يوفر هذا الإجراء الوصول الضوئي المتكرر إلى قرن آمون الظهر من الفئران الحية لدراسة آليات تكوين الذاكرة والتذكير أثناء أداء المهام التعليمية. هذه التقنية تسمح باستخدام المجهر الخفيف لدراسة الحصين الظهري من الفئران الحية على مستوى ميكرومتر دقة فضائية طولي على مدى عدة أسابيع. فقدان الذاكرة هو السمة المميزة العامة لبعض أمراض الدماغ مثل مرض الزهايمر.
يمكن أن يساعد فهم آلية تكوين الذاكرة والتذكير في نهاية المطاف المرضى الذين يعانون من هذه الأمراض. ويمكن تطبيق هذه الطريقة على أنظمة حيوانية أخرى ذات جمجمة مثل الثدييات الصغيرة. يمكن أن يكون رصد العلامات الحيوية أثناء جراحة البقاء على قيد الحياة تشتيتًا ومجهدًا.
قد يكون من المفيد أن إجراء الإجراء أولاً على ميت من أجل التركيز على الجوانب الأكثر أهمية من الإجراء. لإعداد كانية التصوير، قطع أولا أنبوب الفولاذ المقاوم للصدأ قطره ثلاثة ملليمترات إلى حلقة معدنية طولها 1.6 ملليمتر. إذا كانت حواف الحلبة ليست حادة بعد قطع، ملف من المخالفات.
بعد ذلك، استخدم زوجًا من ملقط لتراجع جانب واحد من الحلقة المعدنية في لاصقة بصرية للأشعة فوق البنفسجية. ثم ضع الحلقة المعدنية في مركز غطاء زجاجي مع جانب الحلقة مغطى لاصقة لمس الغطاء. بدوره على معالج الأشعة فوق البنفسجية LED وحدة سائق وتألق 365 نانومتر الطول الموجي الضوء على لاصقة لمدة دقيقة واحدة لعلاج لاصقة.
تأكد من أن جميع جوانب الحلقة مضاءة بنفس القدر عن طريق تغيير اتجاه مصدر الضوء. بعد أن تصلب لاصق لمدة ساعتين على الأقل، عقد بحزم كانية من الطرف المفتوح للحلقة المعدنية عن طريق الهيموستات. باستخدام حفر الأسنان مزودة ملف الدورية، ملف قبالة غطاء الزجاج الزائد حتى يتم مسح مع الجانبين من الحلبة.
إعداد الأدوات المطلوبة و التخدير الماوس كما هو موضح في بروتوكول النص المرافق. ثم إزالة الشعر وتطهير الجلد على رأس الماوس. بعد ذلك، استخدم المقص والملقط لإجراء قطع صغير في فروة الرأس في الوضع القريب من لامدا.
التحرك في اتجاه الأذنين في اتجاه الآذان ثم في اتجاه مدارات العين لتشكيل مثلث على محور القوس ما يقرب من أربعة ملليمترات من المروس إلى البريغما. ضع قطرة واحدة من الليدوكائين على الجمجمة. بعد دقيقتين، مسح periosteum وتجفيف الجمجمة باستخدام مسحة القطن.
ثم ضع قضبان الأذن لإصلاح رأس الماوس. باستخدام حفر ميكرو مع 0.5 ملليمتر عرض بور، وجعل ثقب صغير في العظام الأمامية مقابل الحصين صورة ما يقرب من 1.5 ملليمتر من خياطة القوس واثنين ملليمتر من خياطة التاجية. ثم المسمار 0.86 ملليمتر عرض الفولاذ المقاوم للصدأ برغي العظام في حفرة الجمجمة.
تأمينه في مكانه باستخدام الأسمنت اللاصق. دع الإسمنت يجف لمدة 30 ثانية إلى دقيقة. بعد ذلك ، استخدم حفر التريبين قطره ثلاثة ملليمترات لصنع ثقب صغير في العظام الجدارية.
ضع الثقب حوالي 1.5 ملليمتر من خياطة القوس واثنين ملليمتر من خياطة لامدويد. إزالة بعناية رفرف العظام. ثم إزالة السحايات باستخدام ملقط Dumont.
اختصر المادة القشرية للوصول إلى الكبسولة الخارجية. استخدام إبرة حادة قياس 19 متصلا مضخة فراغ والري مع المالحة لتجنب جفاف الأنسجة المكشوفة وجرف أي دم المتبقية بعد حل النزيف. تمتص الأنسجة القشرية ببطء حوالي 50 إلى 100 ميكرون في وقت ما حتى تنفصل القشرة من الكبسولة التي تعرض ألياف cingulum أو الكالوسوم الجسم.
ثم بعناية قشر الألياف الظهرية حتى أعمق الألياف، يتم كشف الحويصلات من قرن آمون. عند الانتهاء، شطف الأنسجة مع المالحة. بعد ذلك ، استخدم ملقطًا رقيقة لتراجع القنية السفلية إلى محلول ملحي ووضعه فوق ثقب الجمجمة.
