تطوير تقنيات للتحقيق في نقل الجزيئات بين النواة والسيتوبلازم، وتحديد سوء تحديد مكان البروتينات القامع الورم أمر ضروري للحصول على فهم أعمق للأمراض CLL والمساعدة في تطوير العلاجات الجديدة. يوفر هذا البروتوكول طريقة سريعة وفعالة لتوليد الكسور النووية والسيكتوبلازمية من خلايا CLL الأولية. ويمكن استخدام هذه الكسور في التجارب المصب بما في ذلك تحليل نشاط الانزيم، وتحليل البروتيوم، وغرب النشاف.
هذه التقنية سوف توسع فهمنا لكيفية العلاجات والإشارات البيئية الدقيقة داخل الأورام تغيير اغلاق البروتينات بين النواة والسيتوبلازم في خلايا CLL وغيرها من الأورام الخبيثة الخلية B. يمكن استخدام هذه الطريقة لتحديد موقع البروتينات و / أو جذب حركة البروتين حسب الاقتضاء. تنفيذ التدرج المنظفات على كل خط الخلية الفردية كنت تخطط لاستخدام لضمان التوليد الأمثل من الكسور النووية وcytoplasmic المخصب للغاية.
جنبا إلى جنب مع جودي هاي ومايكل مولز، مما يدل على هذا الإجراء سيكون جنيفر كاسيلز، وهو فني من مختبري. الحصول على عينات الدم المحيطية من مرضى سرطان الدم الليمفاوي المزمن الذين تم قبولهم مسبقًا في أنابيب جمع الدم EDTA ، مصحوبة بعدد الخلايا البيضاء. وينبغي اعتبار عينات الدم البشري خطرة لأنها يحتمل أن تحتوي على فيروسات تنقلها الدم.
يرجى التأكد من أن هذه العينات يتم التعامل معها في الطبقة الثانية من السلامة البيولوجية مجلس الوزراء وأن المستخدم يرتدي معطف المختبر والقفازات في جميع الأوقات. التخلص من المواد الملوثة بالدم في المطهرات. إذا كان عدد الخلايا البيضاء يساوي أو أكبر من 40 مليون خلية لكل ملليلتر، قم بتخفيف العينة بنسبة 1 إلى 1 مع مخزن غسيل RT CLL.
ثم aliquot RT كثافة الانحدار المتوسطة في أنبوب جهاز طرد مركزي مخروطي الحجم بشكل مناسب للعينة. بعناية طبقة العينة على رأس المتوسطة والطرد المركزي في 400 × ز لمدة 30 دقيقة في RT. باستخدام ماصة باستور البلاستيكية، حصاد بلطف طبقة بيضاء من الخلايا أحادية النوى التي جمعت في واجهة متوسطة الانحدار الكثافة في مخزن الغسيل CLL. نقل هذا أحادية معزولة إلى أنبوب جديد مخروطية 50 ملليلتر.
لغسل الخلايا، إضافة 40 ملليلتر من CLL غسل العازلة لهذا monolayer والطرد المركزي في 300 × ز لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تجاهل supernatant، نفض الغبار الجزء السفلي من الأنبوب لإعادة تعليق بيليه، وتكرار هذا الغسيل. تجاهل supernatant، نفض الغبار الجزء السفلي من الأنبوب مرة أخرى، ومن ثم إعادة تعليق بيليه الخلية في حجم مجموعة من CLL غسل العازلة اعتمادا على حجم بيليه.
بعد عد الخلايا وبعد تدفق cytometry للتحقق من نقاء الخلية، ووضع الخلايا في لوحات ثقافة الأنسجة في كثافة الخلايا المطلوبة جاهزة للتحفيز أو العلاج من المخدرات. بعد التحفيز و / أو العلاج من المخدرات ، اكتمال الحضانة. نقل الخلايا إلى أنابيب ميكروفروج 1.5 ملليلتر المسمى بشكل فردي و بيليه عن طريق الطرد المركزي في 200 × ز لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية.
