وDIT كبيرة لأنه يوفر اختبار تشخيص داء الكلب التي يمكن إجراؤها في المختبرات اللامركزية في الميدان أو في المناطق التي لا الوصول الروتيني إلى المجهر الإلكتروني. الميزة الرئيسية للDIT هو أنه يستخدم فقط المجهر الخفيفة بسيطة ويمكن الحصول على النتائج في ساعة واحدة تقريبا. يوفر DRIT أداة اقتصادية قوية لتشخيص داء الكلب التي يمكن استخدامها من قبل المختبرات وعلماء الأحياء الميدانية لتحسين برامج مراقبة داء الكلب والوقاية منه ومكافحته على مستوى العالم.
بالنسبة للحيوانات التي يتم جمعها حديثا أو تم إذابة درجة الحرارة إلى درجة الحرارة المحيطة، ضع الحيوان على سطح مستو مع العمود الفقري العنقي استدارة قليلا نحو الفاحص. بالبات لتحديد المفصل القذالي الاتلانتو على الجانب الجانبي من العمود الفقري العنقي. باستخدام شفرة مشرط، قم بعمل شق على مستوى المفصل القذالي الاتلانتو في الجانب البطني يقطع جميع طبقات العضلات والأنسجة الرخوة بما في ذلك القصبة الهوائية والمريء.
استمر حتى تقريبًا من الجانب الأمامي من فقرات العمود الفقري العنقي. ثم نقل رأس الحيوان إلى امتداد نطاق نهاية حتى جذع الدماغ مرئيا. استخدام شفرة مشرط لإزالة جميع الدماغ مرئية وأنسجة الجهاز العصبي المركزي لعينة.
ضع عينات جذع الدماغ في حاوية غير قابلة للكسر وتسمية وفقا لذلك. أولاً، قم بإعداد أطباق تلطّخ تكون عميقة بما يكفي للسماح بالغمر الكامل لشريحة عينة. ملء طبق واحد مع 10٪ الفوسفات buffered formalin.
ملء الأطباق اثنين وأربعة وخمسة مع TPBS. ملء الطبق الثالث مع بيروكسيد الهيدروجين 3٪. ثم ملء الأطباق ستة وثمانية وتسعة و10 مع الماء المقطر أو ديوند.
ملء الطبق سبعة مع تركيبة الهماوكسيلين جيل رقم اثنين المخفف في نسبة 1:1 مع الماء المقطر. لإعداد محلول الأسهم أميني إيثيل-كاربازول، وذلك باستخدام ماصة زجاجية، ضع خمسة ملليلترات من N، N-dimethylformamide في وعاء زجاجي. إضافة 120 ملليغرام قرص من 3-أمينو-9-ethylcarbazole إلى حاوية الزجاج ويهز حتى يذوب تماما.
لإعداد تخفيف عمل AEC، أضف سبعة ملليلترات من مخزن الخلات المؤقت إلى أنبوب طرد مركزي 15 ملليلتر. استخدم ماصة زجاجية لإضافة 0.5 ملليلتر من محلول مخزون AEC إلى أنبوب الطرد المركزي. إضافة 0.75 ملليلتر من 3٪ محلول بيروكسيد الهيدروجين.
استخدام حقنة 10 ملليلتر مع 0.45 ميكرومتر حقنة مرشح لتصفية الحل. للبدء، استخدم علامة الحبر الدائم المقاوم للماء لمنع اللطاخة لتسمية شرائح المجهر الزجاجي مع عدد فريد لكل عينة. استخدام شفرة مشرط لإزالة جذع الدماغ من الحاوية ووضعها على منشفة ورقية.
استخدام منشفة ورقية ثانية للطخة بلطف بعيدا أي السوائل الزائدة، والدم أو الفراء للكشف عن الأنسجة فقط جذع الدماغ. إذا لزم الأمر، قسم أنسجة جذع الدماغ للكشف عن المقطع المقطعي. لمسة بلطف جدا الشريحة المجهر إلى عدة نقاط من جذع الدماغ دون حركة جانبية للسماح مناطق متعددة من جذع الدماغ ليتم نقلها إلى الشريحة التأكد من أن يتم نقل واحد أو اثنين فقط من طبقات من الخلايا من أنسجة الدماغ إلى الشريحة.
اتركي الهواء الجاف لمدة خمس دقائق تقريباً في درجة حرارة الغرفة. ثم غمر الشرائح في 10٪ buffered formalin في طبق واحد لمدة 10 دقائق. إزالة الشرائح من formalin وتراجع شطف لهم في حل TPBS في الطبق الثاني.
غمر الشرائح المشطفة في محلول بيروكسيد الهيدروجين الوارد في الطبق الثالث لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، إزالة الشرائح من بيروكسيد الهيدروجين وتراجع شطفها في TPBS الطازجة الواردة في الطبق الرابع. بعد إزالة أي بيروكسيد الهيدروجين الزائد، ضع الشرائح في TPBS الطازجة الواردة في الطبق الخامس.
