We thank the Australian Research Council (ARC) for ARC Future Fellowship (FT120100101) and ARC Centre of Excellence CE140100036) grants to P.T. and the Mark Wainwright Analytical Centre at UNSW for access to mass spectrometry and NMR facilities.

<ol>
	<li>Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+covalent+labeling+of+recombinant+protein+molecules+inside+live+cells.">Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells.</a> Science. 281, 269-272 (1998).</li><li>Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioorthogonal+chemistry:+Fishing+for+selectivity+in+a+sea+of+functionality.">Bioorthogonal chemistry: Fishing for selectivity in a sea of functionality.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48, 6974-6998 (2009).</li><li>Lyon, R. P., Meyer, D. L., Setter, J. R., Senter, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugation+of+anticancer+drugs+through+endogenous+monoclonal+antibody+cysteine+residues.">Conjugation of anticancer drugs through endogenous monoclonal antibody cysteine residues.</a> Meth. Enzymol. 502, 123-138 (2012).</li><li>Natarajan, A., Xiong, C. Y., Albrecht, H., DeNardo, G. L., DeNardo, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+site-specific+ScFv+PEGylation+for+tumor-targeting+pharmaceuticals.">Characterization of site-specific ScFv PEGylation for tumor-targeting pharmaceuticals.</a> Bioconjug. Chem. 16, 113-121 (2005).</li><li>Hvasanov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-Pot+Synthesis+of+High+Molecular+Weight+Synthetic+Heteroprotein+Dimers+Driven+by+Charge+Complementarity+Electrostatic+Interactions.">One-Pot Synthesis of High Molecular Weight Synthetic Heteroprotein Dimers Driven by Charge Complementarity Electrostatic Interactions.</a> J. Org. Chem. 79, 9594-9602 (2014).</li><li>Thordarson, P., Le Droumaguet, B., Velonia, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Well-defined+protein-polymer+conjugates--synthesis+and+potential+applications.">Well-defined protein-polymer conjugates--synthesis and potential applications.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 73, 243-254 (2006).</li><li>Lutz, J. F., B&#246;rner, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modern+trends+in+polymer+bioconjugates+design.">Modern trends in polymer bioconjugates design.</a> Prog. Polym. Sci. 33, 1-39 (2008).</li><li>Nicolas, J., Mura, S., Brambilla, D., Mackiewicz, N., Couvreur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design,+functionalization+strategies+and+biomedical+applications+of+targeted+biodegradable/biocompatible+polymer-based+nanocarriers+for+drug+delivery.">Design, functionalization strategies and biomedical applications of targeted biodegradable/biocompatible polymer-based nanocarriers for drug delivery.</a> Chem. Soc. Rev. 42, 1147-1235 (2013).</li><li>Wong, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymersomes+Prepared+from+Thermoresponsive+Fluorescent+Protein-Polymer+Bioconjugates:+Capture+of+and+Report+on+Drug+and+Protein+Payloads.">Polymersomes Prepared from Thermoresponsive Fluorescent Protein-Polymer Bioconjugates: Capture of and Report on Drug and Protein Payloads.</a> Angew. Chem. Int. Ed. , 5317-5322 (2015).</li><li>Hermanson, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioconjugate Techniques. , (2013).</li><li>Li, J., Xu, Q., Cortes, D. M., Perozo, E., Laskey, A., Karlin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactions+of+cysteines+substituted+in+the+amphipathic+N-terminal+tail+of+a+bacterial+potassium+channel+with+hydrophilic+and+hydrophobic+maleimides.">Reactions of cysteines substituted in the amphipathic N-terminal tail of a bacterial potassium channel with hydrophilic and hydrophobic maleimides.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (18), 11605-11610 (2002).</li><li>Peterson, J. R., Smith, T. A., Thordarson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+room+temperature+photo-induced+electron+transfer+in+biologically+active+bis(terpyridine)ruthenium(II)-cytochrome+c+bioconjugates+and+the+effect+of+solvents+on+the+bioconjugation+of+cytochrome+c.">Synthesis and room temperature photo-induced electron transfer in biologically active bis(terpyridine)ruthenium(II)-cytochrome c bioconjugates and the effect of solvents on the bioconjugation of cytochrome c.</a> Org. Biomol. Chem. 8, 151-162 (2010).</li><li>Borges, C. R., Sherma, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+the+Analysis+of+Cysteine+Sulfhydryls+and+Oxidative+Protein+Folding.">Techniques for the Analysis of Cysteine Sulfhydryls and Oxidative Protein Folding.</a> Antioxid. Redox Signal. (3), 1-21 (2014).</li><li>Peterson, J. R., Thordarson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimising+the+purification+of+terpyridine-cytochrome+c+bioconjugates.">Optimising the purification of terpyridine-cytochrome c bioconjugates.</a> Chiang Mai J. Sci. 36 (2), 236-246 (2009).</li><li>Hvasanov, D., Mason, A. F., Goldstein, D. C., Bhadbhade, M., Thordarson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimising+the+synthesis,+polymer+membrane+encapsulation+and+photoreduction+performance+of+Ru(II)-+and+Ir(III)-bis(terpyridine)+cytochrome+c+bioconjugates.">Optimising the synthesis, polymer membrane encapsulation and photoreduction performance of Ru(II)- and Ir(III)-bis(terpyridine) cytochrome c bioconjugates.</a> Org. Biomol. Chem. 11 (28), 4602-4612 (2013).</li><li>Signor, L., Boeri Erba, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-assisted+Laser+Desorption/Ionization+Time+of+Flight+(MALDI-TOF)+Mass+Spectrometric+Analysis+of+Intact+Proteins+Larger+than+100+kDa.">Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa.</a> J. Vis. Exp. , e50635 (2013).</li><li>Foucher, M., Verdi&#232;re, J., Lederer, F., Slonimski, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+presence+of+a+non-trimethylated+iso-1+cytochrome+c+in+a+wild-type+strain+of+Saccharomyces+cerevisiae).">On the presence of a non-trimethylated iso-1 cytochrome c in a wild-type strain of Saccharomyces cerevisiae).</a> Eur. J. Biochem. 31, 139-143 (1972).</li><li>M&#252;ller, M., Azzi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+labeling+of+beef+heart+cytochrome+oxidase+subunit+III+with+eosin-5-maleimide.">Selective labeling of beef heart cytochrome oxidase subunit III with eosin-5-maleimide.</a> FEBS Lett. 184 (1), 110-114 (1985).</li><li>Shen, B. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugation+site+modulates+the+in+vivo+stability+and+therapeutic+activity+of+antibody-drug+conjugates.">Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeutic activity of antibody-drug conjugates.</a> Nat. Biotechnol. 30 (2), 184-189 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