بعد التخلص من المابير، إعادة تعليق بيليه الخلية في ملليلتر واحد من الجليد البارد برنامج تلفزيوني مع مثبطات الفوسفاتاز. أجهزة الطرد المركزي في 200 × ز لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية. إزالة فائقة والحفاظ على هذه الكريات استخراج الخلية الكاملة على الجليد لمزيد من الاستعدادات.
لإعداد الكسور السيتوبلازمية، بلطف إعادة تعليق الكريات الخلية في 50 ميكرولترات من 1x العازلة hypertonic. للسماح للخلايا بالانتفاخ، احتضانها على الجليد لمدة 15 دقيقة. بعد إجراء تدرج المنظفات لتحديد التركيز الأمثل للمنظفات لاستخدامها لنوع خلية محددة، إضافة 0.8 إلى 2.5 ميكرولترات من المنظفات في كل عينة ودوامة على أعلى إعداد لمدة 10 ثوان.
للتحقق من تحلل الخلايا ، لاحظ الخلايا تحت مجهر النقيض من المرحلة قبل وبعد إضافة المنظفات. جميع الخلايا لديها كثافة، نواة داكنة محاطة السيتوبلازم الذي يظهر كهالة ساطعة. مرة واحدة lysed، الطرد المركزي العينات في 14، 000 × ز لمدة 30 ثانية في أربع درجات مئوية.
بعناية، دون إزعاج بيليه، نقل سوبرنات إلى أنبوب microfuge المسمى قبل المبردة وتخزين هذا الكسر السيتوبلازمي في 80 درجة مئوية حتى مزيد من التحليل. ضمان الإزالة الكاملة للكسر السيتوبلازمي لمنع تلوث الكسر النووي. إلى بيليه المتبقية، التي تحتوي على الكسر النووي، إضافة 50 ميكرولترات من عازلة التحلل الكامل وإعادة تعليق عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا.
ل سولوبيليز البروتينات المرتبطة بالغشاء النووي، إضافة 2.5 ميكرولتردات من المنظفات، دوامة على أعلى إعداد لمدة 10 ثوان، واحتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة. دوامة على أعلى الإعداد لمدة 30 ثانية والطرد المركزي. ثم نقل المابير إلى أنبوب ميكروفروج المسمى قبل المبردة وتخزين هذا الكسر النووي عند 80 درجة مئوية حتى إجراء مزيد من التحليل.
لlysates الخلية كاملة، وإعادة تعليق الكريات استخراج الخلية بأكملها في 100 ميكرولترات من عازلة التحلل الكامل عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا. لضمان اكتمال الخلية، إضافة خمسة ميكرولترات من المنظفات واحتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة. دوامة على أعلى إعداد لمدة 30 ثانية ثم الطرد المركزي في 14، 000 × ز لمدة 20 دقيقة في أربع درجات مئوية.
نقل المابير في أنبوب microfuge المبردة قبل وتخزين هذه الخلية بأكملها في 80 درجة مئوية حتى مزيد من التحليل. لقياس الاتجار بالبروتين بين الكسور النووية والسيكتوبلازمية، وإجراء تحليل كمي للطخة غربية واستيراد الصور. لعرض الصورة في شريط الصورة، انقر على الزر اختيار في مجموعة العرض وانقر على قناة Chemi.
سيتم فتح مربع الحوار اختيار العرض لتمكين المزيد من التعديلات إذا لزم الأمر. تنفيذ تحسينات إضافية باستخدام المتزلجون القابلة للتعديل على علامة التبويب LUT الصورة بما في ذلك السطوع أو التباين. استخدم علامة التبويب المنحنيات للحصول على تعديلات أدق.
لتحليل البيانات، انقر أولاً فوق الشريط تحليل. لتحليل قناة واحدة فقط، قم بإلغاء تحديد القنوات التي لا يتم تحليلها بالنقر على الصورة المصغرة دون عرض القناة، مع ترك القناة المطلوبة فقط معروضة. لقياس كثافة الإشارة، انقر فوق إضافة مستطيل لإضافة مستطيلات إلى الصورة.
