ونشكر برنامج الدكتوراه في العلوم البيولوجية الجزيئية (موبي) وقسم الأحياء في جامعة الدولة تينيسي الأوسط (متسو) لتوفير التمويل اللازم لهذه الدراسة. كان أيضا تمويل المشروع جزئيا بمنحه "مشاريع خاصة" تمنحها "مؤسسة متسو" إلى D.E.N..

ملاحظة: المرسلة جيم- ممرض 2 مستوى السلامة الأحيائية (BSL-2) والباحثون العاملون معها يجب اتخاذ الاحتياطات المناسبة. إجراءات مفصلة على كيف أن بأمان العمل مع الكائنات الممرضة BSL-2 يمكن الاطلاع على المركز مكافحة الأمراض (CDC) موقع على شبكة الإنترنت، لكن من المهم أن نلاحظ أن جميع الأشخاص ملامسة المرسلة جيم- ينبغي تدريب بشكل صحيح في التعامل مع العوامل المسببة للأمراض، وينبغي دائماً ارتداء المناسب معدات الوقاية الشخصية (معدات الوقاية الشخصية)، مطاط عموما أو قفازات النتريل. علاوة على ذلك، ينبغي أن مختومة الدوارات في أجهزة الطرد المركزي لمنع هباء العينات وأي انسكابات تنظيف فورا باستخدام حل التبييض 10%28.
1-كبسولة التعريفي
ملاحظة: ينبغي إجراء جميع الخطوات في درجة حرارة الغرفة إلا إذا ذكر خلاف ذلك.
<ol><li>الثقافة المرسلة جيم في الخميرة ببتون سكر العنب (YPD) مرق (درجة الحموضة 6.5 +/--0.2) واحتضان في 37 درجة مئوية مع الهز حتى وهم في مرحلة تسجيل (حوالي 18-36 ح).</li>
	<li>خلايا أجهزة الطرد المركزي في 870 x ز لمدة 5 دقائق في 21 درجة مئوية ويغسل ثلاث مرات مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).</li>
	<li>استخدام هيموسيتوميتير (أو عداد الآلي خلية) لحساب عدد الخلايا وريسوسبيند في 2 × 105 خلايا/2 مل في وسائل الإعلام الأساسية الحد الأدنى في دولبيكو (دميم).</li>
	<li>للحث على الكبسولة، احتضان في 37 درجة مئوية و 5% CO2 لح 18. ملاحظة: المزيج من غياب العناصر المغذية في وسائل الإعلام، ووجود CO2 يحفز نمو كبسولة المرسلة جيم .</li>
	<li>بعد انتهاء الحضانة، حصاد الخلايا عن طريق سينتريفوجينج (كما هو مذكور أعلاه) وإزالة جميع ولكن 5-10 ميليلتر طافية. في الوقت نفسه، حصاد عينة خلايا المستحثة الأمم المتحدة مقابلة لكل سلالة يمكن قياسها. استخدام هذه كعناصر سلبية. ملاحظة: الكريات الخلية سوف تكون صغيرة جداً وقد يكون من الصعب أن نرى. كن حذراً عند يسفط المادة طافية.</li>
	<li>وصمة عار مع الهند الحبر (قسم 2.1) أو الأصباغ الفلورية (القسم 2-2).</li>
</ol>2-تلوين
<ol><li>
التلوين باستخدام الحبر الهند فقط
	<ol>
<li>لوصمة عار الخميرة بالحبر الهند، ريسوسبيند بيليه في المادة طافية المتبقية وإضافة 4μL (حوالي النصف) من تعليق خلية و 4μL من الحبر الهند على شريحة الميكروسكوب زجاجية. بلطف المزيج وتجنب الإرغاء.</li>
		<li>تطبيق ساترة زجاج 13 مم (سمك #1.5) وختم الحواف مع غير سامة لتسرب (طلاء الأظافر واضحة) لمنع جفاف العينة.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
التلوين بالأصباغ الفلورية فقط
	<ol>
<li>لوصمة عار الخميرة مع صبغة فلورسنت، ريسوسبيند بيليه الخلية في برنامج تلفزيوني ميليلتر 50 مع ألبومين المصل البقري 1% (BSA).</li>
		<li>احتضان الثقافة مع حجم متساوية من كالكوفلور الأبيض (CFW) (1 ميكروغرام/مل) و (انظر الجدول للمواد) مترافق ماب كبسولة 18B7 إلى AlexaFluor488 (AF488) (10 ميكروغرام/مل) لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.</li>
		<li>الطرد المركزي خلايا في 870 x ز لمدة 5 دقائق في الحضانة بعد 21 درجة مئوية ونضح المادة طافية.</li>
		<li>ريسوسبيند بيليه الخلية في برنامج تلفزيوني ميليلتر 10 مع ألبومين المصل البقري 1% (BSA).</li>
		<li>"الماصة؛" ميليلتر 8 من تعليق خلية إلى شريحة الميكروسكوب زجاجية.</li>
		<li>تطبيق ساترة زجاج 13 مم (سمك #1.5) وختم الحواف مع غير سامة لتسرب (طلاء الأظافر واضحة) لمنع جفاف العينة.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
تلطيخ مع الهند الحبر والأصباغ الفلورية
	<ol>
<li>لمقارنة فعالية الحبر الهند تلطيخ بالأصباغ الفلورية أكثر مباشرة، شارك وصمة عار السكان الخلية نفسها مع كلا النوعين من وصمة عار. للقيام بذلك، أولاً احتضان الخلايا مع كبسولة الفلورسنت ووصمة عار جدار الخلية، وفقا للخطوات 2.2.1-2.2.3 على السواء.</li>
		<li>وبعد ذلك، "الماصة؛" كميات متساوية (4 ميليلتر) تعليق خلية فلوريسسينتلي الملون والحبر الهند على شريحة زجاجية. المزيج بلطف.</li>
		<li>تنطبق ساترة زجاج 13 مم (سمك #1.5) وختم الحواف مع غير سامة لتسرب (طلاء الأظافر واضحة) لمنع جفاف العينة.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3-صورة اقتناء/الفحص المجهري
<ol><li>
تصوير الخلايا ملطخة بالحبر الهند.
	<ol>
<li>الحصول على الصور باستخدام مجهر خفيفة قياسية (100 X التكبير).</li>
		<li>صورة الحد ني خلايا 50 في كل حالة. ملاحظة: سوف تختلف عدد الخلايا في كل حقل، وهذا أمر مقبول. ومن المهم، مع ذلك، أن تداخل الخلايا يوضع كحد أدنى، أن هذه صعوبة قياس (سواء يدوياً أو مع البرامج الآلية). لهذه التجارب، الصور تم الحصول عليها على عمق 16 بت مع أوقات التعرض الأمثل لزيادة تباين الصورة مع تقليل التمويه الناجم عن الحركات الصغيرة من الخلايا.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
تصوير الخلايا ملطخة بالأصباغ الفلورية
	<ol>
<li>صورة الخلايا بالميكروسكوب الأسفار، فتح المجهر برامج التصوير وحدد أطوال موجية الإثارة والانبعاثات المناسبة ل fluorophores المستخدمة (CFW و AF488 هي متحمس باستخدام 405nm و 488 نانومتر الأضواء، على التوالي). الحصول على الصور باستخدام مجهر الأسفار.</li>
		<li>صورة الحد ني خلايا 50 في كل حالة. ملاحظة: سوف تختلف عدد الخلايا في كل حقل، وهذا أمر مقبول. ومن المهم، مع ذلك، أن تداخل الخلايا أن تبقى على الأقل هذه هي صعوبة قياس (سواء يدوياً أو مع البرامج الآلية).</li>
		<li>الحصول على سلسلة صورة z-كومة من الخلايا لضمان الحصول على أقصى قطر كبسولة لكل خلية داخل حقل معين.<ol>
<li>في مجهر البرمجيات التحكم، وانقر فوق على شريط "z-مكدس" لفتح لوحة تحكم "z-المكدس"، ثم حدد الخيار "الأولى/الأخيرة" في الزاوية اليسرى العليا للوحة.</li>
			<li>استخدام عنصر تحكم التركيز غرامة على المجهر إلى التركيز على مستوى أقل من نقطة أوسع من خلية واحدة من خميرة وكبسولات للجميع داخل مجال الرؤية الحالية، وانقر فوق "تعيين أول".</li>
			<li>استخدام عنصر تحكم التركيز الجميلة بتركيز أعلى من النقطة أوسع من الجسم الخلية للخلية نفسها والكبسولة لكافة الخلايا الموجودة داخل مجال الرؤية الحالية، ثم انقر فوق "تعيين آخر".</li>
			<li>ثم انقر فوق "بدء التجربة" في علامة التبويب "حيازة" اكتساب z-المكدس للموضع الحالي. كرر العملية في مواقف متعددة حتى تم الحصول عليها من صور z-كومة من الخلايا 50 كحد أدنى. ملاحظة: لهذه التجارب، والثقب [كنفوكل] تم تعيين إلى 1.0 تم الحصول عليها الاتحاد الأفريقي وسلسلة z متداخلة من شرائح 10-20 تغطي كل 0.7 ميكرومتر في مواقع مختارة. الاتحاد الأفريقي = وحدة متجددة الهواء.</li>
		</ol>
</li>
		<li>بعد ذلك، تحويل كل سلسلة z-المكدس في أقصى شدتها الإسقاطات (MIP) استخدام برنامج تحليل الصور المناسبة. ملاحظة: المشروع MIPs كثافة أكبر في كل طائرة من صورة مكدسة29. إنشاء MIPs يسمح أحد لإنتاج تمثيل ثنائي الأبعاد للصور التي تتوافق مع الخلية كحد أقصى وقطرها كبسولة داخل المكدس ثلاثي الأبعاد الملتقطة.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
تصوير الخلايا ملطخة بالحبر الهند والأصباغ الفلورية
	<ol>
<li>الحصول على الصور باستخدام ويديفيلد (40 X التكبير) أو مجهر [كنفوكل] (63 X أو التكبير X 100). للخلايا ملطخة بالحبر الهند والأصباغ الفلورية، التقاط الصور باستخدام مجهر ويديفيلد مجهزة بالمرحلة التي تسيطر عليها الكمبيوتر والنفط الغمر الهدف. ملاحظة: يجب أن تسيطر المجهر في الاستخدام باستخدام برامج تصوير CFW. ينبغي أن يتم الكشف عن الأسفار التي هو متحمس من خلال عامل تصفية إثارة 340-380 نانومتر، وينبعث الضوء من خلال مرشح حاجز شمال البحر الأبيض المتوسط 435-485 تنعكس من مرآة مزدوج اللون 400 نانومتر. يمكن متحمس AF488 الأسفار من خلال عامل تصفية إثارة 465-495 نيوتن متر، ويمكن الكشف عن الضوء المنبعثة من خلال مرشح حاجز شمال البحر الأبيض المتوسط 515-555 تنعكس من مرآة مزدوج اللون 505-شمال البحر الأبيض المتوسط.</li>