تنقية المواد الأولية قبل bioconjugation أمر في غاية الأهمية. البروتينات التي تم الحصول عليها من مصادر المؤتلف التجارية غالبا ما تحتوي على الإسوية أخرى من البروتين من الفائدة، والتي يمكن أن يكون مختلفا الكيمياء السطحية والقابلية للتفاعل. على سبيل المثال، في bioconjugation وصفها، والمتاحة تجاريا CYT ج تحتوي على خليط من كل من ISO-1 و ISO-2 CYT ج 12،14،17. ISO-2 و أشكال السيتوكروم ج 1 ايزو هم إلى حد كبير مثلي، مع الفرق الرئيسي هو وجود بقايا السيستين خالية بالقرب من محطة سي من ISO-1 السيتوكروم ج. في المثال هنا، ويتحقق تنقية مع مائي قوي الموجبة لتبادل FPLC، ومع ذلك، قد يكون أكثر قابلية للتطبيق أشكال أخرى من FPLC مثل تبادل شاردي وتقارب، مسعور أو اللوني الحجم الاستبعاد. يتم تقليل البروتين أيضا في هذه الخطوة للتأكد من أن بقايا السيستين على البروتين من الفائدة (هنا السيتوكروم ج) هي فوانخفاض LLY قبل bioconjugation مع الهدف المرتبط maleimide. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه من المفيد للتأكد مما إذا جزيء صغير إلحاق maleimide ليتم استخدامها مع السيستين التي تحتوي على البروتين هو محض وأن maleimide لم تجر رد فعل في التخزين، كما maleimides والضوء ودرجة الحرارة حساسة. وهذا يمكن أن يتم التحقق بسرعة وسهولة عن طريق 1 H NMR، كما البروتونات الفينيل من maleimide سليمة سوف تبدو وكأنها القميص في 6-6،5 جزء في المليون، في حين أن البروتونات من maleimide مفتوحة سيتحول أول الملعب. وأيضا قياس الطيف الكتلي، مع حلقة maleimide مفتوحة الموافق زيادة كتلة دا 18. سوف عازلة الاختيار، ودرجة الحموضة، وإدراج المواد المساعدة مثل المنظفات والمذيبات العضوية، والاختزال يكون لها تأثير عميق على عوائد bioconjugation 5،15. في حالة إضافة مايكل لmaleimide وثيول، يجب أن تكون درجة الحموضة فوق 6 بعد أقل من 8 لسرعة رد الفعل ومحددة تحدث. تحت الرقم الهيدروجيني 6، خصوصية عالية كماسوف maleimide لن تكون قادرة على التفاعل مع أي الأمينات، ولكن ثيول هو البروتونية وبالتالي هو النيوكليوفيل الفقراء لمايكل إضافة يؤدي إلى رد فعل بطيء. أعلى درجة الحموضة 8، ويمكن سطح بقايا يسين أصبحت deprotonated وتتفاعل مع maleimides المتاحة، مما يؤدي إلى التعلق التساهمية غير محددة من عنصر maleimide للبروتين. يستخدم الفوسفات عازلة في هذا bioconjugation لأنها عازلة قوية في هذا النطاق درجة الحموضة ولا يتفاعل مع أي من الكواشف. تريس (hydroxymethyl) aminomethane (تريس) العازلة، على سبيل المثال، سيكون سوء اختيار كمجموعة أمين في هذا المخزن المؤقت يحتمل أن تتفاعل مع maleimide، التي من شأنها أن تؤدي إلى المحصول الضعيف. ذوبان جميع الكواشف هو أيضا المفتاح لعوائد عالية. إضافة كميات صغيرة (&lt;10٪ ت / ت) من المذيبات العضوية يمكن أن تساعد في حل المكونات غير القطبية، في حين أن الرقم الهيدروجيني الصحيحة وتركيز الملح ضرورية للحفاظ على البروتينات في حل ومطوية 12. لprotei غشاء كبيرنانوثانية مع بقايا سطح مسعور كبيرة، السطحي سيكون ضروريا لمنع البروتين من عجل 18. إذا كان البروتين في bioconjugation عرضة للأكسدة وdimerization، وقد تبين إضافة عامل مختزل مثل TCEP لتحسين المحاصيل bioconjugation 15. في الوضع الطبيعي للحد من البروتين في شكله أحادى، خالية من ثيول يسمح نسبة أكبر من المواقع ثيول النشطة يمكن الوصول إليها من قبل maleimide. ومع ذلك، من أجل الجمع ورياضيات الكيمياء هو مفتاح النجاح في زيادة العائد كما TCEP سوف تتفاعل أيضا مع maleimide. بإضافة maleimide بعد TCEP، سوف تستهلك TCEP عن طريق الحد من البروتين أولا. يستخدم نصف ما يعادل TCEP إلى البروتين لنفس السبب، بحيث الزائد TCEP لا يتوفر للرد سلبا مع maleimide الحرة. جسور ثاني كبريتيد الهيكلي على المناطق الداخلية من البروتين من غير المحتمل أن تتأثر إضافة TCEPأو الاختزال الأخرى مثل التلفزيون الرقمي الأرضي، شريطة أن البروتين لا يحتجزون في ظروف تغيير طبيعة مثل ارتفاع درجة الحرارة أو نسبة عالية من اليوريا. على سبيل المثال، إضافة وجود فائض كبير من DTT إلى CYT ج قبل FPLC تنقية لا يكون لها تأثير كبير على كمية من البروتين تعافى بعد تنقيتها. إذا كان يشتبه في الحد من الجسور السيستين الهيكلية التي TCEP، وهذا يمكن التأكد من تشغيل هلام بروتين تحت الأم الظروف، عدم تغيير طبيعة. يتم تنقيته رو (II) المسمى bisterpyridine السيتوكروم ج تصنيعه في هذه الطريقة عن طريق ني 2+ يجمد المعادن الانجذاب اللوني 14. توجد طرق تنقية أخرى، مثل حجم اللوني الاستبعاد، وأنيون / تبادل الأيونات