يمكن أن تساعد هذه الطريقة في توفير معلومات أساسية في مجال الأورام مثل تحديد الجينات المستهدفة المفترضة والآليات المسببة للأمراض لتطوير التدخلات العلاجية المحتملة. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن للمرء أن يكتشف تفاعل NFAT2 وعوامل النسخ الأخرى مع الجينات المستهدفة المعروفة والرواية. عموما الأفراد الجدد لهذه الطريقة سوف النضال لأن التثبيت الأمثل وظروف القص من الصعب إنشاء.
لبدء ملء أنبوب 1.5 ملليلتر مع ملليلتر واحد من 37٪ الفورمالديهايد. ثم ملء أنبوب آخر 1.5 ملليلتر مع ملليلتر واحد من 1.25 الجلايسين المولر في أنبوب خمسة ملليلتر مع أربعة ملليلتر من برنامج تلفزيوني. بعد ذلك ، بعد تحفيز الخلايا تدور الخلايا وفقًا لبروتوكول النص ، وإعادة تعليق الخلايا في 500 ميكرولترات من PBS ووضع الأنبوب في صندوق مملوء بالجليد.
إضافة 13.5 ميكرولترات من 37٪ الفورمالديهايد إلى الخلايا ومزيج عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا. ثم احتضان التعليق في درجة حرارة الغرفة. بعد هذا، إضافة 57 ميكرولترات من 1.25 جليسين المولر لوقف التثبيت.
والسماح للتعليق لاحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. مباشرة بعد فترة الحضانة وضع الخلايا على الجليد والطرد المركزي الخلايا في 500 مرة G لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية. ثم تعرق المُندفع.
بعد ذلك ، اغسل الخلايا مرتين بميليلتر واحد من PBS البارد في 200 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية وإزالة المابير. Resuspend بيليه الخلية في خمسة ملليلتر من عازلة تحلل واحد عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا. ثم وضع العينات على الجليد واحتضان لهم مع اهتزاز لمدة 10 دقائق.
بعد ذلك، الطرد المركزي الأنابيب في 500 مرة G لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية. ثم استخدام ماصة لإزالة بعناية فائقة. التجانس الخلايا في خمسة ملليلتر من العازلة تحلل اثنين وماصة صعودا وهبوطا لخلط.
ثم احتضان الخلايا على الجليد لمدة 10 دقائق مع اهتزاز. بعد فترة الحضانة الطرد المركزي الأنابيب في 500 مرة G لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية، وإزالة بعناية فائقة. المقبل, resuspend بيليه الخلية في القص العازلة واحدة مع مثبطات بروتياس 1X.
ثم احتضان تعليق الخلية على الجليد لمدة 10 دقائق. نقل 140 microliters من تعليق الخلية إلى أنابيب sonicator مع الحرص على تجنب تشكيل فقاعات الهواء. ضع الأنابيب في أوفوق الصوتيات المركزة عند سبع درجات مئوية ومق وإلى 10 إلى 7 دقائق و1/2 دقيقة.
نقل تعليق الخلية إلى أنابيب 1.5 ملليلتر. الطرد المركزي العينات في 15، 700 مرات G لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية، وجمع الماطن في أنبوب جديد. أولاً، إعداد 20 ميكروليترات من الخرز المغلف بالبروتين لكل هطول للأمطار في أنبوب واحد 1.5 ملليلتر.
السماح للخرز لتسوية على رف المغناطيسي لمدة دقيقة واحدة، وإزالة supernatant. ثم غسل الخرز مع 40 ميكروليترس من 1X رقاقة العازلة واحد لكل 20 ميكرولترات من البروتين A المغلفة الخرز عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا. السماح للخرز لتسوية على رف المغناطيسي لمدة دقيقة واحدة وإزالة supernatant.
كرر عملية الغسيل هذه ثلاث مرات أخرى قبل إعادة تعليق الخرز في حجمها الأصلي من 1X chIP العازلة واحدة. إضافة مثبطات البروتياز BSA، 5X chIP العازلة، وChIP-seq الصف المياه إلى الخرز. بعد ذلك، إضافة الكروماتين المُقطّر.
استخدم 10 ميكروجرامات من الأجسام المضادة NFAT2 لالتقاط NFAT2، و2.5 ميكروغرام من الأجسام المضادة IgG كتحكم. احتضان المخاليط بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية على عجلة الدورية في ستة دورة في الدقيقة. في اليوم التالي تدور الأنابيب لمدة خمس ثوان في 7،000 مرات G واحتضان لهم على الرف المغناطيسي لمدة دقيقة واحدة.