		<li>صورة الحد ني خلايا 50 كل شرط لكل أسلوب المصبوغة.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4-دليل قياس كبسولة
<ol><li>للخلايا ملطخة بالحبر الهند أو البقع الفلورسنت، استخدام برمجيات خلية قياس إلى يدوياً قياس القطر الكبسولة والخلية (انظر الجدول للمواد). للقيام بهذا، انتقل إلى "ملف" > "فتح الصورة" > "التدبير" واستخدام المؤشر لرسم خط مستقيم من خلال أوسع نقطة خلية كاملة (مجموع القطر).</li>
	<li>بعد ذلك، انقر فوق "إجراء" مرة أخرى، ورسم خط مستقيم من خلال خلايا الجسم (قطر جسم الخلية). ملاحظة: القياسات يتم حفظها تلقائياً على الخلايا.</li>
	<li>كرر هذه العملية لكافة الخلايا (الحد أدنى مجموعة/50).</li>
	<li>لحفظ الصور بمجرد أنها تقاس، انقر فوق "ملف" > "حفظ باسم" واسم الصور مناسب.</li>
	<li>حدد الملفات حديثا المقاسة وتصدير البيانات إلى برنامج جدول بيانات.</li>
	<li>حساب متوسط القطر كبسولة باستخدام المعادلة: ([مجموع القطر]-[قطر جسم الخلية]).</li>
</ol>5-الآلي قياس كبسولة
ملاحظة: لقياس النجاح الآلي، استخدام الصور 16-بت مع درجة عالية من التباين والتي تتركز بشكل صحيح جنبا إلى جنب مع برنامج تحليل صورة مناسبة (انظر الجدول للمواد). عند التصوير جيم-المرسلة لقياس كبسولة، من المهم التركيز على الحلبة مظلمة في الحدود بين جدار الخلية بالكبسولة. يسمح هذا البرنامج بشكل صحيح تحديد الخلية والكبسولة.
<ol><li>عكس وإنشاء نسخة من كل الهند الحبر الملون صور الخلية باستخدام برامج تحرير الصور مناسبة (انظر الجدول للمواد). للقيام بذلك، انقر فوق "ملف" > "فتح" لفتح الهند الحبر الملون الصور وثم "التحكم" + "الأول" لعكس الصورة. انقر فوق "ملف" > "حفظ باسم" لحفظ الصورة مقلوبة.</li>
	<li>لاستيراد الأصلي ومقلوب الصور إلى البرنامج انقر فوق "ملف" > "استيراد تسلسل" > "تحميل الصورة" > "تعريف تسلسل (يدوياً)" > "أبعاد (قناة)" > "استيراد" > "تطبيق". ملاحظة: الخلية المرسلة جيم- الهيئات وكبسولات يمكن تحديدها وملثمين باستخدام خوارزميات محددة-يشار إلى 'وصفات'-المدرجة في البرنامج.</li>
	<li>استخدام وصفه '"محلل مستعمرة"(الأسفار)' على الصورة المعكوسة لاكتشاف وقناع الجسم الخلية، ثم انقر فوق "تطبيق". في صورة مقلوبة، الحلبة مظلمة تعريف حد الخلية المرسلة جيم- يصبح أكثر إشراقا من الكبسولة المحيطة بها.</li>
	<li>استخدم الوصفة '"محلل مستعمرة"(الأسفار)' على الصورة المعكوسة للجزء الهيئات الخلية المرسلة جيم من كبسولات بها، ثم انقر فوق "تطبيق". وهذا يخلق قناع عد. إعادة تسمية هذا القناع العد "خلية الجسم" بزر الماوس الأيمن فوق علامة التبويب المسمى "قناع حساب". ملاحظة: الوصفة تتكون من خطوات معالجة صورة متعددة: الخلفية، إزالة، والكشف عن الكائن، فصل الكائن، وتصفية مجموعة فرعية.</li>
	<li>بعد ذلك، استخدم وصفه '"انتشار الخلايا"' على الصورة الأصلية لكشف وقناع الكبسولة، وانقر فوق "تطبيق". وهذا يخلق قناع عد. إعادة تسمية هذا القناع العد "كبسولة" بزر الماوس الأيمن فوق علامة التبويب المسمى "قناع حساب".</li>
	<li>استخدام الوصفة، '"كبسولة القسم"'، إنشاء قناع جديد على الصورة الأصلية لتقسيم كبسولات متجاورة من بعضها البعض. للقيام بذلك، انقر فوق "القسم كبسولة" من القائمة المنسدلة الوصفة. في "مربع التقسيم كبسولة"، اختر القناع العد أعيدت تسميته الآن "كبسولة" (5.5) "المنطقة كبسولة". اختر القناع العد أعيدت تسميته الآن "خلية الجسم" "تشفير خلايا" (5.4). اختر "الأصلي" لقناة الإدخال، و "إنشاء قناع لكبسولة المقسمة. انقر فوق "تطبيق ملاحظة: الوصفة يولد الخلية وقطرها كبسولة، يعرف بأنه متوسط المحاور الأطول والأقصر عبور مركز الخلية والكبسولة، وقياسات المجال من الكشف عن الأقنعة. العثور على الإخراج الموجود تحت علامة التبويب جدول بيانات في هذا البرنامج. كرر هذه العملية لجميع الصور (على الأقل 50/المجموعة خلايا). معلمات الوصفة يمكن ضبطها لتحسين الكشف عن الصور الفردية أو الأمثل للكشف عن مجموعة من صور متعددة. ويمكن حساب قياسات إضافية بوصفه لتوصيف شامل للخلية والمورفولوجيا في كبسولة.</li>
	<li>تصدير البيانات إلى برنامج جدول بيانات الاختيار لمزيد من التحليل.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Park, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+the+current+global+burden+of+cryptococcal+meningitis+among+persons+living+with+HIV/AIDS.">Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS.</a> AIDS. 23 (4), 525-530 (2009).</li><li>Coelho, C., Bocca, A. L., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intracellular+life+of+Cryptococcus+neoformans.">The intracellular life of Cryptococcus neoformans.</a> Annu Rev Pathol. 9, 219-238 (2014).</li><li>Rajasingham, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+burden+of+disease+of+HIV-associated+cryptococcal+meningitis:+an+updated+analysis.">Global burden of disease of HIV-associated cryptococcal meningitis: an updated analysis.</a> Lancet Infect Dis. 17 (8), 873-881 (2017).</li><li>Limper, A. H., Adenis, A., Le, T., Harrison, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+infections+in+HIV/AIDS.">Fungal infections in HIV/AIDS.</a> Lancet Infect Dis. 17 (11), e334-e343 (2017).</li><li>Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crisis+in+Infectious+Diseases:+2+Decades+Later.">Crisis in Infectious Diseases: 2 Decades Later.</a> Clin Infect Dis. 64 (7), 823-828 (2017).</li><li>McClelland, E. E. C., Eisenmann, A., H, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch+6.">Ch 6.</a> New Insights in Medical Mycology. , 131-157 (2007).</li><li>Leopold Wager, C. M., Wormley, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classical+versus+alternative+macrophage+activation:+the+Ying+and+the+Yang+in+host+defense+against+pulmonary+fungal+infections.">Classical versus alternative macrophage activation: the Ying and the Yang in host defense against pulmonary fungal infections.</a> Mucosal Immunol. 7 (5), 1023-1035 (2014).</li><li>Kwon-Chung, K. J., Rhodes, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+and+melanin+formation+as+indicators+of+virulence+in+Cryptococcus+neoformans.">Encapsulation and melanin formation as indicators of virulence in Cryptococcus neoformans.</a> Infect Immun. 51 (1), 218-223 (1986).</li><li>Vecchiarelli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+the+immunological+function+of+the+Cryptococcus+neoformans+capsule.">Elucidating the immunological function of the Cryptococcus neoformans capsule.</a> Future Microbiol. 8 (9), 1107-1116 (2013).</li><li>Murphy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+cryptococcal+antigens+on+cell-mediated+immunity.">Influence of cryptococcal antigens on cell-mediated immunity.</a> Rev Infect Dis. 10 Suppl 2, S432-S435 (1988).</li><li>Cherniak, R., Morris, L. C., Belay, T., Spitzer, E. D., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+the+structure+of+glucuronoxylomannan+in+isolates+from+patients+with+recurrent+cryptococcal+meningitis.">Variation in the structure of glucuronoxylomannan in isolates from patients with recurrent cryptococcal meningitis.