الموجبة اللوني، واللوني تقارب محددة مثل مرحلة ثابتة الأجسام المضادة. بشكل عام، فإن هذه الطريقة لا يزال هو نفسه كما هو موضح أعلاه، مع تركيز وغسيل الكلى الخطوات followinز تنقية الكروماتوغرافي إلى إعادة المنتج bioconjugate إلى منطقة عازلة مناسبة للتخزين. الوسيلة الرئيسية لتحديد ما إذا كانت bioconjugation ناجحة هو عبر MALDI-TOF MS. هذه هي الطريقة الأكثر دقة لتأكد من الفرق الصغيرة في الكتلة بين البروتين الأصلي والبروتين المسمى تساهميا مع جزيء صغير، والفرق في كثير من الأحيان أقل من 1000 دا. الجزء الأكثر صعوبة في تشغيل التجربة MALDI-TOF MS هو اختيار مصفوفة واكتشاف تقنية. لكن caffeic حامض وقد وجد أن تكون موثوقة، مصفوفة للأغراض العامة لتحليل البروتينات وbioconjugates المستخدمة في هذا العمل. كبديل محتمل، حمض sinapinic هو آخر مصفوفة MALDI تستخدم عادة لتحليل البروتينات. تحليل البيانات MALDI-TOF MS واضحة نسبيا. ويبين الشكل 2 نموذجي الطيف MALDI-TOF MS كل نقية ISO-1 CYT ج (M ث = 12706 دا) ونقية رو (II) -cyt ج (Mث = 13559 دا)، وكلاهما تتوافق ارتباطا وثيقا الكتلة الجزيئية المحسوبة. ويمكن أيضا أن نقاء يتعين مراعاتها، مشيرا إلى عدم وجود ISO-2 السيتوكروم ج الذروة (م ث = 12532 دا) في الطيف غير المتفاعل وعدم وجود ISO-1 السيتوكروم ج الذروة في الطيف bioconjugate. ويمكن أيضا أن تقدر كتلة bioconjugate باستخدام هلام الكهربائي الشكل 3، 12٪ مكرر تريس هلام بروتين، يوفر قطعتين من الأدلة على bioconjugation. أولا، عدم وجود الفرقة ديمر في ظل ظروف غير الحد لرو (II) -cyt ج يشير إلى أن لم يعد هناك السيستين الحرة، والثانية، وتحول طفيف من الفرقة bioconjugate يترجم صعودا إلى زيادة في الوزن الجزيئي. المواد الهلامية بروتين لا تقدر بثمن ويمكن أن توفر نهائيا دليل على bioconjugation ناجحة ليس فقط لمرفقات جزيء صغير، ولكن أيضا لتركيب البروتين dimers 5 أو bioconjugates البروتين البوليمر 9. للبروتيناتيستخدم تحتوي على حاملات مثل البروتين الفلوري الأخضر أو ​​سيتوكروم التي تحتوي على الهيم، التحليل الطيفي للأشعة فوق البنفسجية فيس لتحديد تكوين والعائد من bioconjugate. 1: إضافة 1 خطية من الأطياف المواد الأولية تسمح ببناء طيف الأشعة فوق البنفسجية فيس افتراضية من bioconjugate، كما هو مبين في الشكل (4) وبمقارنة الطيف bioconjugate الفعلي لهذا 1: إضافة الطيف 1، يمكن تكوين يكون الاستدلال . على سبيل المثال، إذا كان اثنان أو أكثر رو (II) (طن سنويا) و2 -maleimides تعلق nonspecifically للبروتين، والفرقة 480 نانومتر من bioconjugate ستكون أعلى من الطيف المتوقعة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن تركيز bioconjugate يمكن أن يقترب باستخدام نانومتر قيمة الامتصاصية المولية 410 من 97.6 سم -1 ملي -1. ومن المفترض أن يكون الشيء نفسه بالنسبة للbioconjugate لأن رو (II) (طن سنويا) 2 -maleimide ديه الحد الأدنى من الامتصاصية في هذه المنطقة. وتجدر الإشارة إلى ثار bioconjugation عبر الكيمياء السيستين maleimide لديها العديد من القيود. أولا، يجب أن يكون البروتين من الفائدة يجب أن يؤديها لذلك، يمكن الوصول إليها بقايا السيستين، أو هندسة البروتينات شيء آخر واحدة لتقديم واحد. ثانيا، إن السندات السيستين maleimide هو عرضة للتبادل مع التجولات مجانية أخرى، مثل الزلال والجلوتاثيون في سياق تطبيقات البلازما 19. هذا التبادل هو يعتمد بشكل كبير على الوصول المذيبات والمسؤول المحلي على سطح البروتين. قد يكون لا يزال الروابط Maleimide-ثيول مناسبة للتطبيقات البلازما، ولكن يجب أن يتم التحقق الاستقرار على المدى الطويل باستخدام مطياف الكتلة والكهربائي للهلام. على الرغم من هذا، و، وارتفاع مرفق ذو العائد محددة للغاية من جزيئات جديدة مثل الأصباغ الفلورية، ومراكز الأكسدة، والبوليمرات، وغيرها من البروتينات البروتينات عن طريق الكيمياء السيستين maleimide هي تقنية قوية تسمح مجموعة من بنيات الجزيئات المثيرة للاهتمام أن يكونccessed. وجود كميات كبيرة من bioconjugates البروتين كيميائيا واضحة المعالم هو المفتاح لدراسات مستقبلية تنطوي على بروتين ملزمة، التجميع الذاتي، حركية الانزيم وتوطين البروتين. كما هو موضح أعلاه، ابتداء من تنقية المواد، واختيار من وسط التفاعل، وإضافة الكواشف التكميلية مثل الحد من وكلاء أو السطحي فقط يكون لها تأثير كبير على عائدات bioconjugation. وحققت تنقية بسهولة عن طريق اللوني البروتين متوافق، ويتم إنجاز توصيف باستخدام مزيج من MALDI-TOF MS، هلام الكهربائي، والأشعة فوق البنفسجية فيس التحليل الطيفي.

