لدينا PROTACs هو المتجانس الكيميائية الأولى من Cereblon، ويمكن أن تساعد على مزيد من توضيح الآلية الجزيئية للتناظرية الثاليدوميد، وكذلك للتحقيق في وظيفة الفسيولوجية من Cereblon. يمكن أن تكون تقنية منصة PROTAC الجديدة هذه مفيدة للغاية لاستهداف البروتينات ذات الاهتمام التي تعتبر غير قابلة للتتبع. تثبيط CRBN وحده ليس لديه نشاط مضاد للورم.
ومع ذلك، قد يكون للتحلل CRBN الآثار السريرية في السمنة, الأمراض المعدية, وغيرها من الاضطرابات. التوليف هو التحدي وأنه من الصعب العثور على الوصلات المثلى والتعلق لتوليد التحللات البروتين فعالة عند تصميم مركب PROTAC. للبدء، ضع 2.46 جرامًا من L-Glutamine المحمي من قبل بوكاك و50 ملليلترًا من رباعي هيدروفوران في قارورة مستديرة القاع 100 ملليلتر، وحركها عند 800 دورة في الدقيقة لمدة دقيقة واحدة.
ثم، إضافة 1.95 غرام من 1، 1'carbonyldiimidazole وكمية الحفاز من 4-البيبيدين. مواصلة اثارة لمدة 10 ساعة في الجزر للحصول على حل عديم اللون واضح من مركب الجلوتاريميد. السماح للمحلول يبرد إلى درجة حرارة الغرفة، وإزالة المذيب مع المبخر الدوارة.
اِرْفي البقايا في 200 ملليلتر من خلات الإيثيل وسكبها في قمع فاصل. اغسل الطبقة العضوية بـ 50 ملليلتر كل من الماء الميون والمل محلول ملحي، وجفف الطبقة العضوية فوق كبريتات الصوديوم. الجاذبية تصفية الحل من خلال هلام السيليكا لإزالة desiccant، ومن ثم شطف هلام السيليكا مع 200 ملليلتر من خلات الإيثيل.
إزالة المذيبات من الترشيح تحت فراغ للحصول على مركب 1 كما الصلبة عديم اللون. جفف المنتج تحت فراغ بين عشية وضحاها قبل استخدامه. بعد ذلك، قم بحل 0.50 جرام من خلات الصوديوم في 20 ملليلتر من حمض الخليك الجليدي في قارورة مستديرة القاع 100 ملليلتر مجهزة ببار ضجة.
إضافة 1.25 غراما من 3-fluorophthalic anhydride و 1.14 غرام من الغلوتاريميد ويحرك في الجزر لمدة ست ساعات للحصول على حل الأرجواني من مجمع 3. اترك الخليط يبرد لدرجة حرارة الغرفة، ثم صبه في 100 ملليلتر من الماء الأيوني ويحرك لمدة 10 دقائق ليترسب في المركب 3. جمع الصلبة عن طريق الترشيح، وغسلها بالماء واثير البترول، وتجفيفه تحت فراغ لمدة يومين.
بعد ذلك، ضع 0.83 جرام من المركب الثالث و20 ملليلتر من سلفوكسيد ثنائي الميثيل الجاف في قارورة شلينك سعة 50 ملليلتر وحركها لمدة دقيقتين. إضافة 0.22 غراما من ألفا أوميغا ديامين رابط مركب 6, و 1.05 ملليلتر من N, N-diisopropylethylamine ويحرك الخليط تحت الأرجون في 90 درجة مئوية لمدة 18 ساعة للحصول على هومديمر 8 في خليط أخضر داكن. اترك الخليط يبرد لدرجة حرارة الغرفة ويسكبه في 100 ملليلتر من الماء الأيون.
استخراج المنتج في ثلاثة أجزاء 50 ملليلتر من خلات الإيثيل، والجمع بين الطبقات العضوية، وغسلها مع 50 ملليلتر كل من الماء والملوحة. جفف الطبقة العضوية المغسولة فوق كبريتات الصوديوم، فلتري التجفيف وأزل المذيب تحت الفراغ. Redissolve بقايا في كمية ضئيلة من المذيبات الكروموغرافيا وتطبيق على عمود هلام السيليكا لتنقية.
جمع الكسور المنتج الفلورسنت، والجمع بينها، وإزالة المذيبات للحصول على Homodimer 8 كما الصلبة الصفراء. للبدء، قم بحل 2.28 جرام من الجلوتاريميد 1 في 25 ملليلتر من ثنائيثيلفورماميد في قارورة مستديرة القاع 100 ملليلتر. تعليق 2.76 غرام من كربونات البوتاسيوم المطحونة في هذا الحل.
ثم، رسم 0.62 ملليلتر من يودوميثان في حقنة مجهزة بإبرة قياس 20. إضافة iodomethane قطرة الحكمة على مدى 10 ثانية. سداد القارورة مع الحاجز المطاطي، وإضافة إبرة تنفيس.
سونيكات الخليط لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة للحصول على مجمع الجلوتاريميد 2. تخفيف الخليط مع 50 ملليلتر من خلات الإيثيل وصبه في قمع فاصل. شطف القارورة في القمع مع 50 ملليلتر آخر من خلات الإيثيل.
