حددنا إجراءً للكشف عن حمض iophenoxic في مصل النمس وتحديده كمياً. وتشير النتائج إلى أن حمض iophenoxic يمكن استخدامه كعلامة بيولوجية للتحقق من امتصاص بيتا في الأنواع. والميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أنها تسمح بالتكين من النظير التناظري من حمض الإوفينوكسيك في أجزاء من المليار، وذلك باستخدام تقنية بسيطة لتنفيذ البروتين هطول الأمطار.
للمرحلة المتنقلة A، الجمع بين ملليلتر واحد من حمض الفورميك مع لتر واحد من الماء النقي جدا. للمرحلة المتنقلة B, الجمع بين ملليلتر واحد من حمض الفورميك مع لتر واحد من الأسيتونتريل. للديوين، والجمع بين ملليلتر واحد من حمض ثلاثي الفلوراستيك مع 200 ملليلتر من الأسيتونيتريل.
المقبل, تزن ما يقرب من 10 ملليغرام من ميثيل-IPA على microbalance, وسجل كتلة زائد أو ناقص 0001 ملليغرام. نقل كمية من ميثيل IPA إلى 10 ملليلتر فئة قارورة الحجمي، وذلك باستخدام أربعة إلى خمسة ملليلترات من الأسيتونيتريل. سونيكات لدقيقة واحدة لإذابة جميع المواد الصلبة ومن ثم جلب إلى حجم مع الأسيتونيتريل.
نقل ما يقرب من ثمانية ملليلترات من كل مخزون إلى ثمانية قوارير الزجاج الكهرماني ملليلتر مع قبعات مبطنة PTFE وتخزين العينات في درجة حرارة الغرفة. ثم، نقل المخزون المتبقي إلى النفايات الخطرة. بالنسبة للمخزون 25X 7 ميثيل IPA إعداد مخزون من IPA الميثيل و acetonitrile في حوالي 200 ميكروغرام لكل ملليلتر.
نقل ملليلتر واحد من الأسهم إلى قارورة خمسة ملليلتر وتمييع إلى حجم مع الأسيتونيتريل. ثم، نقل المخزون إلى قارورة زجاجية العنبر ثمانية ملليلتر مع غطاء مبطن PTFE وتخزينها في درجة حرارة الغرفة. باستخدام أنبوب مكرر، قم بإعداد ستة مخزونات إضافية من 25X الميثيل-IPA الموصوفة في بروتوكول النص في 8 قوارير زجاجية من نوع الكهرمان ملليلتر مع قبعات مبطنة بغطاء PTFE وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
بالنسبة للمخزون البديل 25X، قم بنقل 0.1 ملليلتر من مخزون الإيثيل IPA المركز إلى قارورة بحجم 10 ملليلتر من الفئة A باستخدام حقنة زجاجية 100 ميكروليتر ثم تمييعها إلى الحجم مع الأسيتريتريل. نقل ما يقرب من ثمانية ملليلتر من المخزون البديل إلى قارورة زجاجية من نوع الكهرمان تبلغ ثمانية ملليلتر مع غطاء مبطن بغطاء PTFE وتخزينه في درجة حرارة الغرفة. (أ) نقل المخزون المتبقي إلى النفايات الخطرة.
المقبل, إعداد 4X الأسهم التي تحتوي على كل من ميثيل-IPA والإيثيل-IPA في 10 ملليلتر مسامير قوارير العينات الزجاجي الأعلى, كما هو موضح في بروتوكول النص. على سبيل المثال، لإعداد المخزون 4X7، إضافة 0.2 ملليلتر من مخزون 25X سبعة ميثيل-IPA إلى قارورة ملليلتر اثنين باستخدام الأنابيب المتكررة مع 0.5 ملليلتر قدرة طرف. إضافة 0.2 ملليلتر من 25X مركب إيثيل IPA باستخدام أنبوب تكرار مع تلميح قدرة 0.5 ملليلتر.
إضافة 0.85 ملليلتر من الأسيتونيتريل باستخدام أنبوب تكرار مع طرف قدرة ميليلتر واحد. قم بتكهّل القارورة بشكل آمن وعكس خمس مرات لمزجها. بعد ذلك، قم بإعداد المنحنى القياسي في قارورة العينات التلقائية ذات اللولبية اثنين ملليلتر كما هو موضح في بروتوكول النص.