</a> Infect Immun. 63 (5), 1899-1905 (1995).</li><li>Collins, H. L., Bancroft, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+of+Cryptococcus+neoformans+impairs+antigen-specific+T-cell+responses.">Encapsulation of Cryptococcus neoformans impairs antigen-specific T-cell responses.</a> Infect Immun. 59 (11), 3883-3888 (1991).</li><li>Yasuoka, A., Kohno, S., Yamada, H., Kaku, M., Koga, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+molecular+sizes+of+Cryptococcus+neoformans+capsular+polysaccharide+on+phagocytosis.">Influence of molecular sizes of Cryptococcus neoformans capsular polysaccharide on phagocytosis.</a> Microbiol Immunol. 38 (11), 851-856 (1994).</li><li>Robertson, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+ex+vivo+capsule+size+is+associated+with+intracranial+pressure+and+host+immune+response+in+HIV-associated+cryptococcal+meningitis.">Cryptococcus neoformans ex vivo capsule size is associated with intracranial pressure and host immune response in HIV-associated cryptococcal meningitis.</a> J Infect Dis. 209 (1), 74-82 (2014).</li><li>Cordero, R. J., Bergman, A., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+behavior+of+capsule+enlargement+by+Cryptococcus+neoformans.">Temporal behavior of capsule enlargement by Cryptococcus neoformans.</a> Eukaryot Cell. 12 (10), 1383-1388 (2013).</li><li>O'Meara, T. R., Alspaugh, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cryptococcus+neoformans+capsule:+a+sword+and+a+shield.">The Cryptococcus neoformans capsule: a sword and a shield.</a> Clin Microbiol Rev. 25 (3), 387-408 (2012).</li><li>McClelland, E. E., Smith, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gender+specific+differences+in+the+immune+response+to+infection.">Gender specific differences in the immune response to infection.</a> Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis. 59 (3), (2011).</li><li>McClelland, E. E., Perrine, W. T., Potts, W. K., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+virulence+factor+expression+to+evolved+virulence+in+mouse-passaged+Cryptococcus+neoformans+lines.">Relationship of virulence factor expression to evolved virulence in mouse-passaged Cryptococcus neoformans lines.</a> Infect Immun. 73 (10), 7047-7050 (2005).</li><li>Zaragoza, O., Fries, B. C., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+capsule+growth+in+Cryptococcus+neoformans+by+mammalian+serum+and+CO(2).">Induction of capsule growth in Cryptococcus neoformans by mammalian serum and CO(2).</a> Infect Immun. 71 (1), 6155-6164 (2003).</li><li>Vartivarian, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cryptococcal+capsular+polysaccharide+by+iron.">Regulation of cryptococcal capsular polysaccharide by iron.</a> J Infect Dis. 167 (1), 186-190 (1993).</li><li>McFadden, D. C., Fries, B. C., Wang, F., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capsule+structural+heterogeneity+and+antigenic+variation+in+Cryptococcus+neoformans.">Capsule structural heterogeneity and antigenic variation in Cryptococcus neoformans.</a> Eukaryot Cell. 6 (8), 1464-1473 (2007).</li><li>Garcia-Hermoso, D., Dromer, F., Janbon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+capsule+structure+evolution+in+vitro+and+during+murine+infection.">Cryptococcus neoformans capsule structure evolution in vitro and during murine infection.</a> Infect Immun. 72 (6), 3359-3365 (2004).</li><li>Gates, M. A., Thorkildson, P., Kozel, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+the+Cryptococcus+neoformans+capsule.">Molecular architecture of the Cryptococcus neoformans capsule.</a> Mol Microbiol. 52 (1), 13-24 (2004).</li><li>Pontes, B., Frases, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cryptococcus+neoformans+capsule:+lessons+from+the+use+of+optical+tweezers+and+other+biophysical+tools.">The Cryptococcus neoformans capsule: lessons from the use of optical tweezers and other biophysical tools.</a> Front Microbiol. 6, 640 (2015).</li><li>Shen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+tracking+of+gene+expression+in+individual+cells+and+cell+compartments.">Automated tracking of gene expression in individual cells and cell compartments.</a> J R Soc Interface. 3 (11), 787-794 (2006).</li><li>Dorn, J. F., Danuser, G., Yang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+processing+and+analysis+of+dynamic+fluorescence+image+data.">Computational processing and analysis of dynamic fluorescence image data.</a> Methods Cell Biol. 85, 497-538 (2008).</li><li>Nketia, T. A., Sailem, H., Rohde, G., Machiraju, R., Rittscher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+live+cell+images:+Methods,+tools+and+opportunities.">Analysis of live cell images: Methods, tools and opportunities.</a> Methods. , 65-79 (2017).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , 33-38 (2015).</li><li>Kwon, O., Kang, S. T., Kim, S. H., Kim, Y. H., Shin, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximum+intensity+projection+using+bidirectional+compositing+with+block+skipping.">Maximum intensity projection using bidirectional compositing with block skipping.</a> J Xray Sci Technol. 23 (1), 33-44 (2015).</li><li>Janbon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+genome+and+transcriptome+of+Cryptococcus+neoformans+var.+grubii+reveals+complex+RNA+expression+and+microevolution+leading+to+virulence+attenuation.">Analysis of the genome and transcriptome of Cryptococcus neoformans var. grubii reveals complex RNA expression and microevolution leading to virulence attenuation.</a> PLoS Genet. 10 (4), e1004261 (2014).</li><li>Bisson, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+HAART+is+associated+with+decreased+risk+of+death+during+initial+treatment+of+cryptococcal+meningitis+in+adults+in+Botswana.">The use of HAART is associated with decreased risk of death during initial treatment of cryptococcal meningitis in adults in Botswana.</a> J Acquir Immune Defic Syndr. 49 (2), 227-229 (2008).</li><li>van Teeffelen, S., Shaevitz, J. W., Gitai, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+analysis+in+fluorescence+microscopy:+bacterial+dynamics+as+a+case+study.">Image analysis in fluorescence microscopy: bacterial dynamics as a case study.</a> Bioessays. 34 (5), 427-436 (2012).</li><li>Granger, D. L., Perfect, J. R., Durack, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virulence+of+Cryptococcus+neoformans.+Regulation+of+capsule+synthesis+by+carbon+dioxide.">Virulence of Cryptococcus neoformans. Regulation of capsule synthesis by carbon dioxide.</a> J Clin Invest. 76 (2), 508-516 (1985).</li></ol>

