البروتوكول الذي وضعته (ليز) يسمح لنا بتحديد معدل الإخصاب بالرفف الأبيض تطبيق هذه التقنية سوف يحسن فهمنا لسلوك وإيكولوجيا الذباب الأبيض. الذباب الأبيض هي haplodiploid، وبالتالي فإن معدل الإخصاب يساوي نسبة الجنس في oviposition.
هذا البروتوكول هو أول وصف للذباب الأبيض ، على حد علمنا ، ويمكن الانتهاء منه في غضون ثلاث ساعات. للبدء، جعل حفرة قابلة للغطاء في غطاء طبق بيتري لإدراج وإزالة الذباب الأبيض الكبار. قم بإعداد غرفة الرطوبة وأزياء مسبار عن طريق إدخال دبوس رفيع في زاوية عمل مريحة في طرف ماصة ذائبة لجعل مسبار رقيق.
اختياريا، نصائح الماصات الزجاج المائل مع الحرارة لتسهيل التعامل مع بيضرفل الأبيض. ثم، السماح للذباب الأبيض الإناث لoviposit على ورقة نظيفة، وقطع لتناسب على أجار في طبق بيتري. خلال oviposition الfly، تنظيف شريحة المجهر مع الصابون والماء.
جففه جيدا وتمتد قطعة من فيلم البارافين على نهاية واحدة للسماح للسوائل لتشكيل قطرات والبيض أن ينظر إليه بسهولة أكبر. لإزالة البيض، استخدم ماصة باستور الزجاجية لإضافة قطرات من محلول تبييض هيبوكلوريت الصوديوم بنسبة 83٪ إلى فيلم البارافين قبل إزالة الكبار وجمع البيض. التبييض وحمض الخليك الجليدي كلاهما تآكل.
وينبغي التعامل معها مع قفازات في غطاء محرك السيارة أو منطقة جيدة التهوية. DAPI هو أيضا مهيجة وينبغي التعامل معها مع قفازات. ثم، إزالة الذباب الأبيض الكبار من ورقة ووضع ورقة تحت المجهر.
رفع بعناية كل بيضة من قاعدتها حتى تتم إزالة pedicel من ورقة. ممارسة على العديد من البيض قبل تنفيذ هذا البروتوكول. رفع البيض ببطء من القاعدة ورفعه تماما من ورقة بمجرد أن تتمكن من رؤية أن يتم إزالة pedicel البيض من ورقة.
نقل اثنين إلى ثلاثة بيضات إلى كل قطرة من التبييض وتركها لمدة 10 دقائق. لإصلاح البيض، استخدم ماصة زجاجية لتجاهل التبييض. ثم، إضافة قطرات من حمض الخليك الجليدية وانتظر ثلاث دقائق.
بعد ذلك، إزالة حمض الخليك الجليدية وإضافة قطرات من حل كلارك. ثم انتظر 10 دقائق حتى تبخر معظم الحل. إضافة قطرات من 70٪ الإيثانول وانتظر مرة أخرى لمدة 10 دقائق.
لتلطيخ البيض، أولا إزالة أي الإيثانول المتبقية. ثم، إضافة قطرات من 1xPBS إلى البيض للحصول على ما يقرب من 7. وضع شريحة المجهر في غرفة الرطوبة لمنع جفاف.
بعد 30 دقيقة، قم بإزالة 1xPBS وأضف قطرات من 1 ميكروغرام لكل ملليلتر DAPI. ضع شريحة المجهر في غرفة رطوبة داكنة وانتظر 15 دقيقة على الأقل. لغسل البيض، قم أولاً بإزالة محلول DAPI.
ثم تضاف قطرات من 1xTBST إلى البيض. بعد خمس دقائق، قم بإزالة 1xTBST. كرر هذا غسل مرتين أكثر من ذلك لما مجموعه ثلاثة يغسل.
بعد الغسيل النهائي، ماصة بعناية جميع البيض من parafilm على جزء نظيف من شريحة المجهر. إزالة TBST الزائدة وإضافة 20 ميكرولترات من تصاعد وسائل الإعلام. وأخيراً، ضع شريحة غطاء نظيفة فوق البيض، وختم شريحة الغطاء بطلاء أظافر واضح للتخزين على المدى الطويل، واشرع في التصوير باستخدام مجهر فلوري.
سمح تدنيس البيض الذي يليه التلطيخ النووي DAPI بتخصيص الإخصاب والجنس الجنيني عندما لوحظ مع مجهر فلوري. الأنثى البرونوي بالقرب من مركز كل من البويضة الأنثوية المخصبة وبيضة الذكور غير المخصبة، والحيوانات المنوية مرئية كطنس مشرق بالقرب من قمة البويضة الأنثوية فقط. أحد تطبيقات هذه التقنية هو تحديد ما إذا كان الإندوسومبيونات البكتيرية تؤثر على نسب الجنس الأولية للذباب الأبيض.
على سبيل المثال، لم تظهر النسب الأساسية للجنس من البيض التي وضعتها ريكيتسيا المصابة وغير المصابة بالأبيض B.tabici أي فرق كبير بين نسبة الجنس في العلاجين. أما بالنسبة للبويضات التي تربى حتى سن البلوغ، فقد شوهدت نتائج مماثلة للبالغين المصابين بالريكتسيا وغير المصابين، ولم تقدم أي دليل، على الأقل في هذه الدراسة، على معدلات تخصيب أكبر من قبل الإناث المصابات بالريكتسيا. باستخدام هذا البروتوكول، يمكن للمرء تحديد ما إذا كان يمكن للحيوانات المنوية بين خصوصية تخصيب البويضات.
إذا لم يلاحظ أي تخصيب، يمكن للمرء أن احتياطي ونتطلع لمعرفة ما إذا كان يتم نقل الحيوانات المنوية أثناء التزاوج من خلال النظر في الحيوانات المنوية للأنثى. وإذا حدث الإخصاب، يمكن مقارنة نسبة البالغين بين الجنسين ومعدل الإخصاب لتحديد جدوى نمو النسل الهجين.