على سبيل المثال، لإعداد سبعة القياسية، إضافة 0.2 ملليلتر من الأسهم 4X7 إلى قارورة ملليلتر اثنين، وذلك باستخدام أنبوب تكرار مع تلميح سعة 0.5 ملليلتر. إضافة 0.6 ملليلتر من المياه المتينة فائقة النقاء باستخدام الأنابيب المتكررة مع طرف قدرة ميليلتر واحد. اِقم القنينات بإحكام و قلبها خمس مرات لخلطها.
لكل عينة، قم بإعداد أنبوب جهاز طرد مركزي صغير 1.5 ملليلتر يحتوي على 200 إلى 300 ملليغرام من كلوريد الصوديوم وترتيب الأنابيب في رف بلاستيكي 80 موضعاً. لكل عينة، تسمية واحد 1.5 ملليلتر أنبوب أجهزة الطرد المركزي الصغيرة كما A وثاني أنبوب جهاز طرد مركزي صغير كما B.ترتيب الأنابيب في رف بلاستيكية موقف 80. ضع المواد والمعدات التالية اللازمة لاستخراج المصل في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية من الدرجة الثانية: أنابيب أجهزة الطرد المركزي الصغيرة، خلاط دوامة، وبربير تكرار مع 0.5 ملليلتر وخمس نصائح قدرة ملليلتر، ما بين 100 إلى 1000 ميكرولتر الهواء المواص إزاحة مع 1000 نصائح ميكرولتر، والحاويات مع ما يقرب من 100 ملليلتر كل من المياه المتينة والنقاء جدا، وحاوية النفايات الخطر الحيوي.
بعد ذلك، إزالة عينات المصل من التخزين المجمدة ودافئة لدرجة حرارة الغرفة في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية. Vortex مزيج كل عينة مصل قبل أخذ العينات. باستخدام أنبوب تكرار مع تلميح قدرة 0.5 ملليلتر، الاستغناء 05 ملليلتر من مصل النمس في أنبوب A وإضافة 05 ملليلتر من المخزون البديل 25X.
ثم إضافة 0.95 ملليلتر من diluent إلى أنبوب A باستخدام أنبوب تكرار مع تلميح قدرة خمسة ملليلتر. قم بتكهُن الأنابيب بشكل آمن ومزيج دوامة لمدة 10 إلى 15 ثانية. المقبل, إضافة مصل النمس التحكم إلى أنبوب A.Fortify كل من العينات 4QC مع لي-IPA باستخدام الأنابيب المتكررة مع تلميح قدرة 0.5 ملليلتر.
إضافة 25X الأسهم البديلة لعينات QC. ثم، إضافة إلى عينات QC. اِكِلَ الأنابيب ومزيج الدوامة.
الاستغناء عن كلوريد الصوديوم قبل وزنها في أنبوب A ومزيج دوامة ثلاث مرات لمدة ثماني إلى 12 ثانية. ثم، مسح أسفل الأسطح الخارجية للرف القارورة التي تحتوي على أنبوب A باستخدام 70٪ isopropanol. بعد إزالة العينات من مجلس الوزراء السلامة الحيوية، أنبوب الطرد المركزي A في 1200 مرات G لمدة دقيقة واحدة لفصل مراحل مائي و acetonitrile.
Pipette 0.8 ملليلتر من مرحلة الأسيتونتريل العليا إلى أنبوب B، وذلك باستخدام ماصات إزاحة الهواء 100 إلى 1000 ميكرولتر. نقل الحل المتبقي في الأنبوب A إلى النفايات الخطرة والتخلص من الأنبوب الفارغ في حاوية نفايات المخاطر البيولوجية. الآن، إزالة الأسيتونيتريل وثلاثي فلورواجيكي من أنبوب B مع تدفق لطيف من غاز النيتروجين في حمام الماء 45 درجة مئوية.
إضافة 0.25 ملليلتر من الأسيتونيتريل إلى أنبوب B باستخدام تكرار الأنابيب ومزيج دوامة لمدة أربع إلى خمس ثوان. ثم، الطرد المركزي في 1200 مرة G لمدة ثانيتين إلى أربع ثوان لجمع السائل في الجزء السفلي من الأنبوب. بعد الطرد المركزي، إضافة 0.75 ملليلتر من المياه ديونيد نقية جدا إلى أنبوب B باستخدام الأنابيب المتكررة مع طرف سعة خمسة ملليلتر ومزيج دوامة لمدة أربع إلى خمس ثوان.