صاحب البلاغ، لأي هوين، هو مدير المنتج في درفيسيون التي تنشر برمجيات تحليل الصورة الآلي، أيفيا.

على مدى عقود، كانت الكبسولة محاور تركيز رئيسية للبحوث لكل من ميكولوجيستس والأطباء مهتمة المرسلة جيم- وتأتي بسبب دورها كعامل فوعة رئيسية لمسببات المرض. استخدام الفحص المجهري لقياس الاختلافات بين السلالات في الحجم الكبسولة وتحت النمو مختلف الظروف يمكن أن توفر معلومات هامة حول مسببات المرض واستجاباته للمثيرات المختلفة (أي، والظروف البيئية المختلفة، إمكانية العلاج بالعقاقير، إلخ.) هنا، ذكرناها وسيلة لحفز نمو الكبسولة في المرسلة جيم، وكبسولة اثنين مقارنة مختلف البروتوكولات المصبوغة. وأخيراً، نحن أظهر كيف يمكن استخدام برمجيات تحليل الصورة لأتمتة قياس القطر كبسولة من الصور من الهند الحبر الملون الخلايا، وتنتج النتائج التي كانت مماثلة لطرق القياس اليدوي.
في تجاربنا، يمكننا مقارنة اثنين من السلالات السريرية، B18 و B52، مع H99S، سلالة مختبر قياسية المعروفة الحجم الكبسولة18. كلا تلطيخ أساليب أظهرت أن سلالة السريرية، B52، كان أكبر قطر كبسولة لثلاث سلالات من اختبارها. ومع ذلك، كانت النتائج من قياسات الفلورسنت قادراً على تمييز فرق بين السلالات اثنين مع أصغر حجم كبسولة القياسات الحبر الهند لم تكن فيها. وكانت النتائج من كلا الأسلوبين لتلطيخ متسقة، مما يوحي بأن كلاهما صحيح ولكن أن استخدام الصور من فلوريسسينتلي الملون المرسلة C. قد تسمح بزيادة الحساسية في قياس سلالات مع الكبسولة الصغيرة. استخدام الحد الأقصى الإسقاطات الناتجة من z-رص الصور من فلوريسسينتلي الخلايا الملون يسمح الباحثين التأكد من أن يمكن إجراء قياسات دقيقة قطرها كبسولة حتى عندما تكون الخلايا المصورة في طائرات تركيز مختلفة. هذه القياسات أكثر صعوبة المرسلة جيم- تصويرها باستخدام الحبر الهند والفحص المجهري الخفيفة القياسية. في أي صورة معينة، قد الجلوس الخلايا المتجاورة في الطائرات المحورية مختلفة قليلاً، مما يجعل من الصعب على حل بدقة حدود جسم الخلية كبسولة لكافة الخلايا. وهذا يمكن ربما إرباك قدرة المحققين للكشف عن تغيرات صغيرة في الحجم الكبسولة أو الخلافات الصغيرة بين السلالات.
كل أسلوب مزاياه الخاصة المتأصلة. الحبر الهند هي الأكثر استخداماً من الباحثين بسبب لها القدرة على تحمل التكاليف، وسهولة الاستخدام، والاستقرار (لا تتحلل مع مرور الوقت كما تفعل بعض البقع الفلورسنت). لأن الحبر الهند وصمة سلبية بسيطة، ويمكن استخدامه بالتزامن مع مجاهر الخفيفة القياسية، ومتاحة بسهولة أكبر من مجاهر الفلورسنت. ومع ذلك، إذا لم تستخدم بالنسب الصحيحة (الهند الحبر: المخزن المؤقت)، يمكن إنشاء وصمة عار خلفية "خفيف" عند تصويرها، والتي يمكن أن تؤدي إلى تعقيد تحليل الصورة الآلي. في حين مكلفة وأكثر استهلاكاً للوقت لاستخدام الأصباغ الفلورية يمكن أن يكون مفيداً لما أبدته من المرونة، وكما نعرض، حساسيتها. فمفيدة بشكل خاص لقياس عبء حجم والخلية كبسولة في التجارب التي تنطوي على المرسلة جيم- التي قد تم فاجوسيتوسيد بالخلايا المناعية وضرورية لدراسة نسيجية كبسولة المرسلة جيم في عينات الأنسجة (تقنية غير المذكورة في هذه المقالة)32. إذا كان التلوين بالأصباغ الفلورية، مثل كالكوفلور بيضاء أو الأجسام المضادة الموسومة فلوريسسينتلي-جكسم، إشكالية (مثلاً، تلطيخ غير كافية)، هذا يمكن عادة التغلب على طريق تحسين البروتوكول المصبوغة (زيادة/إنقاص وقت الاعتقال و/أو الاحتضان مع الصبغ.)
بغض النظر عن تلطيخ المنهجية، فإننا نجد أن التعريفي كبسولة والتقاط الصور المناسبة من الخطوات الحاسمة في البروتوكول. البروتوكول الواردة في هذه الورقة هي واحدة من العديد من الأساليب القياسية لتحريض كبسولة في المرسلة جيم- وقد استخدمت بنجاح في مختبرات الخميرة للعديد من السنوات23. المرسلة جيم- كبسولة التعريفي هو CO2-تعتمد ويحدث فقط تحت ظروف ضاغطة23،33. ولذلك، من الأهمية بمكان أن يحدث في حاضنة2 CO 5% استخدام وسيلة مناسبة نمو نقص مغذيات. إذا كان يشتبه في عدم حدت هذه الكبسولة بعد فترة قياسية من الحضانة (عموما ح 18-24)، وينبغي مقارنة الخلايا ثقافة تحكم أونيندوسيد التي كانت لا تتعرض لظروف ضاغطة. وستحدد مقارنة الاثنين عما إذا كان تدريب فعالة. تحريض ناجح هو واحد التي تجعل معظم الخلايا كبسولة أكبر، مقارنة بعنصر التحكم أونيندوسيد. لأنه ليس كل من الخلايا سوف تحفز، ينبغي أن تكون الخلايا لقياس تمثيل غير متجانسة من الخلايا المتوفرة.
لا يمكن المبالغة بأهمية اكتساب صورة متسقة، لا سيما إذا كان القياس الآلي هو الهدف. التركيز، والتباين، والأسفار الخلفية، فضلا عن عمق بت والصورة ضغط الملفات اعتبارات هامة. عندما يكون ذلك ممكناً، ينبغي تجنب مجموعات كبيرة من الخلايا التي لا تجلس في المستوى البؤري واحد، على الرغم من أن بعض الناشئين ولمس الخلايا مقبولة ويمكن أن تكون أمرا لا مفر منه (ينبغي اتباع هذه القاعدة لقياس اليدوي والآلي على حد سواء). يمكن التحايل على هذه المشكلة إلى درجة معينة عند استخدام التصوير [كنفوكل] من فلوريسسينتلي الملون الخلايا. يمكن تمكين استخدام مكدسات z لإنتاج أقصى شدتها إسقاطات القياس الدقيق للخلايا في مختلف الطائرات المحورية من صورة واحدة29. بالإضافة إلى ذلك، ينبغي أن يكتسب الصور بسرعة بعد تحضير العينة. يمكن أن يكون هذا أهمية خاصة بالنسبة للهند الحبر الملون العينات عندما يبدأون الجافة، ويمكن أن تقلل من التباين بين العناصر الأمامية والخلفية (الخلايا) وميزات أساسية غير مرغوب فيها وقد تتعزز، الأمر الذي يؤدي إلى انخفاض الآلي دقة تجزئة.
على الرغم من أن قياس القطر كبسولة شائعة في المجتمع المرسلة جيم ، حتى هذه اللحظة هم عادة أجريت يدوياً، الأمر الذي يتطلب الكثير من الوقت والقوى العاملة. ومع ذلك، تقبل القياسات اليدوية في الميدان ويمكن الحصول على نتائج على نفقة قليلاً. التقدم في برنامج تحليل الصور جعلت من الممكن اتخاذ الخطوات الأولى نحو أتمتة هذه القياسات. طبيعة بسيطة من جسم الخلية المرسلة جيم وكبسولة-التي تظهر على شكل دائرة داخل دائرة-في 2D الصور يجعل قياس أحجامها بسيطة نسبيا لحزم برامج تجزئة الصورة الآلي، دون الحاجة إلى وضع الرواية خوارزميات. بدلاً من ذلك، عن طريق ربط الخوارزميات الموجودة، الخلايا المرسلة جيم وكبسولات يمكن الكشف عن، مجزأة، وقياسه. باستخدام هذا النهج، نحن قد الآلي قياسات القطر كبسولة المرسلة جيم للخلايا الملون مع الأكثر شيوعاً صبغ الكبسولة المستعملة، الحبر الهند، وقد مقارنة هذه القياسات اليدوية لنفس مجموعات البيانات. هذا الأسلوب يتيح الاستفادة من إمكانية تكرار نتائج وإزالة الكثير من الأخطاء البشرية المرتبطة بالقياس اليدوي مع توفير وقت الباحث. وعلاوة على ذلك، يمكن إدراج قياسات إضافية مع الحد الأدنى من الجهد في سير العمل التحليل الآلي. أننا نرى أن تحليل الصور الآلي نهجاً واعداً يسمح للباحثين لقياس عدد كبير من كبسولة المرسلة جيم- بدرجة عالية من الدقة والكفاءة.
وعموما، لقد أظهرنا كيف أن تحفز النمو كبسولة في المرسلة جيم-بنجاح، ووصمة عار العينات مع الحبر الهند أو صبغات الفلورسنت، وقياس كبسولة قطرها باستخدام قياسات كل اليدوي والآلي في تحليل الصورة البرمجيات. نتائجنا تشير إلى أن كلا الأسلوبين لتلطيخ قابلة للتطبيق، وتنتج نتائج متسقة عموما (على الرغم من وجود تباين أكثر مع قياسات الحبر الهند). علاوة على ذلك، أساليب القياس اليدوي والآلي على حد سواء لديهم القدرة على تمييز متفاوتة الأحجام الكبسولة.

