يصف هذا البروتوكول تركيب وتطبيق PODS، وهو كاشف جديد للتكثّل الحيوي الخاص بالموقع من البروتينات والببتيدات. وتمثل هذه التكنولوجيا تحسنا ملحوظا عن عمليات التكاثُّن البيولوجي التقليدية القائمة على الـ Maleimide-thiol. أكبر ميزة لهذا الإجراء هو البساطة التي يتم بها الكاشف.
تسمح الطريقة بالمكشف أن يتم تصنيعه في أي مختبر تقريبًا. في قارورة مستديرة القاع من 10 ملليلتر، تذوب 100 ملليغرام من ثيوول أكسيداديازول أمينوفينيل في ثلاثة ملليلتر من الميثانول. إلى الحل، إضافة 360 ميكرولترات من diisopropylethylamine وشريط ضجة المغناطيسي.
ختم القارورة مع سدادة مطاطية، ويحرك الحل لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. باستخدام حقنة زجاجية من ملليلتر واحد ، كزة ثقب من خلال سدادة المطاط وإضافة 32 ميكرولترات من يودوميثان بسرعة إلى الخليط. السماح للخليط للرد لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
في قارورة مستديرة القاع 25 ملليلتر، تذوب 387 ملليغرام من حمض الكربوكسيلي المحمي بoc في 10 ملليلتر من ديكلوروميثان. إلى الحل، إضافة 480 ميكرولتررس من diisopropylethylamine، 264 ملليغرام من EDCI، 200 ملليغرام من الين، وشريط ضجة المغناطيسي. ختم القارورة مع سدادة الزجاج، والسماح للتفاعل لتحريك لمدة خمسة أيام في درجة حرارة الغرفة.
بمجرد اكتمال التفاعل ، قم بنقل خليط التفاعل إلى قمع فاصل ، واغسل ثلاث مرات بخمس ملليلترات من حمض الهيدروكلوريك المولر. جمع المرحلة العضوية ونقلها إلى قمع فاصل. ثم غسل المرحلة العضوية مع كربونات الصوديوم واحد المولر تليها المياه.
المقبل، وجمع المرحلة العضوية وإضافة كبريتات المغنيسيوم لإزالة أي آثار من الماء. ثم تصفية الخليط باستخدام frit الزجاج المتوسط. باستخدام المبخر الدوار، وإزالة المذيبات المتطايرة تحت ضغط مخفض لتحمل الصلبة بيضاء.
بعد ذلك، redissolve الصلبة المعزولة في 10 ملليلتر من خلات الإيثيل. ثم يعجل المنتج عن طريق إضافة تدريجية من 30 ملليلتر من الهيكسان. تصفية الحل باستخدام frit الزجاج المتوسط للحصول على المنتج كارباميت كما مسحوق أبيض.
في قارورة مستديرة القاع بـ 10 ملليلتر، تذوب 30 ملليغرام من الكاربامايت في أربعة ملليلتر من ديكلوروميثان. إضافة ببطء 49 ملليغرام من 70٪ م-chloroperbenzoic حمض وشريط ضجة المغناطيسي إلى الخليط، وختم القارورة مع سدادة الزجاج. يحرك الحل بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة، مما يؤدي في نهاية المطاف خليط أصفر.
في اليوم التالي، قم بنقل الخليط إلى مسار فاصل. ثم يغسل الخليط مع 0.1-الصوديوم الهضاري هيدروكسيد تليها المياه. جمع المرحلة العضوية وإضافة كبريتات المغنيسيوم لإزالة أي آثار من الماء.
ثم تصفية الخليط باستخدام frit الزجاج المتوسط. في قارورة مستديرة القاع 25 ملليلتر، تذوب 30 ملليغرام من الكربمايت في مليلترين من ديكلوروميثان. يُضاف شريط حرك مغناطيسي إلى الخليط.
و400 ميكرولترات من حمض ثلاثي الفلوراستيك وختم قارورة مع سدادة الزجاج. ثم يحرك خليط التفاعل في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث ساعات. بمجرد اكتمال التفاعل ، قم بإزالة المتطايرات تحت ضغط مخفض في درجة حرارة الغرفة باستخدام المبخر الدوار للحصول على بقايا زيتية.