Bioconjugation ينطوي على ربط تساهمي جزيء حيوي واحد مع آخر أو مع جزيء اصطناعي مثل صبغة، المخدرات أو البوليمر. وتستخدم أساليب bioconjugation البروتين الآن على نطاق واسع في العديد من المجموعات البحثية والكيمياء، والبيولوجيا، وتكنولوجيا النانو مع تطبيقات تتراوح بين الفلورسنت صبغ العلامات 1،2، مما يجعل من البروتين (الضد) -prodrugs 3 (تقارن الأجسام المضادة المخدرات - ADCS) توليف البروتين dimers 4،5 ، وصولا إلى السيارات الهجينة البروتين البوليمر الذاتي تجميع 6،7 المستخدمة في النانوي 8 و أنظمة الكيمياء 9. خصوصية الكيمياء المستخدمة لbioconjugation، في حين لا تنتقد دائما، هو من أهمية قصوى بالنسبة bioconjugates البروتين الأكثر وظيفية، حتى لا تتداخل مع موقع نشط من البروتين الهدف. يحتاج رد فعل bioconjugation المثالي لتحقيق عدة معايير، بما في ذلك: أ) استهداف مواقع نادرة أو فريدة من نوعها على البروتين من الفائدة،ب) أن يكون انتقائيا نحو تحقيق هذا الهدف، ج) المضي قدما في ظل ظروف غير تغيير طبيعة لتجنب البروتين تتكشف والرابع) تكون ذات العائد المرتفع مثل البروتين المستهدف عادة ما يتوافر فقط في تركيز شبه millimolar. وmaleimide - السيستين مايكل بالإضافة يقترب من تحقيق كل هذه المعايير، ولديها لهذا السبب ادعى طويلة وضعا خاصا في مجال bioconjugate الكيمياء 10. هذا هو لأنني) العديد من البروتينات التي تحتوي على السيستين واحد فقط بقايا على سطحها يمكن راثيا هناك، ثانيا) في الرقم الهيدروجيني الصحيحة رد فعل انتقائي للغاية نحو السيستين، ج) وهي تنطلق بسلاسة في المخازن المائية والرابع) فهي سريعة جدا مع معدل ثابت الدرجة الثانية من maleimides للبروتينات التي تحتوي على السيستين ذكرت أن تتجاوز 5000 م -1 ثانية -1 في بعض الحالات 11. قدمت البروتين من الفائدة يمكن أن يتسامح مع كمية صغيرة (≈ 5-10٪) من عضوية المشارك المذيبات 12، أي ما يقرب صبغ functionalized maleimide، صlymer، السطح أو بروتين آخر يمكن ربط البروتينات. وبالإضافة إلى ذلك، maleimides هم أكثر تحديدا لcysteines على البروتينات من iodoacetamides، والتي هي أكثر عرضة للتفاعل مع محب للنواة أخرى في درجة الحموضة المرتفعة. وأكثر استقرارا من الإقتران القائم على ثاني كبريتيد التي تحتاج إلى أن تبقى في درجة الحموضة الحمضية لمنع الصرف ثاني كبريتيد 13. نحن هنا نورد بروتوكول عام لتصريف جزيئات functionalized maleimide إلى البروتين تحتوي على بقايا السيستين واحدة باستخدام تفاعل بين رو (II) حامل اللون المستندة إلى والبروتين الأكسدة السيتوكروم ج كمثال على ذلك. هذا البروتوكول هو ينطبق أيضا على معظم البروتينات الأخرى التي تحتوي على الوصول بقايا السيستين السطحية والمستهدفة functionalized maleimide المقابلة، سواء كان بروتين آخر، صبغة الفلورسنت، وحامل اللون أو البوليمر الاصطناعية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="913">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">sodium dihydrogen phosphate</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">71496</td>
			<td style="width:263px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">sodium hydroxide</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">71691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">sodium chloride</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">73575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">cytochrome c, from saccaromyces cerevisiae</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">C2436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">dithiothreitol</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">43819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">TSKgel SP-5PW</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">Tosoh SP-5PW, 07161</td>
			<td>3.3 mL strong cation exchange column</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amicon Ultra-15&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Merck-Millipore</td>
			<td style="width:151px;">UFC900308</td>
			<td>3.5 kDa spin filter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Slide-A-Lyzer mini dialysis units</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">66333</td>
			<td>3.5 kDa dialysis cassetes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Ru(II) bisterpyridine maleimide</td>
			<td style="width:196px;">Lab made</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>see ref (14)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">acetonitrile</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">A3396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">03609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">93284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">imidazole</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">56749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">nickel acetate</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">244066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">AcroSep IMAC Hypercell column</td>
			<td style="width:196px;">Pall</td>
			<td style="width:151px;">via VWR: 569-1008</td>
			<td>1 mL IMAC column</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">0.2 micron cellulose membrane filter</td>
			<td style="width:196px;">Whatman</td>
			<td style="width:151px;">Z697958</td>
			<td>47 mm filter for buffers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">0.2 micron PVDF membrane filter</td>
			<td style="width:196px;">Merck-Millipore</td>
			<td style="width:151px;">SLGV013SL</td>
			<td>syringe filters for proteins</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">hydrochloric acid</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">84426</td>
			<td>extremely corrosive! Use caution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">caffeic acid</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">60018</td>
			<td>MALDI matrix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">trifluoroacetic acid</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">91707</td>
			<td>extremely corrosive! Use caution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SimplyBlue SafeStain</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">LC6060</td>
			<td>Coomassie blue solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">NuPAGE Novex 12% Bis-Tris Gel</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">NP0342BOX</td>
			<td>precast protein gels</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">LC5925</td>
			<td>premade protein ladder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">NP0008</td>
			<td>premade gel sample buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">NuPAGE Sample Reducing Agent (10X)</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">NP0004</td>
			<td>premade gel reducing agent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">NuPAGE MES SDS Running Buffer (20X)</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">NP0002</td>
			<td>premade gel running buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Voyager DE STR MALDI reflectron TOF MS</td>
			<td style="width:196px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Acta FPLC</td>
			<td style="width:196px;">GE</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>Fast Protein Liquid Chromatography</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Cary 50 Bio Spectrophotometer</td>
			<td style="width:196px;">Varian-Agilent</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>UV-Vis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Milli-Q ultrapure water dispenser</td>
			<td style="width:196px;">Merck-Millipore</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Low volume UV-Vis Cuvette</td>
			<td style="width:196px;">Hellma</td>
			<td style="width:151px;">105-201-15-40</td>
			<td>100 microliter cuvette</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis of protein bioconjugates via cysteine-maleimide chemistry

