هذه الطريقة مفيدة للإجابة على بعض الأسئلة الرئيسية في مجال البحوث التمثيل الضوئي مثل المجمعات الثيلاكويد المفترضة من الناحية الفسيولوجية مع مكونات متصلة بنشاط؟ الميزة الرئيسية للجل الأخضر والبروتوكول TCSPC الموصوفة هنا هو أنه سريع وقوي. يمكن بسهولة معالجة العينات وتحليلها في يوم واحد، مما يجعل قضايا التخزين والاستقرار أقل أهمية.
على الرغم من أن TCSPC يمكن أن توفر نظرة ثاقبة على أنظمة التمثيل الضوئي التي درسناها هنا ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضًا على أنظمة أخرى تتراوح بين المواد الكيميائية والبيولوجية والفيزيائية مثل دراسات الحركة الجزيئية الفلورية في السوائل أو الخلايا أو الزخارف الهيكلية الجديدة مثل الطبقات أحادية الجزيئات والسوائل الأيونية. لبدء هذا الإجراء، وإعداد حلول الأسهم اللازمة والمواد الهلامية الخضراء المصغرة كما هو مبين في بروتوكول النص. بعد ذلك، الحصول على بعض الجليد وتعتيم الأضواء.
باستخدام التجانس Dounce الزجاج، التجانس تماما أوراق السبانخ في ما يقرب من واحد إلى ملليلتر اثنين من العازلة TMK. لإنشاء جهاز تصفية بسيط، قم بقطع مسح مهمة حساسة إلى نصفين وأضعافها إلى أرباع. إزالة المكبس من حقنة، ومن ثم حزمة مسح المهمة مطوية في الجزء السفلي من الحقنة.
Pipette المتجانسة ورقة في وسط تصفية مسح المهمة، ثم استخدام المكبس لتمرير تجانس من خلال مرشح وجمعه في أنبوب الطرد المركزي 1.5 ملليلتر. الطرد المركزي المتجانس في 5، 000 غرام وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق ل بيليه المواد غير قابلة للذوبان، بما في ذلك الأغشية الثيلاكويد. تجاهل افرا و resuspend بيليه في ملليلتر واحد من العازلة TMK.
لاستخراج الكلوروفيرل من كل عينة، خذ 50 ميكرولتر أليكوت ونقله إلى أنبوب ميكروسنتر 1.5 ملليلتر. إضافة 950 ميكرولترات من الميثانول، وغطاء الأنبوب، ومزيج عن طريق عكس ذلك عدة مرات. جهاز طرد مركزي في 10،000 غرام لمدة 10 دقائق ل بيليه البروتينات عجلت.
باستخدام قياسات تركيز الكلوروفير كدليل، إزالة وتجاهل بعض حجم من كل عينة حسب الضرورة حتى كل أنبوب يحتوي على نفس الكمية الإجمالية من الكلورو. أجهزة الطرد المركزي في 5، 000 غرام لمدة 10 دقائق لإعادة بيليه الأغشية ثيلاكويد. إزالة والتخلص من افرنح، مع الحرص على إزالة كل من افرنح دون إزعاج بيليه.
أولا، ذوبان aliquot من TMK 30٪ محلول المنظفات الجلسرين. عكس عدة مرات لخلط والحفاظ على الحل على الجليد. إضافة حجم مناسب من محلول المنظفات إلى حل بيليه ويؤدي إلى تركيز الكلورو النهائي من ملليغرام واحد لكل ملليلتر.
الماصات صعودا وهبوطا مرارا وتكرارا في حين يجري الحرص على تجنب زبد في العينة. ثم، والحفاظ على العينة على الجليد للسماح عينات thylakoid ل solubilize. بعد الانتهاء solubilization، الطرد المركزي العينة في 10، 000 غرام وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق ل بيليه المواد غير قابلة للذوبان، مما أدى إلى واضحة، خضراء داكنة متراكبة.
بعد هذا، تحميل 15 ميكرولترات من thylakoid مُنَتَلِد مباشرة على كل بئر من هلام أصلي 1.5 ملليمتر تم إعداده مسبقًا. باستخدام 1X تشغيل العازلة، تبدأ تشغيل هلام الأخضر الأصلي في 100 فولت. ضع خزان الجل بأكمله على الجليد الرطب طوال فترة الركض للتخفيف من التسخين المقاوم.