ثم ادفع القنياء إلى الجمجمة حتى يتم ملامسة غطاء الزجاج للألياف. جفف الجمجمة وطبق أسمنت لاصق سريع فوق الجمجمة ليمسك بالقنية في مكانها. تأكد من تطبيق لاصق أيضا على حافة من القنية ولكن يجب الحرص على عدم السماح لاصقة تشغيل في القنية.
مرة واحدة الجافة، واستخدام ذراع stereotaxic لوضع لوحة حامل الرأس على القنية في اتصال مع الجمجمة. إعداد خليط من الاكريليك الأسنان ومن ثم تطبيقه عبر الجمجمة بأكملها. تغطية الجمجمة المكشوفة بأكملها، المسمار والجلد المفتوح مع الاكريليك الأسنان لتحقيق الاستقرار في إعداد.
بعد 15 دقيقة، ضعي فيلم لاصق قابل للإزالة على لوحة حامل الرأس لمنع الحطام من دخول القنية. عندما تكون على استعداد لتصوير الدماغ، اتبع مرة أخرى على طول في بروتوكول النص المصاحب للحصول على تفاصيل حول التخدير. مرة واحدة مخدر بما فيه الكفاية، واستخدام ملقط لإزالة بعناية الفيلم لاصق من لوحة حامل الرأس.
إزالة الفيلم بلطف لتجنب إتلاف التحضير. بعد ذلك، ضع الماوس تحت المجهر فوق سجادة التدفئة وأضمن لوحة الرأس إلى حامله. تطبيق مرهم العين على عيون الحيوان.
ثم تنظيف كانولا التصوير باستخدام حقنة وإبرة رقيقة لإسقاط المياه الأيونية في القنية تليها إزالة مع مضخة فراغ. استخدام انخفاض التكبير أهداف مسافة العمل الطويل للتحقق بصريا من كانولا للمياه المتبقية، والأوساخ، والسلامة ووجود الفلوريسنس. ثم محاذاة كانولا إلى محور البصرية عن طريق ضبط زوايا الذراعين حامل الرأس.
قم بالتبديل إلى هدف 25X مع فتحة رقمية 1.0 ومسافة عمل 4 ملليمترات. ثم إضافة ما يكفي من المياه ديون إلى القنية لملء وصيانة المياه الزائدة على رأس القنية. وأخيرا ، استخدم اثنين من الإثارة الفوتونية وصورة إشارات الفلوريسنس.
يظهر هنا هو كومة صورة 2P من الدماغ thy1 - GFP الماوس المعدلة وراثيا. Thy1-GFP الفئران التعبير عن السيتوبلازمي تعزيز GFP تحت سيطرة المروج Thy1 في عدد السكان عشوائية متفرقة من الخلايا العصبية الهرمية. عموما، المحور الرئيسي للخلايا العصبية الهرمية في الظهر فرس النهر CA1 عمودي تقريبا على طائرة التصوير XY.
يتم تعيين هذه المناطق يدوياً إلى مكدس التكبير المنخفض ثلاثي الأبعاد يظهر نمط تعبير GFP في وحدة التخزين أسفل كانية التصوير. بالنسبة للتتبع الطولي، يتم تحديد عدة مناطق في الدماغ ضمن مجال رؤية القنية. كل منطقة تقابل مساحة 240 في 240 ميكرومتر تقريبا وتحتوي على ما بين واحد وسبعة أجزاء من التشعب.
سلسلة صور هنا يظهر واحد ميكرومتر z خطوة كومة الصورة من الخلايا العصبية الهرمية CA1 dendrites القاعدية المكتسبة في فترات زمنية مختلفة لمدة 14 يوما. ومع ذلك، يمكن أن تكون فترات وفترات التصوير الأطول ممكنة. على الرغم من أن معظم الصور هي من العمود الفقري المتجرفين في الطبقة أوريان، فمن الممكن أيضا لصورة العمود الفقري التشعب في dendrites مائلة من راديتوم الطبقة.
امتداد آخر لهذه التقنية هو صورة اللدونة التي تثيرها الأنشطة في الخلايا العصبية الهرمية CA1 عن طريق حقن منطقة فرس النهر الظهرية CA1 بمتجه فيروسي. وهذا يسمح للدونة من مئات من الخلايا العصبية الهرمية CA1 في كل ليتم قياسها هو موضح هنا ككومة صورة 2P. من المهم للغاية منع تلف قرن آمون عند إزالة الأنسجة المُبالغ فيها.
بالإضافة إلى ذلك، ينبغي للمرء أن يضع cannula بشكل صحيح لضمان إعداد مستقر. يسمح الإعداد الموصوف باستخدام أنواع مختلفة من التصوير البصري مثل المجاهر المصغرة التي يمكن زرعها على رأس الحيوان. وهذا يسمح للباحث لمتابعة نشاط الخلايا العصبية في الحيوانات تتحرك بحرية.
في الأصل ، تم استخدام هذه التقنية لدراسة اللدونة الهيكلية في الخلايا العصبية فرس النهر. اليوم, يتم تنفيذها في دراسة نشاط الخلايا العصبية أيضا في مناطق الدماغ الأخرى.