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the development of antibody drug conjugates (ADCs) and nanomedicine, fluorescent microscopy and systems chemistry. For many of these applications, specificity of the bioconjugation method used is of prime concern. The Michael addition of maleimides with cysteine(s) on the target proteins is highly selective and proceeds rapidly under mild conditions, making it one of the most popular methods for protein bioconjugation.
We demonstrate here the modification of the only surface-accessible cysteine residue on yeast cytochrome c with a ruthenium(II) bisterpyridine maleimide. The protein bioconjugation is verified by gel electrophoresis and purified by aqueous-based fast protein liquid chromatography in 27% yield of isolated protein material. Structural characterization with MALDI-TOF MS and UV-Vis is then used to verify that the bioconjugation is successful. The protocol shown here is easily applicable to other cysteine - maleimide coupling of proteins to other proteins, dyes, drugs or polymers.

ويؤكد تركيب bioconjugates بواسطة ثلاث طرق رئيسية: مصفوفة بمساعدة الليزر الامتزاز التأين وقت الرحلة الطيف الكتلي (MALDI-TOF MS)، بولي أكريلاميد الكهربائي للهلام، والأشعة فوق البنفسجية-مرئي (أشعة فوق البنفسجية فيس) التحليل الطيفي، كما هو مبين في الشكلين 2، 3 و 4. زيادة الجماعية المقابلة لكتلة جزيء صغير إلحاق، وعدم وجود البروتين المتفاعل توضح نجاح الربط التساهمي رو (II) (طن سنويا) 2 -maleimide إلى CYT ج وتنقية لاحقة من bioconjugate. الطيف للأشعة فوق البنفسجية فيس من bioconjugate يسمح العائد على أن تحسب مع الامتصاصية في 410 نانومتر، وذلك بمقارنة الطيف إلى توقع 1: الطيف 1 إضافة المواد الأولية ويمكن الاستدلال على تكوين bioconjugate. في المثال أعلاه، فإن العائد يختلف نوعا ما عن الدفعي إلى دفعة لكنها عادة ما بين 15-27٪ بعد FPLC purificaنشوئها 15. وبالإضافة إلى ذلك، وظهور ذروة جديدة في اللوني خلال تنقية يؤكد تخليق نوع جديد. ويتمثل هذا في الشكل (5)، حيث تحليل آثار أشعة فوق البنفسجية فيس مختلفة يمكن أن تشير إلى ما إذا كانت الأنواع يحتوي على رو (II) عنصر -maleimide (طن سنويا) 2. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/54157/54157fig2.jpg" /> الشكل 2. MALDI-TOF قداس أطياف البروتينات. أطياف الشامل من محض ISO-1 السيتوكروم ج (أسود) ورو (II) -cyt ج (الحمراء). قمم يمكن ملاحظة أن تتوافق مع الجماهير المحسوبة ISO-1 CYT ج (12706 دا) ورو (II) -cyt ج (13559 دا) مع ناتج إضافة caffeic حامض مرئية على +179 دا. ويعتبر هذا ناتج إضافة بكميات أعلى في CYT غير المتفاعل ج قpectra بسبب رد فعل بين α، β-الكربونيل غير المشبعة من caffeic حامض وثيول خالية من البروتين في ظل ظروف MALDI الطاقة العالية. عادة ما ينظر إليها adducts مصفوفة في MALDI-MS ويمكن أن تكون التساهمية وغير التساهمية في الطبيعة. أطياف هي خط الأساس تصحيح، والضوضاء التي تمت تصفيتها، وتطبيع للمقارنة. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54157/54157fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/54157/54157fig3.jpg" /> الشكل 3. SDS-PAGE من البروتينات 12٪ مكرر تريس هلام انخفاض وغير مخفضة CYT ج ورو (II) ج -cyt. حارة 3 يحتوي على مستوى البروتين قبل الملون، مع كتلة ببتيد المشروح إلى حق كل فرقة (كيلو دالتون). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54157/54157fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض أكبر أصدارات</a>ن من هذا الرقم. <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/54157/54157fig4.jpg" /> الشكل 4. الأشعة فوق البنفسجية في ضوء الأطياف من البروتينات: طيف الامتصاص رو (II) -cyt ج (الأخضر) يتوافق ارتباطا وثيقا بالإضافة الخطية (متقطع الأزرق) من الذهب الخالص، غير المتفاعل CYT ج (الحمراء)، والمتفاعل رو (II) ( طن سنويا) 2 -maleimide (أسود). هذا يدل على أن bioconjugate يتكون من: 1 المرفق 1 من maleimide للبروتين <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54157/54157fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 5" src="/files/ftp_upload/54157/54157fig5.jpg" /> الرقم 5. المخطط الاستشرابي تنقية ني ايماك من bioconjugates: ايماك أثر رو (II) -cyt ج تنقية. أشعة فوق البنفسجية فيس يتتبع: 410 نانومتر يتوافق مع الفرقة سوريه من قبرصير ج و 280 نانومتر يتوافق مع كلا CYT ج ورو (II) (طن سنويا) 2 -maleimide، و 475 نانومتر يتوافق مع تهمة نقل الفرقة المعادن ليجند من (II) المجمع الروتينيوم. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54157/54157fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry at JoVE.com

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

تفاصيل هذا البروتوكول الخطوات الهامة اللازمة لbioconjugation من السيستين التي تحتوي على البروتين لmaleimide، بما في ذلك تنقية الكاشف، ظروف التفاعل، وتنقية bioconjugate وتوصيف bioconjugate.

تخليق البروتين Bioconjugates<em&gt; عبر</em&gt; سيستين-maleimide الكيمياء

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

synthesis-of-protein-bioconjugates-via-cysteine-maleimide-chemistry

Nanyang Technological University

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Analytical Chemistry

Chemistry

Unit 1

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Chemical Applications of Statistical Analyses

SCIENTISTS IN ACTION

38.1K Views.  The University of New South Wales.  تفاصيل هذا البروتوكول الخطوات الهامة اللازمة لbioconjugation من السيستين التي تحتوي على البروتين لmaleimide، بما في ذلك تنقية الكاشف، ظروف التفاعل، وتنقية bioconjugate وتوصيف bioconjugate. 