العمل حتى المنتج وتنقية مع الكروماتوغرافيا العمود هلام السيليكا للحصول على الجلوتاميد 2 كمادة صلبة عديم اللون. قارن أوقات الاحتفاظ بمركّبات الجلوتاريميد 1 و2 للتأكد من نجاح ميثيل N. لبدء التحقق من صحة, علاج خلايا المايلوما المتعددة مع المركبات ذات الفائدة.
عزل البروتينات ذات الصلة، وإعداد عينات لتحليل لطخة الغربية لتدهور البروتين. ثم، إعداد شطيرة هلام لSDS-PAGE وملء خزان العازلة الأنود مع حل 8.9 33-HCl. قم بتحميل عينات البروتين في الجل وتشغيله بسرعة 70 فولت لمدة 20 دقيقة، يليه 115 فولت لمدة 150 دقيقة.
المقبل، وإعداد 1x نقل العازلة للمناعة ونقل بعناية هلام من كاسيت لها إلى مخزن نقل إلى توازن. عليك أن تكون حذرا جدا عند إزالة هلام من كاسيت لتكييف، لأنه يمكن أن تنفجر وتكوم بسرعة كبيرة. غمر 0.45 ميكرومتر بولي فينيليدين ثنائيفلورايد غشاء في الميثانول النقي لمدة 20 ثانية على الأقل لتنشيطه، ثم غمره في مخزن نقل 1x.
السماح للجل والغشاء توازن لمدة 10 دقائق. ثم، تجميع الكاسيت النبل الغربية وتطبيق 180 مللي امبير لمدة 90 دقيقة لنقل البروتينات إلى الغشاء. بعد ذلك، تصور البروتينات عن طريق الكبت المناعي.
لتقييم الآثار على صلاحية الخلية ، أولا ، بذرة 50000 خلايا المايلوما متعددة في بئر من 96 لوحة في ثلاثية المعادن البيولوجية. أضف إلى كل بئر 100 ميكرولترات من الوسائط التي تحتوي على DMSO ، أو 0.1 ، واحد ، أو 10 ميكرومولار من المركب 8 ، المركب 9 ، أو pomalidomide. لتنفيذ تجربة إنقاذ الخلية، بدلا من ذلك علاج الخلايا مع حل نانومولر 100 من مركب 8 لمدة ثلاث ساعات، إما قبل أو بعد إضافة حل واحد من ميكرومولور من pomalidomide.
احتضان الخلايا لمدة 24، 48، أو 96 ساعة في 37 درجة مئوية في الغلاف الجوي 5٪ ثاني أكسيد الكربون، وقياس صلاحية الخلية مع مقايسة الإنارة. تم تأكيد هيكل PROTAC 8 المتجانس بالبروتون والكربون NMR. تم تصنيع Heterodimeric PROTAC 9 كتحكم سلبي ، حيث ينتج عن N-methylation داخل جزء الغلوتارميد فقدان نخاع ، أو CRBN ، قدرة ملزمة.
ال HOMO PROTAC 8 المستحثة بالقرب من تحلل الكربن البروتيومي الكامل مع الحد الأدنى من الآثار على عوامل النسخ اللمفاوية IKZF1 و IKZF3. في المقابل، أظهرت هيتيرو PROTAC 9 سلوكًا مشابهًا لـ pomalidomides. ويمكن أن يُمنع تحلل CRBN المستحث المركب 8 بواسطة مثبط مباشر للبروتيات، أو مسدود بشكل غير مباشر بواسطة تثبيط النتيلية.
الخلايا المعالجة مسبقاً بالمركب 8 قاومت بشكل كبير آثار بوماليدوميد على IKZF1 و IKZF3. وكان للتحلل المستحث للكربن المستحث 8 تأثير أقل بكثير على قابلية الخلية المايلوما المتعددة البقاء بعد 96 ساعة من IKZF1 و IKZF3 من المركب 9 وmomadomide فعل. وكان العديد من خلايا المايلوما المعالجة مسبقا مع مركب 8 قابلية أكبر بكثير عند التعرض لmomaalidomide من الخلايا غير المعالجة, مما يشير إلى أن المركب 8 يمكن استخدامها لمحاكاة المناعة IMiD المخدرات المقاومة.
وجدنا أن مركب 8 يدفع التحلل الكامل للبروتياسوم من Cereblon, ليس له آثار جانبية على IKZF1 و IKZF3 الخلية البقاء والانتشار. إن توسيع نطاق تكنولوجيا المشروع ليشمل أهدافاً أخرى ينطوي على إمكانية تعطيل وتتبع البروتينات المرتبطة بالسرطان وغيره من الأمراض. عند تكييف هذه التقنية للأدوية والبروتينات الأخرى ، ينبغي للمرء أن يحقق بعناية في الهياكل الجزيئية للدواء والهدف من البروتين لاختيار الروابط والمرفقات المثلى.
لن تعمل IMiDs في الفئران بسبب طفرة نقطة في Cereblon ، ولكن يوجد نموذج فأر سريع في محور وراثيا يمكن استخدامه لمزيد من الدراسات الحيوانية. كما pomalidomide هو الثاليدوميد التناظرية، وهو مسخ للغاية، ونحن لا ننصح النساء الحوامل الذين يعملون مع هذه الأدوية.