انقر فوق مركز ميزة مثل شريط البروتين لوضع مستطيل حوله. بعد إضافة الأشكال المطلوبة، انقر فوق تحديد لإرجاع المؤشر إلى أداة التحديد. لطرح ضجيج الخلفية، انقر فوق الزر الأول في مجموعة الخلفية وحدد متوسط من القائمة المنسدلة.
تعيين عرض الحد إلى ثلاثة في مربع الحوار الخلفية وحدد الشرائح التي تمثل أفضل خلفية الصورة لاستخدامها لحساب الخلفية. لتصدير البيانات، انقر فوق علامة التبويب الأشكال أعلى الجدول. بالنسبة لقياس الكثافة، يجب أن تكون القيم في عمود الإشارة مطلوبة.
الإشارة هي مجموع قيم كثافة البكسل أو الإجمالي للشكل ناقص ناتج الخلفية في المنطقة. ثم انقر فوق الزر تقرير، انقر فوق حفظ باسم أو جدول التشغيل. لحساب التعبير تطبيع من البروتين من الفائدة لكل طائرة أو متغير داخل جدول البيانات المحفوظة، تقسيم إشارة التي تم الحصول عليها للبروتين من الفائدة من قبل إشارة لقابلة شريط التحكم تحميل البروتين.
لتصدير الصورة، انقر فوق علامة التبويب الصور الموجودة فوق الجدول ثم انقر فوق الصورة التي سيتم تصديرها. إذا كان استخدام الصورة لعرض شرائح أو تنسيقات رقمية أخرى، انقر فوق رمز البرنامج، وقم بالتمرن فوق تصدير، وانقر على صورة للوسائط الرقمية، ثم احفظ الصورة كما هو مطلوب. إثراء الخلايا CLL مع WCC أكبر من 40 مليون لكل ملليلتر باستخدام الطرد المركزي كثافة تمكن من استرداد الخلايا عالية.
تحليل العينة عن طريق تدفق cytometry بعد الغاء على FSC وSSC تكشف عن نقاء الخلايا CLL هي أكثر من 95٪ كما هو مبين من قبل التعبير السطحي المزدوج لعلامات الخلية CLL، CD19 و CD5. عندما تم تنفيذ بقع مناعية على الكسور الناتجة من خط الخلية CLL، ماك-1، والخلايا CLL الأولية، أشارت الكسر إلى أن مستوى المنظفات الأمثل لخلايا ماك-1 كان في واحد إلى 60 تخفيف، مقارنة مع واحد إلى 30 لخلايا CLL الأولية. عندما تم تحديد توطين تحت الخلية من FOXO1 في الكسور النووية والسيكتوبلازمية في خلايا ماك-1 و CLL الأولية، تم عرض توليد الكسور الغنية للغاية من خلال التعبير الحصري تقريبا من اللامين في النووي وبيتا توبولين في الكسور السيتوبلازمية.
تم تخفيض تعبير FOXO1 في السيتوبلازم بعد العلاج مع AZD 8055 ، مقارنة بـ NDC ، مصحوبًا بزيادة في التعبير FOXO1 في المقصورة النووية ، مما يدل على نقل البروتين. بعد أن تم قياس لطخات المناعة الفردية من خمس عينات من CLL الأولية ضمن كسور تحت الخلية، تم العثور على AZD 8055 لتقليل مستويات التعبير FOXO1 في السيتوبلازم وزيادة التعبير في النواة. BCR عبر ربط زيادة التعبير FOXO1 cytoplasmic.
تذكر أن تبقي جميع الكواشف والعينات على الجليد لمنع تدهور البروتين. ويمكن أيضا أن تستخدم الكسور دون الخلية التي تم إنشاؤها في هذا الإجراء في تحليل نشاط الانزيم مثل تحليل نشاط FOXO ، والذي يتيح أن يتم رسم أوجه التشابه بين الموقع الخلوي لـ FOXO1 ونشاطه الملزم للحمض النووي. وقد مكننا تطور هذه التقنية من التصدي للاتجار ببروتينات محددة داخل خلايا CLL استجابة لمثبطات انتقائية ويدعم دراساتنا الموازية للفلوروس المناعية لتوليد مجموعة بيانات قوية وقابلة للقياس الكمي.