ثم الطامح ونافر غسل الخرز مرة واحدة مع مخازن غسل واحد، اثنين، ثلاثة، وأربعة على التوالي. تدور الأنابيب لمدة خمس ثوان في 7000 مرات G قبل احتضان الأنابيب على الرف المغناطيسي لمدة دقيقة واحدة. بعد ذلك، قم بإزالة المابير الزائد وإضافة المخزن المؤقت التالي للغسيل.
بعد الغسيل الأخير، تدور الأنابيب لمدة خمس ثوان في 7000 مرة G.ااحتضان الأنابيب على الرف المغناطيسي لمدة دقيقة واحدة. إزالة supernatant و اتخاذ الخرز في 100 ميكرولترات من عازلة elution واحد. ثم احتضان الأنابيب على عجلة دوارة لمدة 30 دقيقة.
بعد ذلك، تدور لفترة وجيزة الأنابيب ووضعها على رف المغناطيسي لمدة دقيقة واحدة. نقل supernatant إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر وإضافة أربعة microliters من عازلة elution اثنين. لإنشاء مزيج التحكم في المدخلات ميكرولتر واحد من كروماتين القص مع 99 ميكرولترات من عازلة elution واحد وأربعة ميكرولترات من عازلة elution اثنين.
ثم احتضان العينات لمدة أربع ساعات في 65 درجة مئوية مع اهتزاز. بعد هذا، إضافة 100 ميكرولترات من 100٪ isopropanol إلى الأنابيب. دوامة وتدور العينات لمدة خمس ثوان في 7000 مرة G.Then إضافة 10 ميكرولترات من الخرز المغناطيسي لكل عينة.
دوامة واحتضان العينات على عجلة دوارة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة. بعد ذلك، تدور الأنابيب لفترة وجيزة ووضعها على رف المغناطيسي لمدة دقيقة واحدة. التعرق وssuspend الخرز في 100 ميكرولترات من غسل العازلة واحد.
عكس الأنابيب لخلط واحتضان لهم لمدة خمس دقائق على عجلة دوارة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، لفترة وجيزة الطرد المركزي الأنابيب. وضعها في رف المغناطيسي لمدة دقيقة واحدة، واستخدام ماصة لإزالة افر.
ثم إضافة 100 ميكروليتر من العازلة غسل اثنين. عكس الأنابيب لخلط واحتضان لهم لمدة خمس دقائق على عجلة دوارة في درجة حرارة الغرفة. بعد هذا، لفترة وجيزة الطرد المركزي الأنابيب ووضعها في رف المغناطيسي لمدة دقيقة واحدة.
إزالة العازلة غسل اثنين عن طريق الطموح وإعادة ربط الخرز في 55 ميكرولتررس من عازلة elution. ل elute الزّناء المُعجّل يحضن العينات في عجلة دوارة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك، تدور الأنابيب لفترة وجيزة ووضعها في رف المغناطيسي لمدة دقيقة واحدة.
وأخيرا، نقل عظمى إلى أنابيب جديدة 1.5 ملليلتر. تم تنفيذ هذا البروتوكول لأول مرة مع خلايا جوركات تحليل LCK كهدف NFAT2 المحتملة. وكما هو مبين هنا، فقد تم توثيق النتائج المثلى من خلال إثراء كبير للضوابط الإيجابية IL-2 والحمض النووي LCK.
قد يؤدي القص دون الأمثل أو التثبيت المفقود إلى ضعف جودة الحمض النووي. وأخيراً، تم تنفيذ هذا البروتوكول مع خلايا CLL الإنسان الأولية مع CD40L بمثابة التحكم الإيجابي وLCK كهدف تجريبي. كما يتضح من الإثراء القوي للحمض النووي LCK ، LCK هو هدف مباشر NFAT2 في الخلايا CLL البشرية الأولية.
يمكن أن يؤدي القص غير الكافي إلى وجودة الحمض النووي الرديئة النتائج دون المستوى الأمثل. في حين تحاول هذا الإجراء من المهم أن نتذكر أن التثبيت وخطوات سونيكيشن حاسمة لنجاح هذه الطريقة، وربما يجب تعديلها إلى الخلايا التي يجري تحليلها.