عندما ينتهي الجل من الركض، قم بإزالته من الخلية الكهربائية وشطف المخزن المؤقت للتخلص من لوحات الجل مع الماء المقطر. إزالة لوحة أعلى من هلام ثم شطف هلام بالماء المقطر. ضع الجل ، الذي لا يزال على لوحة الزجاج السفلي ، على الجليد ، عندما لا يكون الجل قيد الاستخدام ، قم بتغطيته بلفاف بلاستيكي والاحتفاظ به في الظلام لمنعه من الجفاف.
بعد ذلك، استخدم مشرط حاد أو شفرة حلاقة لاستخراج كل نطاق من الاهتمام عندما تكون جاهزة للمتابعة مع تحليل TCSPC. تأكد من أن الفرقة مُخَلَّدة تحتوي على أي مواد تلويث الفرقة. لكل مجمع يجري تحليله، استخدم مطياف الفلورسنت لجعل الطيف الفلوري درجة حرارة الغرفة بين 600 و 800 نانومتر.
وضع اخفاء الشريط على أي من طرفي الشرائح وطيها أكثر من عدة مرات لخلق الفواصل، والتي سوف تسمح الشرائح التي ستعقد معا بحزم دون ضغط المسافة بين، ثم شطيرة شريحة هلام بين اثنين من الشرائح المجهرية الزجاج. أضف كمية صغيرة من الماء إلى شريحة الجل عند حافة الشرائح الزجاجية لإنشاء واجهة سلسة من شأنها تقليل تشتت الإشارة. بعد ذلك ، المشبك شطيرة هلام في مسار شعاع بحيث شعاع الضربات شريحة هلام من خلال حافة مفتوحة من لوحات.
لكل مجمع، جمع 10000 نقطة بيانات إجمالية على فترات منتظمة عبر طيف الانبعاثات الفلورية. لتحليل البيانات لمجمع معين، أولا تطبيع ذروة ارتفاع كل منحنى الاضمحلال لجميع الأطوال الموجية التي تم جمعها، ثم الذيل المباراة كل منحنى الاضمحلال إلى الطيف المفلور حالة ثابتة من المجمع كما هو مبين في بروتوكول النص. النتائج التمثيلية للكهربية هلام الأخضر يقدم مثالا على نتيجة مثالية لتحليل thylakoids السبانخ، حيث عدد من واضحة، ونطاقات خضراء حادة مرئية.
الممرات 2 و 3 تقدم نتائج أكثر نموذجية من العزلة الثيلاكويد بسيطة والكهربائية على هلام غير تدرج 5٪الاكريلاميد. الممرات 4 و 5 و 6 تقدم مثالا على النتائج السيئة بسبب زيادة درجات تحت solubilization من العينة thylakoid، في حين أن حارة 7 يوضح النتائج التي يمكن تحقيقها عندما يتم استخدام thylakoids Arabidopsis بدلا من السبانخ. وبعد تعيين منحنيات البيانات الخاصة ببيانات نظام المعلومات عن الثغرات في المستويات الزمنية نفسها، يمكن تطبيعها إلى نفس ذروة الارتفاع، مما يسمح بمقارنة المنحنيات بوصفها أول تحليل للبيانات.
يمكن بعد ذلك تراكب منحنيات الاضمحلال التي تم تطبيعها من مجمعات مختلفة مع بعضها البعض في طول موجي معين ، مما يسمح بتصور الاختلافات في السلوك بين المجمعات. الذيل مطابقة منحنيات الاضمحلال يسمح لبناء الأطياف المرتبطة الاضمحلال. كما رأينا هنا، فإن الأطياف المرتبطة بالانحلال لـ LHCII ملحوظة لعدم وجود ميزات ديناميكية ولا يزال شكل طيف الفلوري LHCII هو نفسه الذي يتحلل فيه الإشارات بمرور الوقت.
كما تأخر اضمحلال طيف الفلوريسنس، مما يتطلب 100 بيكوثانية للوصول إلى أقصى درجة من الفلور. وهذا يشير إلى أن الطاقة لا يتم نقلها بين أصباغ متميزة بنشاط داخل المجمع كما تتحلل الفلوريسنس. ثم يتم بناء الأطياف المرتبطة بالانحلال لمجمع Band 5.
بالمقارنة مع LHCII، الفلوريس من الفرقة 5 يتحلل بسرعة أكبر بكثير، والوصول إلى أقصى كثافة في 30 بيكوثانية فقط ومن ثم تتحلل إلى أقل من 20٪ من كثافة الأولي بعد 500 بيكوثانية. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن نتذكر أن تفسير بيانات TCSPC سيعتمد على معلومات كيميائية حيوية إضافية تحدد مكونات المجمعات قيد الدراسة ، على سبيل المثال ، من قبل 2 DSDS -PAGE و Blotting الغربية أو قياس الطيف الكتلي.