تأخذ الشرائح واحد في وقت واحد من الطبق الخامس، والتخلص من وصمة عار أي العازلة الزائدة ووضع الشريحة على منشفة ورقية مبللة على مقاعد البدلاء المختبر. عندما تم نقل جميع الشرائح، استخدم القطارة أو ماصة لإسقاط ما يكفي من الأجسام المضادة الأولية للفيروس المضاد لمكافحة داء الكلب على كل شريحة لتغطية أنسجة الجهاز العصبي المركزي. تغطية الشرائح مع لوحات جيدا أو غطاء بسيط آخر لإنشاء غرفة الرطوبة واحتضان الشرائح في درجة حرارة الغرفة في الغرفة لمدة 10 دقائق.
بعد ذلك، إزالة الشرائح من غرفة الرطوبة، وتهز وصمة عار قبالة أي الاقتران الزائد وتراجع شطف الشرائح في TPBS في الطبق الخامس. العمل مع شريحة واحدة في وقت واحد، وإزالة شريحة من TPBS واستخدام القطارة أو ماصة لإسقاط ما يكفي Streptavidin peroxidase المعقدة لتغطية أنسجة الجهاز العصبي المركزي. مرة واحدة وقد تم تغطية جميع الشرائح، احتضان لهم في غرفة الرطوبة لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
ثم إزالة الشرائح من غرفة الرطوبة، يهز ولطخة قبالة أي مجمع الزائدة وتراجع شطف الشرائح في TPBS الواردة في الطبق الخامس. العمل مع شريحة واحدة في وقت واحد، وإزالة شريحة من TPBS واستخدام ماصة لإسقاط ما يكفي من AEC حل العمل لتغطية أنسجة الجهاز العصبي المركزي. احتضان الشرائح في غرفة الرطوبة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
بعد هذا، تراجع شطف الشرائح في الماء المقطر الواردة في طبق ستة ووضعها في وضع مضاد للهماوكسيلين جيل في طبق سبعة لمدة دقيقتين. تراجع على الفور شطف جميع الشرائح في الماء المقطر في طبق ثمانية. كرر هذا مرتين باستخدام المياه العذبة في أطباق تسعة و 10 لكل غسل.
العمل شريحة واحدة في وقت واحد، وإزالة شريحة من الماء ويهز ولطخة قبالة أي المياه الزائدة. استخدام الماء القابل للذوبان تصاعد المتوسطة للصق غطاء على الشريحة. ثم استخدام المجهر الخفيفة مع هدف 20X لعرض الشرائح.
تظهر النتائج الإيجابية من DRIT إدراجات فيروسية حمراء يمكن أن تختلف في الشكل والحجم داخل سيتوبلازم من أجسام الخلايا المزرقة. تظهر التضمينات على نحو سلس مع هوامش مشرقة للغاية ومنطقة مركزية أقل لطخة. يتم تصنيف توزيع المستضد من زائد أربعة إلى واحد زائد مع أربعة زائد تمثل توزيع المستضد تتألف من وفرة من إدراجات كبيرة وصغيرة متفاوتة في الحجم والشكل والحاضر في كل مجال من مجالات الرؤية داخل CNS نسيج لمس الانطباع.
يتم تعيين توزيع زائد ثلاثة عند وجود تضمينات في مجموعة متنوعة من الأحجام في معظم ولكن ليس جميع حقول العرض. إذا تم العثور على التضمينات في 10 إلى 50٪ من حقول المجهر، يتم تعيين توزيع مستضدين زائد بينما يتم تعيين واحد زائد عند العثور على التضمينات في أقل من 10٪ من الحقول. معظم أنسجة الجهاز العصبي المركزي مع فيروس داء الكلب الحالي معرض إدراجات نموذجية الفيروسية متدرج كما زائد ثلاثة أو زائد أربعة كثافة وتوزيع المستضد.
إذا كانت النتائج تشير إلى زائد واحد أو اثنين زائد في توزيع إما كثافة أو مستضد، يتم التصريح عن العينة غير محدد وتكرار الاختبار هو ما يبرره. تعتبر عينة الاختبار باستخدام DRIT سلبية بالنسبة لمستضدات فيروس داء الكلب بعد فحص الشريحة التي تحتوي على أنسجة الجهاز العصبي المركزي بتكبير 200X أو أكبر ولا يتم الكشف عن أي إدراجات نموذجية للفيروس. العينات السلبية المعرض أجسام الخلايا المزرق مع تلطيخ معين قليلة أو معدومة معروفة.
وينبغي أن كل شخص إجراء اختبار داء الكلب التشخيص تلقي التطعيمات ما قبل التعرض القياسية وخضوعها لتقييم الأجسام المضادة المصلية العادية. وينبغي ألا يدخل الأفراد غير المحصنين المناطق التي يجري فيها هذا العمل. بالإضافة إلى الاحتياطات المتخذة عند العمل مع فيروس داء الكلب الحي، العديد من الكواشف المستخدمة في الاختبار خطرة.
الرجوع إلى أوراق بيانات السلامة لكل كاشف.
