一种检测慢性淋巴细胞白血病新 nfat2 靶基因的染色质免疫沉淀法

这种方法可以帮助提供肿瘤学领域的关键信息，如确定应建立的目标基因和致病机制，以开发潜在的治疗干预措施。该技术的主要优点是，可以检测NFAT2和其他转录因子与已知和新颖的目标基因的相互作用。通常，由于难以确定最佳固定和剪切条件，对这种方法的个体将难以为之奋斗。

开始用1.5毫升的管填充37%甲醛。然后用一毫升1.25摩尔甘氨酸填充另一个1.5毫升管，用四毫升PBS填充。接下来，在细胞刺激后，根据文本协议旋转细胞，将细胞重新悬浮在PBS的500微升中，将管子放在一个装满冰的盒子里。

在细胞中加入13.5微升37%甲醛，通过上下移液混合。然后在室温下孵育悬浮液。在此之后，添加 57 微升 1.25 摩尔甘氨酸，以停止固定。

并允许悬浮液在室温下孵育五分钟。在孵化期之后，立即将细胞放在冰上，在4摄氏度下将细胞在500倍G下离心5分钟。然后吸上一道。

接下来，用200次G的一毫升冰冷PBS清洗细胞两次，在4摄氏度下洗涤5分钟，取出上清液。通过上下移液将细胞颗粒重新在五毫升的解液缓冲液中重新填充。然后将样品放在冰上，用震动孵育10分钟。

之后，在500倍G下离心管，在4摄氏度下5分钟。然后使用移液器小心地取出上流液。在五毫升的解液缓冲液中均匀化细胞，并上下移液器混合。

然后用颤抖在冰上孵育细胞10分钟。孵育期后，将管在500次G下离心，在4摄氏度下5分钟，小心地取出上流液。接下来，用1X蛋白酶抑制剂在剪切缓冲液中重新填充细胞颗粒。

然后在冰上孵育细胞悬浮液10分钟。将140微升的细胞悬浮液转移到声波管，注意避免形成气泡。将管子在7摄氏度的聚焦超声波中放置，剪切10至7分钟和1~2分钟。

将细胞悬浮液转移到1.5毫升管中。将样品在15，700倍G下离心，在4摄氏度下10分钟，并在新管中收集上一代。首先，在一个1.5毫升的管中，为每次沉淀准备20微升的蛋白质 A 涂层珠。

让磁珠在磁架上沉淀一分钟，然后取出上清液。然后用40微升1X芯片缓冲液清洗珠子，每20微升蛋白质 A 涂层珠子通过上下移液。让磁珠在磁架上沉淀一分钟，然后取出上清液。

重复此洗涤过程三次，然后再将珠子重新悬浮在原始体积为 1X chIP 缓冲器一个。将 BSA 蛋白酶抑制剂、5X chIP 缓冲液和 ChIP-seq 级水加入珠子。接下来，添加剪切的染色质。

使用10微克的抗NFAT2抗体捕获NFAT2，以及2.5微克IgG抗体作为控制。在六 RPM 旋转的车轮上，在四摄氏度下孵育混合物。第二天，在7000次G下旋转管子5秒钟，并在磁架上孵育1分钟。

然后吸上流水，然后用洗涤缓冲器一、二、三和四连续洗涤珠子一次。在磁架上孵育管子1分钟之前，以7000倍G旋转管子5秒钟。在此之后，取出上流液并添加下一个洗涤缓冲液。

上次洗涤后，在7000次G.下旋转管5秒钟，将磁架上的管子孵育1分钟。取出上流液，在洗脱缓冲液的100微升中取出珠子。然后孵育旋转轮上的管子30分钟。

接下来，短暂旋转管子，并把它们放在磁架上一分钟。将上流液转移到新的1.5毫升管中，并添加四微升洗脱缓冲液2。创建一个微升的剪切染色质与99微升的洗脱缓冲器1和4微升的洗脱缓冲器2的输入控制混合。

然后在65摄氏度下孵育样品4小时。用震动。在此之后，在管中加入100微升100%异丙醇。涡流和旋转样品5秒钟，在7000倍G.然后添加10微升磁珠到每个样品。

在室温下，在旋转轮上孵育样品一小时。接下来，短暂地旋转管子，并把它们放在磁架上一分钟。吸上一升，并在100微升洗涤缓冲器中重新暂停珠子。

在室温下，将管子反转，在旋转轮上混合并孵育五分钟。接下来，简要地将管子离心。将它们放在磁性机架中一分钟，并使用移液器去除上流液。

然后添加100微升的洗涤缓冲液2。在室温下，将管子反转，在旋转轮上混合并孵育五分钟。在此之后，短暂地离心管，并把它们放在一个磁性机架中一分钟。

通过吸气去除洗涤缓冲液两个，并在 55 微升洗涤缓冲液中重新分配珠子。将沉淀的DNA在室温下在旋转轮中孵育样品15分钟。之后，短暂旋转管，并把它们放在磁架中一分钟。

最后，将上流液转移到新的1.5毫升管。该协议首先与Jurkat细胞一起执行，分析LCK作为潜在的NFAT2目标。如图所示，IL-2阳性控制和LCKDNA的显著浓缩记录了最佳结果。

次优剪切或缺固定可能导致 DNA 质量差。最后，对原发性人类CLL细胞进行了治疗，CD40L为正对，LCK为实验靶点。正如LCKDNA的强烈浓缩所证明的，LCK是原发性人类CLL细胞的直接NFAT2靶点。

剪切不足导致DNA质量差，可返回次优结果。在尝试此过程时，重要的是要记住，固定和声波步骤对于此方法的成功至关重要，并且可能需要根据被分析的细胞进行调整。