أجهزة الطرد المركزي في 1200 مرات G لمدة دقيقة واحدة لتوضيح العينة. ثم، نقل 0.75 ملليلتر من عظمى إلى قارورة العينات السيارات باستخدام ماصات 1000 ميكرولتر إزاحة الهواء والتخلص من نصائح ماصة في حاوية النفايات الخطر الحيوي. قم باحتواء كل قارورة لصناعة العينات بشكل آمن لتحليل LC-MS/MS.
نقل الحل المتبقي في الأنبوب باء إلى النفايات الخطرة والتخلص من الأنبوب الفارغ في حاوية نفايات المخاطر البيولوجية. تكوين LC-MS/MS مع كافة المعلمات الموضحة في بروتوكول النص. السلطة على LC-MS / MS والسماح للعمود للوصول إلى 70 درجة مئوية قبل تحديد معدل التدفق إلى 0.8 ملليلتر في الدقيقة.
إعداد تسلسل في برنامج الحصول على البيانات لحقن المنحنى القياسي قبل وبعد كل دفعة تتكون من عينات مراقبة الجودة وعينات غير معروفة. حقن جميع المعايير والعينات والحصول على الكروماتومات MR ايون باستخدام المعلمات المذكورة في بروتوكول النص. بعد الانتهاء من تسلسل، إيقاف LC-MS / MS والتخلص من جميع قوارير العينات السيارات في النفايات الخطرة.
ويوضح مخطط الكروماتوات الأيون لمصل النمس التحكمي وقت الاحتفاظ بـ الإيثيل -IPA وعدم وجود ميثيل IPA في وقت الاحتفاظ المشار إليه. ويوضح مخطط الكروماتوات الأيون لعينة مراقبة الجودة الفصل الأساسي لميثيل IPA عن الإيثيل - IPA، وكذلك التحولات الكمية والمؤهلة لميثيل IPA. يُظهر مخطط الكروماتوغرام الأيون للعينة التمثيلية من الدراسة تركيزًا مُلاحظًا في المصل من 33.5 ميكروغرام لكل ميكرولتر من ميثيل IPA.
تظهر هنا دقة ونتائج دقيقة للتحكم في مصل النمس المحصن بميثيل IPA. وتراوحت نسبة الاسترداد في المائة من 96.9 إلى 109 في المائة، وكان الانحراف النسبي في مستويات التحصين الثلاثة 3.4 في المائة 1.7 في المائة و 2.3 في المائة على التوالي. تظهر هنا دقة ونتائج دقيقة للتحكم في مصل النمس المحصن بـ Ethyl-IPA.
وتراوحت نسبة الاسترداد في المائة من 89.5 إلى 115 في المائة، وكان الانحراف المعياري النسبي في مستويات التحصين الخمسة 4.3٪1.5٪2.3٪5.6٪و1.1٪ على التوالي. وقد قدمت جميع النمس إيثيل IPA و Methyl-IPA الطعوم تستهلك ما لا يقل عن 25٪ من الطعم في غضون 24 ساعة من القيود الزمنية ومستويات قابلة للقياس الكمي من إيثيل IPA و Methyl-IPA في سيرا على التوالي. ويمكن زيادة الفائدة المحتملة للأسلوب عن طريق تكوين LC-MS لجمع البيانات عن التناظرية حمض iophenoxic الأخرى، مثل البروبيل وحمض ثنائي الفينيل.
وشجعنا الموظفين على الرجوع إلى أحدث التوصيات الصادرة عن اللجنة الاستشارية المعنية بممارسات التحصين، أو لجنة السلامة البيولوجية المؤسسية التابعة لها، من أجل تقديم إرشادات بشأن ما إذا كان التطعيم ضد داء الكلب قبل التعرض ضروري. وينبغي أن يتم تنفيذ الأقسام من 2.3 إلى 2.6 من هذا البروتوكول الذي ينطوي على العمل مع المصل غير المخفف في خزانة السلامة البيولوجية من الفئة الثانية.
