق ملف مرغوب فيه، تحديد معدل الترجمة النسبية من 12A Fluc مرنا في خلايا HeLA المصابة بفيروس VACV عن طريق تقسيم قيمة Fluc على قيمة Rluc التحكم الداخلي. وقد استخدم هذا الفحص لاختبار كفاءة الترجمة من مرنا فلوك الذي يحتوي على 5'بولي (A) لتر في الخلايا المصابة غير المصابة وVACV. وقد نجحت الخلايا غير المصابة والخلايا المصابة بفيروس VACV في الإصابة بـ Fluc وRluc mRNA.
تقسيم فلوك من قبل Rluc تطبيع كفاءة transfection في استقرار الحمض النووي الريبي في الخلايا. 5'بولي (A) لتر يحتوي على مرنا لديه ميزة الترجمة أثناء عدوى VACV مقارنة بالخلايا غير المصابة. ولم يكن ذلك بسبب اختلاف كفاءة النقل أو استقرار الحمض النووي الريبي لأن مستوى الحمض النووي الريبي النووي كان مماثلاً في الخلايا غير المصابة وVACV المصابة خمس ساعات بعد عدوى مرنا.
اتخاذ عناية خاصة عند تصميم التمهيديات لأن هذا يمكن أن تؤثر ليس فقط على كفاءة تفاعل PCR ولكن أيضا جميع العمليات المصب التي تتطلب الحمض النووي تضخيمها. هذه الطريقة هي اختبار مهم لاختبار تنظيم الترجمة بسرعة من قبل عناصر Cis. وينبغي، إن أمكن، أن تُدعم هذه الطريقة بتجارب تكميلية أخرى.
وينبغي اتخاذ الاحتياطات أثناء استخدام فيروس فاتشينيا وتجنب التعرض للمواد الكيميائية مثل بروميد الإثيديوم والفينول.