تؤثر على ربع مليون شخص كل عام، وأسفر عن وفاة أكثر من 180,000 سنوياً، المرسلة بين هو من خميرة المسببة للأمراض، وداخل الخلايا والمسبب للفطريات1،2، 3. الأكثر تضررا هم مرضى فيروس نقص المناعة البشرية في البلدان الفقيرة الذين ليس لديهم استعداد الحصول على العلاج المضاد للفيروسات الرجعية، ويجعلها شديدة عرضه ل المرض5،،من46. وتشير البيانات من مركز السيطرة على الأمراض إلى أن في أفريقيا جنوب الصحراء، والمرسلة جيم- يقتل المزيد من الناس من السل سنوياً وشهريا أكثر من أي تفشي فيروس إيبولا في سجل1. الطريق الأكثر شيوعاً للتعرض يحدث من استنشاق الجراثيم يهتمان التي شائعة في البيئة7. عند دخول الرئتين، وهناك عدة عوامل الفوعة التي تسهم في نجاح المرسلة جيم- ضمن الأفراد المصابين. ويعتبر الكبسولة السكاريد عامل الفوعة الأساسي الميكروب، سلالات أكابسولار لا ضراوة8.
كبسولة الفطري تتألف من ثلاثة عناصر هي المبدأ: جلوكورونوكسيلومانان (جكسم)، جالاكتوكسيلومانان (جالكسم)، ومانوبروتينس (MPs)9. بينما النواب عنصرا المرتبطة بجدار الخلية طفيفة نسبيا من الكبسولة، وهي مكسبه ويمكن تعزيز استجابة برو-التهابات معظمهم9،10. وفي المقابل، جكسم وجالكسم يشكلون الجزء الأكبر الكبسولة (> 90% بالوزن)، وقد آثار كآبته11. بالإضافة إلى إثارة إيمونومودولاتوري، إنشاء التوسيع السريع لكبسولة في فيفو حاجز ميكانيكية لابتلاع المضيف الخلايا البلعمية (أي، العَدلات والضامة)12. كبسولة المرسلة جيم وملخص معقدة، ولكن قطر كبسولة عموما، زيادة يرتبط مع ازدياد ضراوة6،،من1314. نظراً لهذا، من المهم للباحثين المرسلة جيم- لتكون قادرة بسرعة ودقة قياس قياسات كبسولة.
الخلية المرسلة C. وفي كبسولة السكاريد الهياكل الحيوية وإظهار التغييرات على مر الوقت15. يمكن تغيير الكبسولة في الكثافة والحجم، والجمعية العامة استجابة للتغيرات في البيئة المضيفة16،،من1718. الحديد منخفضة أو مستويات المغذيات، التعرض لمصل الدم ودرجة الحموضة الفيزيولوجية البشرية وزيادة أول أكسيد الكربون2 معروفة لبدء النمو كبسولة16،18،،من1920. علاوة على ذلك، أظهرت الباحثون التغييرات الهيكلية التي أسفرت عن وجود اختلافات كبيرة في إيمونوريكتيفيتي خلال عدوى، الإقراض ميزة جيم-المرسلة على المضيفة21،22. وهذا يعرف بهيكل الكبسولة المرسلة جيم- قد تم تحليلها في مجموعة متنوعة من الطرق. المجهر الإلكتروني، على سبيل المثال، قد كشفت أن الكبسولة قد مصفوفة متجانسة مع طبقة كثيفة إلكترون داخلية تحت طبقة الخارجي، نفاذية أكثر23. تشتت الضوء، واستخدام الملقط الضوئية مكنت الباحثين لتوضيح خصائص الجزيئات في24. تحليل النتائج من كل القياسات تشتت الضوء والدينامية، ونحن نعلم أن الكبسولة السكاريد له هيكل تفريعات معقدة23. وقد استخدمت ملاقط بصرية لاختبار صلابة الهيكل، فضلا عن تقييم بجسم مفاعليه24. ومع ذلك، تحليل العاملين أكثر في كثير من الأحيان الكبسولة المرسلة جيم- هو قياس حجمه.
لقياس الحجم الكبسولة، استخدم الباحثون ما ينبغي أن يكون قياس بسيطة: قطر خطي الكبسولة. وتستخدم المجاهر الرقمية لالتقاط صور متعددة الخلايا المرسلة جيم (عموما مئات) ملطخة بالحبر الهند أو صبغات الفلورسنت. ويقاس حجم كل خلية الجسم والكبسولة المحيطة بها. يتم تجميع البيانات، ويتم حساب متوسط قطرها الكبسولة عن طريق طرح قطر جسم الخلية من القطر كله خلية (خلية الجسم + كبسولة). حتى هذه اللحظة، تم تنفيذ هذه القياسات يدوياً. بينما عموما دقيقة، يحتوي هذا الأسلوب عيوب للباحثين. مجموعات كبيرة من البيانات يمكن أن تأخذ أيام أو حتى أسابيع لتحليل باليد. ونظرا لأن هذه القياسات تتم يدوياً، الذاتية والأخطاء البشرية قد تؤثر على النتيجة.
تحليل الصور الحاسوبية المؤتمتة أصبحت أداة لا غنى عنها للباحثين في كثير من مجالات بيولوجيا الخلية الجزيئية، تمكين تحليل الصور البيولوجية 25،،من2627أسرع وأكثر موثوقية. تقنيات تحليل الصورة الدقيقة ضرورية للمعلومات الكمية عن ما غالباً ما تكون معقدة وهائلة من مجموعات البيانات المتعلقة بالألغام. ومع ذلك، بعض القياسات، لا سيما قياس كبسولة المرسلة جيم ، كان من الصعب على أتمتة. دقة تحديد الواجهة بين جدار الخلية وكبسولة، الذي يظهر عادة كعصابة الظلام عند تصويرها بالفحص المجهري المرحلة-على النقيض، يمكن أن تكون مزعجة لحل باستخدام عتبة بسيطة. علاوة على ذلك، الخلايا المرسلة جيم في الثقافة تميل إلى أن تتجمع معا وتقسيم دقيق للخلايا اللازمة لقياسات دقيقة.
وكان الهدف من هذا المشروع (ط) توضيح أحد البروتوكولات القياسية لتحريض كبسولة في المرسلة جيم، (ثانيا) قارن وعلى النقيض الحبر الهند وتلطيخ الأسفار كما أنها تتصل بكبسولة قياسات القطر، (ثالثا) تطوير بسيط، الطرق الحسابية لقياس القطر كبسولة استخدام الصور للهند الحبر الملون الخلايا باستخدام برنامج تحليل صورة، و (رابعا) تقييم فوائد وتقييدات لقياس القطر كبسولة يدوياً واستخدام برامج التشغيل الآلي. أننا نجد أن الأسلوبين المصبوغة، فلوري وسم جدار الخلية وكبسولة، بينما أكثر استهلاكاً للوقت، وتقدم نتائج أكثر اتساقا بين التجارب. بيد أن كلا الأسلوبين مكن لنا أن نميز بنجاح بين مختبر والسريرية المرسلة جيم- كبسولة سلالات العارضة مختلفة الأحجام. علاوة على ذلك، كنا قادرين على أتمتة قياس القطر كبسولة من الهند الحبر الملون الصور، ووجدت أن هذا بديل قابل للتطبيق للقياس اليدوي من الكبسولة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="983">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Capsule Induction</td>
			<td style="width:204px;"></td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C. neoformans cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The clinical lab strain, H99S, was a kind gift from Dr. John Perfect (Duke University).&#160; The clinical strains, B18 and B52, were kind gifts from Dr. Greg Bisson (University of Pennsylania).&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Peptone Dextrose Broth (YPD)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0428-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This is made in the lab using standard recipe (137mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4O, 2 mM Kh2PO4O)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/high-glucose with L-glutamine, without sodium pyruvate</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-well plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>CL5335-5EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shaking incubator</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td></td>
			<td>MaxQ6000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CO2 incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Isotemp</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Legend XTR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Legend Micro 21R</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">India ink</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-910-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcofluor white</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>18909-100ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">18B7 mouse anti-GXM antibody conjugated to Alexafluor 488</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A kind gift from Dr. Arturo Casadevall (Johns Hopkins University)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS with 1% Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PBS is the same recipe listed above (line 4) with 1% BSA added and filter sterilized.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Superfrost microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass coverslips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2855-18</td>
			<td>#1.5 thickness</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Clear nail polish or other non-toxic sealant</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image Acquisition&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immersion oil</td>
			<td>Cargille&#160;</td>
			<td>16484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Light microscope with immersion oil objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Zeiss Axio A1 with a Plan - NEOFLUAR 100x oil immersion NA 1.30 objective</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Light microscope camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Zeiss Axiocam ErCD camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal microscope with oil immersion objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>LSM 700 laser scanning confocal equipped with a Plan-Apochromat 63X NA 1.4 oil immersion DIC M27 objective.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal microscope software</td>
			<td>Zen 2009</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal microscope camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Nikon Ti-Eclipse with a Intensilight epifluorescence illuminator (Nikon), CoolSNAP MYO microscope camera (Photometrics), Plan Apo 60x NA 1.40 oil immersion objective (Nikon) and 1.5x magnification changer.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Widefield imaging software</td>
			<td>Nikon Elements (Nikon)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Capsule Measurement</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image editing software</td>
			<td>Photoshop (Adobe)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope software for manual measurement</td>
			<td>Axiovision (Carl Zeiss)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image analysis software for automated meesurement</td>
			<td>Aivia (DRVision Technologies)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spreadsheet software</td>
			<td>Excel (Microsoft)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

size matters: measurement of capsule diameter in cryptococcus neoformans

كبسولة السكاريد من المرسلة بين عامل الفوعة الأساسي وعادة من أهم درس جوانب من هذه الخميرة المسببة للأمراض. الحجم الكبسولة يمكن أن تختلف على نطاق واسع بين السلالات ولديها القدرة على النمو بسرعة عند عرض الظروف المغذيات المجهدة أو منخفضة، وقد تم ارتباطاً إيجابيا بضراوة سلالة. لهذه الأسباب، الحجم الكبسولة من اهتمام كبير للباحثين المرسلة جيم . هو الناجم عن نمو الكبسولة المرسلة جيم- أثناء اختبار المظهرية للمساعدة في فهم آثار المعالجات المختلفة على الخميرة أو حجم الاختلافات بين السلالات. هنا يصف لنا أحد الأساليب القياسية كبسولة التعريفي ومقارنة الأساليب المقبولة اثنين من تلطيخ وقياس القطر كبسولة: الهند الحبر (ط)، ووصمة سلبية، المستخدمة في الاقتران مع الفحص المجهري الخفيفة التقليدية و (ثانيا) تلطيخ يشترك مع الأصباغ الفلورية جدار الخلية وكبسولة تليها مجهرية [كنفوكل] على حد سواء. أخيرا، نحن إظهار كيف يمكن قياس القطر كبسولة من عينات الملطخة بالحبر الهند الآلي باستخدام تحليل الصور الحسابية.