Video: Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Antiviral Tetrahydrocarbazole Derivatives by Photochemical and Acid-catalyzed C-H Functionalization via Intermediate Peroxides (CHIPS)

The direct functionalization of C-H bonds is an important and long standing goal in organic chemistry. Such transformations can be very powerful in order to streamline synthesis by saving steps, time and material compared to conventional methods that require the introduction and removal of activating or directing groups. Therefore, the functionalization of C-H bonds is also attractive for green chemistry. Under oxidative conditions, two C-H bonds or one C-H and one heteroatom-H bond can be transformed to C-C and C-heteroatom bonds, respectively. Often these oxidative coupling reactions require synthetic oxidants, expensive catalysts or high temperatures. Here, we describe a two-step procedure to functionalize indole derivatives, more specifically tetrahydrocarbazoles, by C-H amination using only elemental oxygen as oxidant. The reaction uses the principle of C-H functionalization via Intermediate PeroxideS (CHIPS). In the first step, a hydroperoxide is generated oxidatively using visible light, a photosensitizer and elemental oxygen. In the second step, the N-nucleophile, an aniline, is introduced by Br&#248;nsted-acid catalyzed activation of the hydroperoxide leaving group. The products of the first and second step often precipitate and can be conveniently filtered off. The synthesis of a biologically active compound is shown.

Synthesis of Antiviral Tetrahydrocarbazole Derivatives by Photochemical and Acid-catalyzed C-H Functionalization via Intermediate Peroxides CHIPS

A two-step procedure for the synthesis of pharmaceutically active indole-derivatives by C-H functionalization with anilines is described, using photo- and Br&#248;nsted acid catalysis.

توليف مشتقات المضادة للفيروسات عن طريق Tetrahydrocarbazole الضوئية وحمض حفز-CH Functionalization عبر الوسيط بيروكسيد (شيبس)

The direct functionalization of C-H bonds is an important and long standing goal in organic chemistry. Such transformations can be very powerful in order ...

Synthesis and Characterization of Functionalized Metal-organic Frameworks

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and technological applications. Their signature property is their ultrahigh porosity, which however imparts a series of challenges when it comes to both constructing them and working with them. Securing desired MOF chemical and physical functionality by linker/node assembly into a highly porous framework of choice can pose difficulties, as less porous and more thermodynamically stable congeners (e.g., other crystalline polymorphs, catenated analogues) are often preferentially obtained by conventional synthesis methods. Once the desired product is obtained, its characterization often requires specialized techniques that address complications potentially arising from, for example, guest-molecule loss or preferential orientation of microcrystallites. Finally, accessing the large voids inside the MOFs for use in applications that involve gases can be problematic, as frameworks may be subject to collapse during removal of solvent molecules (remnants of solvothermal synthesis). In this paper, we describe synthesis and characterization methods routinely utilized in our lab either to solve or circumvent these issues. The methods include solvent-assisted linker exchange, powder X-ray diffraction in capillaries, and materials activation (cavity evacuation) by supercritical CO2 drying. Finally, we provide a protocol for determining a suitable pressure region for applying the Brunauer-Emmett-Teller analysis to nitrogen isotherms, so as to estimate surface area of MOFs with good accuracy.

Synthesis, activation, and characterization of intentionally designed metal-organic framework materials is challenging, especially when building blocks are incompatible or unwanted polymorphs are thermodynamically favored over desired forms. We describe how applications of solvent-assisted linker exchange, powder X-ray diffraction in capillaries and activation via supercritical CO2 drying, can address some of these challenges.

أطر توليف وتوصيف بين functionalized المعدنية العضوية

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and ...

Synthesis and Reaction Chemistry of Nanosize Monosodium Titanate

This paper describes the synthesis and peroxide-modification of nanosize monosodium titanate (nMST), along with an ion-exchange reaction to load the material with Au(III) ions. The synthesis method was derived from a sol-gel process used to produce micron-sized monosodium titanate (MST), with several key modifications, including altering reagent concentrations, omitting a particle seed step, and introducing a non-ionic surfactant to facilitate control of particle formation and growth. The resultant nMST material exhibits spherical-shaped particle morphology with a monodisperse distribution of particle diameters in the range from 100 to 150&#160;nm. The nMST material was found to have a Brunauer-Emmett-Teller (BET) surface area of 285 m2g-1, which is more than an order of magnitude higher than the micron-sized MST. The isoelectric point of the nMST measured 3.34 pH units, which is a pH unit lower than that measured for the micron-size MST. The nMST material was found to serve as an effective ion exchanger under weakly acidic conditions for the preparation of an Au(III)-exchange nanotitanate. In addition, the formation of the corresponding peroxotitanate was demonstrated by reaction of the nMST with hydrogen peroxide.

The surfactant mediated sol-gel synthesis of nanosized monosodium titanate is described, along with preparation of the corresponding peroxide modified material. An ion-exchange reaction with Au(III) is also presented.

التوليف وتفاعل كيمياء Nanosize أحادية الصوديوم ملح التيتان

This paper describes the synthesis and peroxide-modification of nanosize monosodium titanate (nMST), along with an ion-exchange reaction to load the ...

The Synthesis of [Sn10(Si(SiMe3)3)4]2- Using a Metastable Sn(I) Halide Solution Synthesized via a Co-condensation Technique

The number of well-characterized metalloid tin clusters, synthesized by applying the disproportionation of a metastable Sn(I) halide in the presence of a sterically demanding ligand, has increased in recent years. The metastable Sn(I) halide is synthesized at&#160;&#34;outer space conditions&#34; via the preparative co-condensation technique. Thereby, the subhalide is synthesized in an oven at high temperatures, around 1,300 &#176;C, and at reduced pressure by the reaction of elemental tin with hydrogen halide gas (e.g., HCl). The subhalide (e.g., SnCl) is trapped within a matrix of an inert solvent, like toluene at -196 &#176;C. Heating the solid matrix to -78 &#176;C gives a metastable solution of the subhalide. The metastable subhalide solution is highly reactive but can be stored at -78 &#176;C for several weeks. On heating the solution to room temperature, a disproportionation reaction occurs, leading to elemental tin and the corresponding dihalide. By applying bulky ligands like Si(SiMe3)3, the intermediate metalloid cluster compounds can be trapped before complete disproportionation to elemental tin. Hence, the reaction of a metastable Sn(I)Cl solution with Li-Si(SiMe3)3 gives [Sn10(Si(SiMe3)3)4]2- 1 as black crystals in high yield. 1 is formed via a complex reaction sequence including salt metathesis, disproportionation, and degradation of larger clusters. Further, 1 can be analyzed by various methods like NMR or single crystal X-ray structure analysis.