إذابة البقايا الزيتية في سبعة ملليلترات من الماء. ونقل إلى مسارل فاصل. اغسل محلول مائي ثلاث مرات مع أربعة ملليلترات من خلات الإيثيل.
في أنبوب microcentuge 1.5 ملليلتر ، قم بحل 10 ملليغرام من PODS و 300 ميكرولترات من ثنائي إيثيل سلفوكسيد. ثم إضافة 26 ميكروليتر من N، N-diisopropylethylamine إلى الحل. حل 15.2 ملليغرام من DOTA NCS في 100 ميكرولتردات من ثنائيثيل السلفوكسيد، والجمع بين الحل مع حل PODS.
ختم أنبوب microcentrifuge، والسماح للتفاعل لاحتضان بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة. المقبل، تمييع 61 ميكرولترات من محلول الأسهم trastuzumab مع 859 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في انخفاض البروتين ملزمة 1.5 ملليلتر microcentrifuge أنبوب. إلى هذا الخليط، إضافة 6.7 ميكرولترات من حل 10 ملليمولار الطازجة الصنع من TCEP في الماء.
إضافة 73 ميكرولترات من واحد ملليغرام لكل ملليلتر PODS-DOTA حل لخليط التفاعل. وأخيرا، ختم أنبوب microcentrifuge واحتضان الحل لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. إن توليف PODS قوي وموثوق به.
[ديبروتينشن] وإحلال من ال [أمينفينيل] أوكساديازول [ثيول] يمنح [ثيوثر] واحدة في العائد كمّيّة. وأثمرت ربط ثيويذر واحد وحمض الكربوكسيلي المحمي من البوكسيليك بمركب اثنين في 55٪العائد. أكسدة منح المركب ثلاثة في 90٪ العائد.
وإزالة مجموعة حماية bocs أسفرت عن PODS في العائد 98٪. تم تأكيد هوية كل منتج عن طريق البروتون NMR، والكربون NMR، وMS عالية الدقة. واقترن البديل الحامل لisothiocyanate من DOTA chelator إلى أمين قلادة PODS للحصول على chelator ثنائي الوظائف في 75٪ من العائد. تم تأكيد هوية المنتج عن طريق البروتون NMR، والكربون NMR، وMS عالية الدقة. يظهر هنا التزام بيولوجي انتقائي للموقع من PODS-DOTA إلى trastuzumab الأجسام المضادة التي تستهدف HER2.
تم تخفيض روابط ثنائي الكبريت في منطقة المفصلات في الجسم المضاد بشكل انتقائي ، ثم تم احتضان الجسم المضاد مع PODS-DOTA لتحمل تكلفة المناعة الحاملة لـ DOTA 80٪. كشف تحليل MALDI-TOF عن درجة من التسمية 1.8 DOTA لكل جسم مضاد. التي لا تزال متسقة عبر مجموعة من الأجسام المضادة IgG1 البشرية ، وأنسانية ، والشيميك.
ومع ذلك، تنتج نفس الظروف وثناعي مع درجة من وضع العلامات 1.5 للأجسام المضادة IgG1 المورين. نظرا لحساسية الضوء من هذا المركب، من المهم للحفاظ على جميع ردود الفعل في السفن المغطاة احباط. وهذا سيزيد من العائد الإجمالي للمنتج.
في حين أن هذا البروتوكول يصف تركيب PODS-DOTA، يمكن تطبيق إجراء مماثل على مجموعة واسعة من الشحنات المحتملة، بما في ذلك الفلوروفورس، والسموم، وغيرها من chelators. هذه الطريقة سوف تسهل بناء محددة جيدا، متجانسة، و عالية الاستقرار من الاعين المناعية التي يمكن استخدامها في مجموعة واسعة من المجالات. من المهم أن نتذكر أن يودوميثان المضافة في الخطوة الأولى من هذه التجربة يمكن أن يكون لها آثار ضارة، وبالتالي ينبغي أن تستخدم في غطاء الدخان.