لتوضيح التعريفي كبسولة وتلطيخ الخلية وتصوير وقياس التقنيات، استخدمنا ثلاث سلالات من جيم-المرسلة: سلالة المختبر مشتركة، تتميز جيدا، H99S30، والسلالات المعزولة سريرياً اثنين من سابقا قطر كبسولة غير معروف، B18 و B5231.
ويبين الشكل 1 ألفسير العمل التعريفي الكبسولة وتلطيخ، والحصول على الصور باستخدام الحبر الهند. صور مأخوذة من ثلاث سلالات من جميع مبينة في الشكل 1 باء قبل وبعد التعريفي. وسوف تعرف الباحث إذا كان الاستقراء كبسولة نجاح بمقارنة الخلايا التي خضعت لتحريض كبسولة لتلك الثقافة نفسها التي لم. بزيادة حجم واضحة واضح عموما في معظم سلالات بعد الاستقراء، على الرغم من أن بعض سلالات سوف يحمل كبسولات صغيرة بطبيعة الحال حتى بعد التعريفي (انظر صور B18 في الشكل 1B). تجدر الإشارة إلى أن التعريف كبسولة ستفشل إذا لم تتم إزالة الوسائط الغنية المتبقية قبل التعريفي أو إذا لم يكن موجوداً CO2 . وفي هذه الحالات، سيتبع زيادات متواضعة فقط (أن وجدت) في الحجم الكبسولة. تم قياس أقطار من ثلاث سلالات من جميع يدوياً، وتظهر النتائج في الشكل 1. في اثنين من هذه التجارب الثلاث، لم يكن هناك فرق في الحجم بين H99S و B18. بيد أن اختلاف كبير في حجم لوحظ استمرار بين ضغطاً أكبر، B52، و H99S و B18 (ف < 0.001 و p < 0.001، على التوالي، اختبار المربعات الأقل القياسية مع التناقضات البسيطة، حجم العينة = 50 خلايا/سلالة ).
ويصور الشكل 2A سير العمل التعريفي الكبسولة وتلطيخ، والحصول على الصور باستخدام الأصباغ الفلورية اثنين، أحدهما للكبسولة (18B7-AF488) والآخر لجدار الخلية (كالكوفلور البيضاء). تم القبض على الصور ك z-مداخن لكل ثلاث سلالات من بعد التعريفي، وضمان أن تم القبض على القطر الكبسولة وخلايا الجسم كحد أقصى لكل خلية يمكن قياسها (الشكل 2). تمت معالجة كل z-مكدس الذاكرة المؤقتة لإنتاج أقصى شدتها الإسقاطات، ضغط المكدس ثلاثي الأبعاد إلى صورة ثنائية الأبعاد قبل التحليل (الشكل 2). ثم تم قياس هذه يدوياً (الشكل 2D). خلافا للقياسات للهند الحبر الملون الخلايا، يكرر الفلورسنت تلطيخ تمكين لنا لتميز بين كل ثلاث سلالات استناداً إلى طول القطر كبسولة في كل ثلاثة من هذه التجربة. هنا، نجد أن B18 كانت أصغر من القطر الكبسولة و B52 أكبر (ف < 0.001 لكل المقارنات، اختبار المربعات القياسية مع آثار بسيطة، حجم العينة = 50 خلايا/سلالة).
لزيادة تقييم طريقتين لتلطيخ كبسولة المرسلة جيم ، تم مقارنة القياسات من ثلاث سلالات من جميع. وكان هناك لا يوجد فرق كبير بين أحجام كبسولة تحدد باستخدام هاتين الطريقتين لتلطيخ (الشكل 3A) (ANOVA المتعدد مع آثار بسيطة، حجم العينة = 50 خلايا/سلالة). هذا الاستنتاج كان يتفق مع نتائج تجربة منفصلة فيها سلالة المختبر، H99S، ملطخة المشترك مع الهند الحبر والأصباغ الفلورية (الشكل 3B-ج). ومع ذلك، كان هناك تقلب أكبر بين تجارب باستخدام الحبر الهند، كما يتضح من حقيقة أن فقط واحدة من أصل ثلاث تجارب أظهرت فرقا كبيرا في الحجم الكبسولة بين H99S و B18، مقارنة بالفرق الكبير ولاحظ بين هذه السلالات في جميع الفلورسنت ثلاث تجارب (الشكل3D-E) (ANOVA المتعدد مع آثار بسيطة، حجم العينة = 50 خلايا/سلالة).
الهند الحبر الملون الصور التي تفي بالمعايير الواردة في البروتوكول (المادة 5) يمكن أن تقاس باستخدام نظام الآلي. سير العمل المبين في الشكل 4A خطوط إرشاد المستخدم من خلال الخطوات اللازمة للاستفادة من الوصفات مصممة لقياس الكبسولة المرسلة جيم . بعد تطوير سير العمل، فإنه تم التحقق من صحة بقياس ذاكرة التخزين مؤقت للصور الموجودة في الخلايا المرسلة جيم قبل ثلاثة باحثين باستخدام الأساليب اليدوية والآلية على حد سواء. لا توجد هناك فروق كبيرة بين القياسات للباحث عند إجراء يدوياً، وهذا ينطبق أيضا عندما أجريت القياسات باستخدام برمجيات تحليل الصورة الآلي (الشكل 4 باء) (ANOVA، حجم العينة = 50 خلايا/الباحث). ومع ذلك، كان هناك صغيرة لكن ذكرت الفرق الكبير في حجم كبسولة بين هاتين الطريقتين (الشكل 4) ANOVA، حجم العينة = 150 خلايا/المجموعة. كبسولة قطرها استمرار يقل بشكل طفيف عندما يقاس عن طريق أتمتة من القياسات اليدوية (0.3 ميكرومتر، ف < 0.001). بالإضافة إلى ذلك، عند مقارنة بين قياسات الحجم الكبسولة المقدمة من الباحثين منفصلة من نفس مجموعات الصور، الخطأ القياسي كان أصغر عندما استخدمت برنامج تحليل الصور للقياس الكمي بدلاً من الأساليب اليدوية، وتوحي بالمزيد قياسات دقيقة واستنساخه باستخدام الأسلوب الآلي. لقياس النجاح الآلي، الخلايا يجب أن تكون في التركيز، ومتوسطة كبسولة كبيرة، ولا تكون مفرطة متفاوت المسافات (الشكل 4). ووجدنا أن الصور سيئة مركزة من الخلايا متفاوت المسافات مع كبسولات صغيرة لا يمكن قياسه تلقائياً في البرنامج. ومع ذلك، فإننا نؤكد أن هذه قد تكون أيضا تحديا لقياس دقة استخدام الأساليب اليدوية.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57171/57171fig1.jpg"> الشكل 1 : الحبر الهند تلطيخ لقياس جيم-المرسلة كبسولة. (A) التمثيل التخطيطي المرسلة جيم- القياس كبسولة من تلطيخ الحبر الهند. وباختصار، كبسولة التعبير هو الناجم عن استخدام الحرمان المغذيات، والتعرض لأول أكسيد الكربون2، والخلايا حراكه في الحبر الهند وشنت على الشرائح الزجاجية. يتم الحصول على صور خلايا الملون بالفحص المجهري الخفيفة، مع الحقول المحددة أما بالمستخدم أو بواسطة مسح البلاط باستخدام مرحلة كمبيوتر التي تسيطر عليها. الصور يمكن أما يدوياً بتحليل أو معالجة لتجزئة الصورة الآلي والتحليل. (ب) صور من سلالة مختبر المشتركة، H99S وهما من سلالات السريرية، B18 و B52، الحث على حد سواء قبل وبعد كبسولة. تمثل أشرطة مقياس 10 ميكرون تجربة الرسم البياني (ج) ممثل قطر عرض كبسولة من كل ثلاث سلالات ملطخة بالحبر الهند وقياسه يدوياً (ويمثل الخطأ كالخطأ المعياري (SE)). تتم الإشارة إلى الدلالة الإحصائية على النحو التالي: *، ف < 0.05؛ * *، ف < 0.01؛ و * * *، ف < 0.001. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57171/57171fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57171/57171fig2.jpg"> الشكل 2 : تلطيخ الفلورسنت لقياس جيم-المرسلة كبسولة. (أ) التمثيل التخطيطي المرسلة جيم- القياس كبسولة كالكوفلور الأبيض (CFW) وتلطيخ 18B7-AF488 المشترك. بعد التعريفي الكبسولة وتلطيخ، شنت الخلايا وتصويرها بالليزر الفحص المجهري [كنفوكل]. كما قد تكون الخلايا في مختلف الطائرات المحورية، تكتسب z-أكوام في كل موقف. وهذه تتم معالجتها لإنتاج أقصى شدتها الإسقاطات التي يمكن استخدامها لقياس القطر كبسولة الحد الأقصى لكل خلية بدقة. (ب) الصور من سلالة مختبر المشتركة، H99S وهما من سلالات السريرية، B18 و B52، كبسولة بعد التعريفي. ملاحظة: تمثل أشرطة مقياس 10 ميكرون لكل الصور. (ج) كحد أقصى كثافة إسقاطات المسمى فلوريسسينتلي الخلايا المرسلة جيم . (د) الرسم البياني لتجربة الممثل عرض يدوياً قياس القطر كبسولة من كل ثلاث سلالات من الملون مع CFW و 18B7-AF488 (يتم تمثيل الخطأ كالخطأ المعياري (SE)). تتم الإشارة إلى الدلالة الإحصائية على النحو التالي: *، ف < 0.05؛ * *، ف < 0.01؛ و * * *، ف < 0.001. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57171/57171fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57171/57171fig3.jpg"> الشكل 3 : مقارنة النتائج بين الحبر الهند وتلطيخ الفلورسنت. (أ) تحليل لثلاث سلالات من المرسلة جيم- ملطخة بالحبر الهند أو الأصباغ الفلورية، n = 3 (يتم تمثيل الخطأ كالخطأ المعياري (SE)). (ب) صور وحيد الخلية المرسلة جيم- ملطخة بالحبر الهند وكل الأصباغ الفلورية (شريط مقياس يمثل 13 ميكرومتر). ترسيم خطوط أفقية حواف الكبسولة وترسيم الخطوط العمودية حواف الجسم الخلية. (ج) التحديد الكمي لتجربة تمثيلية من H99S الملون المشترك مع الهند الحبر والأصباغ الفلورية (ويمثل الخطأ كالخطأ المعياري (SE)). (د، ه) تصوير لتقلب كبسولة قطرها بين تجارب الحبر الهند (د) والتجارب الفلورسنت (E). <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57171/57171fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57171/57171fig4.jpg"> الشكل 4 : تحليل الحسابية جيم-المرسلة القطر كبسولة من الصور من الهند الحبر الملون الخلايا. (أ) التمثيل التخطيطي لتجزئة الصورة وقياس كبسولة جيم-المرسلة باستخدام أسلوب قياس الآلي (انظر الجدول للمواد). (ب) مقارنة القياسات كبسولة يؤديها المحققين منفصلة 3 استخدام أساليب المؤتمتة (الآلي 1-3) والدليل (دليل 1-3). كل محقق يستخدم مخبأ متطابقة من الصور المرسلة جيم- بكلتا الطريقتين (يمثل خطأ ك StDev). (ج) الجمع بين متوسط القياسات اليدوي والآلي القياسات (يتم تمثيل الخطأ كالخطأ المعياري (SE)). أمثلة من كلا مثالية (د) و (ه) غير المثالية الصور من المرسلة جيم-. صور عدم المثالية لا يمكن قياسه بنجاح في البرنامج. تتم الإشارة إلى الدلالة الإحصائية على النحو التالي: *، ف < 0.05؛ * *، ف < 0.01؛ و * * *، ف < 0.001. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57171/57171fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans at JoVE.com

Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

المسائل الحجم: قياس "القطر كبسولة" في المرسلة بين

كبسولة السكاريد هو عامل الفوعة الأساسي بين المرسلة، وحجمه وترتبط بضراوة السلالة. قياسات قطرها كبسولة وتستخدم في اختبار المظهرية وقياس الفعالية العلاجية. ويرد هنا أسلوب قياسي لتحريض كبسولة، والمقارنة بين طريقتين لتلوين وقياس القطر.

The polysaccharide capsule of Cryptococcus neoformans is the primary virulence factor and one of the most commonly studied aspects of this pathogenic ...

size-matters-measurement-capsule-diameter-cryptococcus

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

13.4K Views.  Middle Tennessee State University. كبسولة السكاريد هو عامل الفوعة الأساسي بين المرسلة، وحجمه وترتبط بضراوة السلالة. قياسات قطرها كبسولة وتستخدم في اختبار المظهرية وقياس الفعالية العلاجية. ويرد هنا أسلوب قياسي لتحريض كبسولة، والمقارنة بين طريقتين لتلوين وقياس القطر.

Video: Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics

Lymphatic vessels comprise a multifunctional transport system that maintains fluid homeostasis, delivers lipids to the central circulation, and acts as a surveillance system for potentially harmful antigens, optimizing mucosal immunity and adaptive immune responses1. Lymph is formed from interstitial fluid that enters blind-ended initial lymphatics, and then is transported against a pressure gradient in larger collecting lymphatics. Each collecting lymphatic is made up of a series of segments called lymphangions, separated by bicuspid valves that prevent backflow. Each lymphangion possesses a contractile cycle that propels lymph against a pressure gradient toward the central circulation2. This phasic contractile pattern is analogous to the cardiac cycle, with systolic and diastolic phases, and with a lower contraction frequency4. In addition, lymphatic smooth muscle generates tone and displays myogenic constriction and dilation in response to increases and decreases in luminal pressure, respectively5. A hybrid of molecular mechanisms that support both the phasic and tonic contractility of lymphatics are thus proposed.
Contraction of smooth muscle is generally regulated by the cytosolic Ca2+ concentration ([Ca2+]i) plus sensitivity to Ca2+, of the contractile elements in response to changes in the environment surrounding the cell6. [Ca2+]i is determined by the combination of the movement of Ca2+ through plasma membrane ligand or voltage gated Ca2+ channels and the release and uptake of Ca2+ from internal stores. Cytosolic Ca2+ binds to calmodulin and activates enzymes such as myosin light chain (MLC) kinase (MLCK), which in turn phosphorylates MLC leading to actin-myosin-mediated contraction8. However, the sensitivity of this pathway to Ca2+ can be regulated by the MLC phosphatase (MLCP)9. MLCP activity is regulated by Rho kinase (ROCK) and the myosin phosphatase inhibitor protein CPI-17.
Here, we present a method to evaluate changes in [Ca2+]i over time in isolated, perfused lymphatics in order to study Ca2+-dependent and Ca2+-sensitizing mechanisms of lymphatic smooth muscle contraction. Using isolated rat mesenteric collecting lymphatics we studied stretch-induced changes in [Ca2+]i and contractile activity. The isolated lymphatic model offers the advantage that pressure, flow, and the chemical composition of the bath solution can be tightly controlled. [Ca2+]i was determined by loading lymphatics with the ratiometric, Ca2+-binding dye Fura-2. These studies will provide a new approach to the broader problem of studying the different molecular mechanisms that regulate phasic contractions versus tonic constriction in lymphatic smooth muscle.

Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics

We introduce an approach to evaluate the cytosolic Ca2+ concentration in isolated lymphatics to study Ca2+-dependent and Ca2+-sensitizing mechanisms of lymphatic smooth muscle contraction.

قياس الكالسيوم عصاري خلوي 2 + في مفاوية مقلص متفرقة

Lymphatic vessels comprise a multifunctional transport system that maintains fluid homeostasis, delivers lipids to the central circulation, and acts as a ...

Measurement of &#947;HV68 Infection in Mice

&gamma;-Herpesviruses (&gamma;-HVs) are notable for their ability to establish latent infections of lymphoid cells1. The narrow host range of human &gamma;-HVs, such as EBV and KSHV, has severely hindered detailed pathogenic studies. Murine &gamma;-herpesvirus 68 (&gamma;HV68) shares extensive genetic and biological similarities with human &gamma;-HVs and is a natural pathogen of murid rodents2. As such, evaluation of &gamma;HV68 infection of mice inbred strains at different stages of viral infection provides an important model for understanding viral lifecycle and pathogenesis during &gamma;-HVs infection.
Upon intranasal inoculation, &gamma;HV68 infection results in acute viremia in the lung that is later resolved into a latent infection of splenocytes and other cells, which may be reactivated throughout the life of the host3,4. In this protocol, we will describe how to use the plaque assay to assess infectious virus titer in the lung homogenates on Vero cell monolayers at the early stage (5 - 7 days) of post-intranasal infection (dpi). While acute infection is largely cleared 2 - 3 weeks postinfection, a latent infection of &gamma;HV68 is established around 14 dpi and maintained later on in the spleen of the mice. Latent infection usually affects a very small population of cells in the infected tissues, whereby the virus stays dormant and shuts off most of its gene expression. Latently-infected splenocytes spontaneously reactivate virus upon explanting into tissue culture, which can be recapitulated by an infectious center (IC) assay to determine the viral latent load. To further estimate the amount of viral genome copies in the acutely and/or latently infected tissues, quantitative real-time PCR (qPCR) is used for its maximal sensitivity and accuracy. The combined analyses of the results of qPCR and plaque assay, and/or IC assay will reveal the spatiotemporal profiles of viral replication and infectivity in vivo.

&#947;-Herpesviruses (&#947;-HVs) establish life-long persistency in their host. Infection of mice with &#947;-HV68 provides a genetically tractable in vivo model for the characterization of the lifecycle/pathogenesis of &#947;HVs. This protocol describes the detection and quantitation of &#947;HV68 infection at acute and latent stages following infection by plaque-forming, infectious center, and qPCR assays.

قياس γHV68 العدوى في الفئران

&gamma;-Herpesviruses (&gamma;-HVs) are notable for their ability to establish latent infections of lymphoid cells1. The narrow host range of human ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

A complex interaction between the immune response and host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in particular, is known to occur as a response to infection in mammals 1 and has also recently been described in Drosophila melanogaster2. It is generally accepted that sleep is beneficial to the host during an infection and that it is important for the maintenance of a robust immune system3,4. However, experimental evidence that supports this hypothesis is limited4, and the function of excess sleep during an immune response remains unclear. We have used a multidisciplinary approach to address this complex problem, and have conducted studies in the simple genetic model system, the fruitfly Drosophila melanogaster. We use a standard assay for measuring locomotor behavior and sleep in flies, and demonstrate how this assay is used to measure behavior in flies infected with a pathogenic strain of bacteria. This assay is also useful for monitoring the duration of survival in individual flies during an infection. Additional measures of immune function include the ability of flies to clear an infection and the activation of NF&kappa;B, a key transcription factor that is central to the innate immune response in Drosophila. Both survival outcome and bacterial clearance during infection together are indicators of resistance and tolerance to infection. Resistance refers to the ability of flies to clear an infection, while tolerance is defined as the ability of the host to limit damage from an infection and thereby survive despite high levels of pathogen within the system5. Real-time monitoring of NF&kappa;B activity during infection provides insight into a molecular mechanism of survival during infection. The use of Drosophila in these straightforward assays facilitates the genetic and molecular analyses of sleep and the immune response and how these two complex systems are reciprocally influenced.

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

To understand a link between the immune response and behavior, we describe a method to measure locomotor behavior in Drosophila during bacterial infection as well as the ability of flies to mount an immune response by monitoring survival, bacterial load, and real-time activity of a key regulator of innate immunity, NF&kappa;B.