The Synthesis of [Sn10SiSiMe334]2- Using a Metastable SnI Halide Solution Synthesized via a Co-condensation Technique

The disproportionation reaction of a metastable Sn(I) chloride solution, obtained via the preparative co-condensation technique, is used for the synthesis of a metalloid tin cluster compound.

وتوليف [القصدير<sub&gt; 10</sub&gt; (سي (سايم<sub&gt; 3</sub&gt;)<sub&gt; 3</sub&gt;)<sub&gt; 4</sub&gt;]<sup&gt; 2</sup<sup&gt; -</sup&gt; باستخدام متبدل الاستقرار القصدير (I) الحل هالايد تجميعي عبر تقنية المشارك التكثيف

The number of well-characterized metalloid tin clusters, synthesized by applying the disproportionation of a metastable Sn(I) halide in the presence of a ...

Protocol for the Solid-phase Synthesis of Oligomers of RNA Containing a 2'-O-thiophenylmethyl Modification and Characterization via Circular Dichroism

Solid-phase synthesis has been used to obtain canonical and modified polymers of nucleic acids, specifically of DNA or RNA, which has made it a popular methodology for applications in various fields and for different research purposes. The procedure described herein focuses on the synthesis, purification, and characterization of dodecamers of RNA 5&#39;-[CUA CGG AAU CAU]-3&#39; containing zero, one, or two modifications located at the C2&#39;-O-position. The probes are based on 2-thiophenylmethyl groups, incorporated into RNA nucleotides via standard organic synthesis and introduced into the corresponding oligonucleotides via their respective phosphoramidites. This report makes use of phosphoramidite chemistry via the four canonical nucleobases (Uridine (U), Cytosine (C), Guanosine (G), Adenosine (A)), as well as 2-thiophenylmethyl functionalized nucleotides modified at the 2&#39;-O-position; however, the methodology is amenable for a large variety of modifications that have been developed over the years. The oligonucleotides were synthesized on a controlled-pore glass (CPG) support followed by cleavage from the resin and deprotection under standard conditions, i.e., a mixture of ammonia and methylamine (AMA) followed by hydrogen fluoride/triethylamine/N-methylpyrrolidinone. The corresponding oligonucleotides were purified via polyacrylamide electrophoresis (20% denaturing) followed by elution, desalting, and isolation via reversed-phase chromatography (Sep-pak, C18-column). Quantification and structural parameters were assessed via ultraviolet-visible (UV-vis) and circular dichroism (CD) photometric analysis, respectively. This report aims to serve as a resource and guide for beginner and expert researchers interested in embarking in this field. It is expected to serve as a work-in-progress as new technologies and methodologies are developed. The description of the methodologies and techniques within this document correspond to a DNA/RNA synthesizer (refurbished and purchased in 2013) that uses phosphoramidite chemistry.

Protocol for the Solid-phase Synthesis of Oligomers of RNA Containing a 2'-O-thiophenylmethyl Modification and Characterization via Circular Dichroism

This article provides a detailed procedure on the solid-phase synthesis, purification, and characterization of dodecamers of RNA modified at the C2&#39;-O-position. UV-vis and circular dichroism photometric analyses are used to quantify and characterize structural aspects, i.e., single-strands or double-strands.

بروتوكول لتجميع المرحلة الصلبة من أوليغوميرس من الحمض النووي الريبي تحتوي على 2&#39;-<em&gt; O</em&gt; -thiofenylmethyl تعديل وتوصيف عن طريق التعميم ديكرويسم

Solid-phase synthesis has been used to obtain canonical and modified polymers of nucleic acids, specifically of DNA or RNA, which has made it a popular ...

Synthesis of Substrate-Bound Au Nanowires Via an Active Surface Growth Mechanism

Advancing synthetic capabilities is important for the development of nanoscience and nanotechnology. The synthesis of nanowires has always been a challenge, as it requires asymmetric growth of symmetric crystals. Here, we report a distinctive synthesis of substrate-bound Au nanowires. This template-free synthesis employs thiolated ligands and substrate adsorption to achieve the continuous asymmetric deposition of Au in solution at ambient conditions. The thiolated ligand prevented the Au deposition on the exposed surface of the seeds, so the Au deposition only occurs at the interface between the Au seeds and the substrate. The side of the newly deposited Au nanowires is immediately covered with the thiolated ligand, while the bottom facing the substrate remains ligand-free and active for the next round of Au deposition. We further demonstrate that this Au nanowire growth can be induced on various substrates, and different thiolated ligands can be used to regulate the surface chemistry of the nanowires. The diameter of the nanowires can also be controlled with mixed ligands, in which another &#34;bad&#34; ligand could turn on the lateral growth. With the understanding of the mechanism, Au nanowire-based nanostructures can be designed and synthesized.

We report a solution-based method to synthesize substrate-bound Au nanowires. By tuning the molecular ligands used during the synthesis, the Au nanowires can be grown from various substrates with different surface properties. Au nanowire-based nanostructures can also be synthesized by adjusting the reaction parameters.

تركيب أسلاك الاتحاد الأفريقي الركازة زمنياً عبر إليه نمو نشط السطح

Advancing synthetic capabilities is important for the development of nanoscience and nanotechnology. The synthesis of nanowires has always been a ...

A Rapid Synthesis Method for Au, Pd, and Pt Aerogels Via Direct Solution-Based Reduction

Here, a method to synthesize gold, palladium, and platinum aerogels via a rapid, direct solution-based reduction is presented. The combination of various precursor noble metal ions with reducing agents in a 1:1 (v/v) ratio results in the formation of metal gels within seconds to minutes compared to much longer synthesis times for other techniques such as sol-gel. Conducting the reduction step in a microcentrifuge tube or small volume conical tube facilitates a proposed nucleation, growth, densification, fusion, equilibration model for gel formation, with final gel geometry smaller than the initial reaction volume. This method takes advantage of the vigorous hydrogen gas evolution as a by-product of the reduction step, and as a consequence of reagent concentrations. The solvent accessible specific surface area is determined with both electrochemical impedance spectroscopy and cyclic voltammetry. After rinsing and freeze drying, the resulting aerogel structure is examined with scanning electron microscopy, X-ray diffractometry, and nitrogen gas adsorption. The synthesis method and characterization techniques result in a close correspondence of aerogel ligament sizes. This synthesis method for noble metal aerogels demonstrates that high specific surface area monoliths may be achieved with a rapid and direct reduction approach.

A rapid, direct solution-based reduction synthesis method to obtain Au, Pd, and Pt aerogels is presented.

أسلوب توليف سريع للاتحاد الأفريقي و Pd أيروجيلس حزب العمال عن طريق الاختزال المباشر القائم على الحل

Here, a method to synthesize gold, palladium, and platinum aerogels via a rapid, direct solution-based reduction is presented. The combination of various ...

Synthesis of Esters Via a Greener Steglich Esterification in Acetonitrile

The Steglich esterification is a widely-used reaction for the synthesis of esters from carboxylic acids and alcohols. While efficient and mild, the reaction is commonly performed using chlorinated or amide solvent systems, which are hazardous to human health and the environment. Our methodology utilizes acetonitrile as a greener and less hazardous solvent system. This protocol exhibits rates and yields that are comparable to traditional solvent systems and employs an extraction and wash sequence that eliminates the need for the purification of the ester product via column chromatography. This general method can be used to couple a variety of carboxylic acids with 1&#176; and 2&#176; aliphatic alcohols, benzylic and allylic alcohols, and phenols to obtain pure esters in high yields. The goal of the protocol detailed here is to provide a greener alternative to a common esterification reaction, which could serve useful for ester synthesis in both academic and industrial applications.

A modified Steglich esterification reaction was used to synthesize a small library of ester derivatives with primary and secondary alcohols. The methodology uses a non-halogenated and greener solvent, acetonitrile, and enables product isolation in high yields without the need for chromatographic purification.

توليف استرات عبر أكثر اخضرارا الأسترة ستيجليتش في الاسيتو الانيتريل

The Steglich esterification is a widely-used reaction for the synthesis of esters from carboxylic acids and alcohols. While efficient and mild, the ...

Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

Over the last 50 years, Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) has emerged as a powerful technology to harness the transcriptional and translational capacity of cells within a test tube. By obviating the need to maintain the viability of the cell, and by eliminating the cellular barrier, CFPS has been foundational to emerging applications in biomanufacturing of traditionally challenging proteins, as well as applications in rapid prototyping for metabolic engineering, and functional genomics. Our methods for implementing an E. coli-based CFPS platform allow new users to access many of these applications. Here, we describe methods to prepare extract through the use of enriched media, baffled flasks, and a reproducible method of tunable sonication-based cell lysis. This extract can then be used for protein expression capable of producing 900 &#181;g/mL or more of super folder green fluorescent protein (sfGFP) in just 5 h from experimental setup to data analysis, given that appropriate reagent stocks have been prepared beforehand. The estimated startup cost of obtaining reagents is $4,500 which will sustain thousands of reactions at an estimated cost of $0.021 per &#181;g of protein produced or $0.019 per &#181;L of reaction. Additionally, the protein expression methods mirror the ease of the reaction setup seen in commercially available systems due to optimization of reagent pre-mixes, at a fraction of the cost. In order to enable the user to leverage the flexible nature of the CFPS platform for broad applications, we have identified a variety of aspects of the platform that can be tuned and optimized depending on the resources available and the protein expression outcomes desired.

Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

This protocol details the steps, costs, and equipment necessary to generate E. coli-based cell extracts and implement in vitro protein synthesis reactions within 4 days or less. To leverage the flexible nature of this platform for broad applications, we discuss reaction conditions that can be adapted and optimized.

الإشريكيّة القولونية-"على أساس تخليق البروتين" الخلية الحرة: البروتوكولات لتكنولوجيا منصة قوية ومرنة، وموجودا

Over the last 50 years, Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) has emerged as a powerful technology to harness the transcriptional and translational capacity ...

Synthesis of Monodisperse Cylindrical Nanoparticles via Crystallization-driven Self-assembly of Biodegradable Block Copolymers

The production of monodisperse cylindrical micelles is a significant challenge in polymer chemistry. Most cylindrical constructs formed from diblock copolymers are produced by one of three techniques: thin film rehydration, solvent switching or polymerization-induced self-assembly, and produce only flexible, polydisperse cylinders. Crystallization-driven self-assembly (CDSA) is a method which can produce cylinders with these properties, by stabilizing structures of a lower curvature due to the formation of a crystalline core. However, the living polymerization techniques by which most core-forming blocks are formed are not trivial processes and the CDSA process may yield unsatisfactory results if carried out incorrectly. Here, the synthesis of cylindrical nanoparticles from simple reagents is shown. The drying and purification of reagents prior to a ring-opening polymerization of &#949;-caprolactone catalyzed by diphenyl phosphate is described. This polymer is then chain extended by methyl methacrylate (MMA) followed by N,N-dimethyl acrylamide (DMA) using reversible addition&#8722;fragmentation chain-transfer (RAFT) polymerization, affording a triblock copolymer that can undergo CDSA in ethanol. The living CDSA process is outlined, the results of which yield cylindrical nanoparticles up to 500 nm in length and a length dispersity as low as 1.05. It is anticipated that these protocols will allow others to produce cylindrical nanostructures and elevate the field of CDSA in the future.

Crystallization-driven self-assembly (CDSA) displays the unique ability to fabricate cylindrical nanostructures of narrow length distributions. The organocatalyzed ring-opening polymerization of &#949;-caprolactone and subsequent chain extensions of methyl methacrylate and N,N-dimethyl acrylamide are demonstrated. A living CDSA protocol that produces monodisperse cylinders up to 500 nm in length is outlined.

توليف جسيمات نانوية أسطوانية أحادية التشتت عبر التجميع الذاتي للبوليمرات القابلة للتحلل البيولوجي

The production of monodisperse cylindrical micelles is a significant challenge in polymer chemistry. Most cylindrical constructs formed from diblock ...