قياس كمية الاستجابة المناعية والنوم في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Measurement of Tactile Allodynia in a Murine Model of Bacterial Prostatitis

Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are pathogens that play an important role in urinary tract infections and bacterial prostatitis1. We have recently shown that UPEC have an important role in the initiation of chronic pelvic pain2, a feature of Chronic prostatitis/Chronic pelvic pain syndrome (CP/CPPS)3,4. Infection of the prostate by clinically relevant UPEC can initiate and establish chronic pain through mechanisms that may involve tissue damage and the initiation of mechanisms of autoimmunity5.
A challenge to understanding the pathogenesis of UPEC in the prostate is the relative inaccessibility of the prostate gland to manipulation. We utilized a previously described intraurethral infection method6 to deliver a clinical strain of UPEC into male mice thereby establishing an ascending infection of the prostate. Here, we describe our protocols for standardizing the bacterial inoculum7 as well as the procedure for catheterizing anesthetized male mice for instillation of bacteria.
CP/CPPS is primarily characterized by the presence of tactile allodynia4. Behavior testing was based on the concept of cutaneous hyperalgesia resulting from referred visceral pain8-10. An irritable focus in visceral tissues reduces cutaneous pain thresholds allowing for an exaggerated response to normally non-painful stimuli (allodynia). Application of normal force to the skin result in abnormal responses that tend to increase with the intensity of the underlying visceral pain. We describe methodology in NOD/ShiLtJ mice that utilize von Frey fibers to quantify tactile allodynia over time in response to a single infection with UPEC bacteria.

Infection of the prostate may be a contributing factor in mediating pelvic pain in chronic prostatitis. We describe the procedure for preparation of standardized bacterial inoculum, instillation of bacteria into the urethra of male mice and methodology for measuring tactile allodynia in mice over time.

قياس آلام جلدية اللمس في نموذج الفئران التهاب البروستاتا الجرثومي

Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are pathogens that play an important role in urinary tract infections and bacterial prostatitis1. We have recently ...

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular interaction that is not clearly understood is non-lytic exocytosis. In this process, yeast cells are released into the extracellular space by a poorly understood mechanism that leaves both the macrophage and Cn viable. Here, we describe how to follow a large number of individually infected macrophages for a 24 hr infection period by time-lapsed microscopy. Infected macrophages are housed in a heating chamber with a CO2 atmosphere attached to a microscope that provides the same conditions as a cell-culture incubator. Live digital microscopy can provide information about the dynamic interactions between a host and pathogen that is not available from static images. Being able to visualize each infected cell can provide clues as to how macrophages handle fungal infections, and vice versa. This technique is a powerful tool in studying the dynamics that are behind a complex phenomenon.

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

We describe how to visualize macrophage-C. neoformans (Cn) interactions in real time, with specific emphasis on the process of non-lytic exocytosis using digital light microscopy. Using this technique individually infected macrophages can be studied to ascertain various aspects of this phenomenon.

تصور الإيماس غير التحللي من<em&gt; الأدعومية المستخفية</em&gt; من الضامة الرقمية الخفيفة عن طريق الميكروسكوب

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are able to replicate in the deep lung. Phagocytosis of Cryptococcus by macrophages is one of the ways that the disease is able to spread into the central nervous system to cause lethal meningoencephalitis. Therefore, study of the association between Cryptococcus and macrophages is important to understanding the progression of the infection. The present study describes a step-by-step protocol to study macrophage infectivity by C. neoformansin vitro. Using this protocol, the role of host sterols on host-pathogen interactions is studied. Different concentrations of methyl--cyclodextrin (MCD) were used to deplete cholesterol from murine reticulum sarcoma macrophage-like cell line J774A.1. Cholesterol depletion was confirmed and quantified using both a commercially available cholesterol quantification kit and thin layer chromatography. Cholesterol depleted cells were activated using Lipopolysacharide (LPS) and Interferon gamma (IFN&#947;) and infected with antibody-opsonized Cryptococcus neoformans wild-type H99 cells at an effector-to-target ratio of 1:1. Infected cells were monitored after 2 hr of incubation with C. neoformans and their phagocytic index was calculated. Cholesterol depletion resulted in a significant reduction in the phagocytic index. The presented protocols offer a convenient method to mimic the initiation of the infection process in a laboratory environment and study the role of host lipid composition on infectivity.

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

بلعم الكولسترول استنفاد وتأثيره على البلعمة من<em&gt; المستخفية المورمة</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal meningitis worldwide resulting in more than 625,000 deaths per year worldwide.&#160;Although electroporation has been developed for the transformation of plasmids in Cryptococcus, only&#160;biolistic&#160;delivery provides&#160;an effective means to transform&#160;linear&#160;DNA&#160;that can be integrated into the genome by homologous recombination.&#160;
Acetate has been shown to be a major fermentation product during cryptococcal infection, but the significance of this is not yet known.&#160;A bacterial pathway composed of the enzymes xylulose-5-phosphate/fructose-6-phosphate phosphoketolase (Xfp) and acetate kinase (Ack) is one of three potential pathways for acetate production in C. neoformans. Here, we demonstrate the biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding Ack fused to the fluorescent tag mCherry, into&#160;C. neoformans. We then confirm integration of the ACK-mCherry fusion into the&#160;ACK&#160;locus.

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

Biolistic transformation is a method used to generate stable integration of DNA into the genome of the opportunistic pathogen Cryptococcus neoformans through homologous recombination. We will demonstrate biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding acetate kinase fused to the fluorescent tag mCherry into&#160;C. neoformans.

التحول Biolistic من نيون معلم جين إلى القناص الفطرية مسببات الأمراض<em&gt; المستخفية المورمة</em

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the viral capsid (CA) core into the cytoplasm. Subsequently, the viral Reverse Transcriptase (RT), as part of a namesake nucleoprotein complex termed the Reverse Transcription Complex (RTC), converts the viral single-stranded RNA genome into a double-stranded DNA copy (vDNA). This leads to the biogenesis of another nucleoprotein complex, termed the pre-integration complex (PIC), composed of the vDNA and associated virus proteins and host factors. The PIC-associated viral integrase (IN) orchestrates the integration of the vDNA into the host chromosomal DNA in a temporally and spatially regulated two-step process. First, the IN processes the 3&#39; ends of the vDNA in the cytoplasm and, second, after the PIC traffics to the nucleus, it mediates integration of the processed vDNA into the chromosomal DNA. The PICs isolated from target cells acutely infected with HIV-1 are functional in vitro, as they are competent to integrate the associated vDNA into an exogenously added heterologous target DNA. Such PIC-based in vitro integration assays have significantly contributed to delineating the mechanistic details of retroviral integration and to discovering IN inhibitors. In this report, we elaborate upon an updated HIV-1 PIC assay that employs a nested real-time quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR)-based strategy for measuring the in vitro integration activity of isolated native PICs.

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

قياس ل<em&gt; في المختبر</em&gt; التكامل آخر من HIV-1 Preintegration مجمعات

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...

Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

The purpose of this technique is to provide a consistent, accurate, and manageable process for large numbers of polysaccharide capsule measurements.
First, a threshold image is generated based on intensity values uniquely calculated for each image. Then, circles are detected based on contrast between the object and background using the well-established Circle Hough Transformation (CHT) algorithm. Finally, the detected cell capsules and bodies are matched according to center coordinates and radius size, and data is exported to the user in a manageable spreadsheet.
The advantages of this technique are simple but significant. First, because these calculations are performed by an algorithm rather than a human both accuracy and reliability are increased. There is no decline in accuracy or reliability regardless of how many samples are analyzed. Second, this approach establishes a potential standard operating procedure for the Cryptococcus field instead of the current situation where capsule measurement varies by lab. Third, given that manual capsule measurements are slow and monotonous, automation allows rapid measurements on large numbers of yeast cells that in turn facilitates high throughput data analysis and increasingly powerful statistics.
The major limitations of this technique come from how the algorithm functions. First, the algorithm will only generate circles. While Cryptococcus cells and their capsules take on a circular morphology, it would be difficult to apply this technique to non-circular object detection. Second, due to how circles are detected the CHT algorithm can detect enormous pseudo-circles based on the outer edges of several clustered circles. However, any misrepresented cell bodies caught within the pseudo-circle can be easily detected and removed from the resulting data sets.
This technique is meant for measuring the circular polysaccharide capsules of Cryptococcus species based on India Ink bright field microscopy; though it could be applied to other contrast based circular object measurements.

Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

This technique describes an automated batch image processor designed to measure polysaccharide capsule and body radii. While initially designed for Cryptococcus neoformans capsule measurements the automated image processor can also be applied to other contrast based detection of circular objects.

القياس الآلي كبسولة السكاريد الأنواع الفطري وجسم الخلية

The purpose of this technique is to provide a consistent, accurate, and manageable process for large numbers of polysaccharide capsule measurements.
...

A Method for the Measurement of Salivary Gland Function in Mice

Patients with Sj&#246;gren&#39;s syndrome, an autoimmune disease affecting the exocrine glands, develop salivary gland inflammation and have reduced saliva production. Similarly, saliva production is severely compromised in patients receiving radiation treatment for head and neck cancers. Rodent models, developed to mimic these clinical conditions, facilitate an understanding of the disease pathogenesis and allow for the development of new therapeutic strategies. Therefore, the ability to accurately, reproducibly, and repeatedly measure salivary gland function in animal models is critical. Building on procedures previously described in the literature, a method was developed that meets these criteria and was used to evaluate salivary gland function in mice. An additional advantage of this new method is that it is easily mastered, and has little inter-operator variation. Salivary gland function is evaluated as the amount (weight or volume) or rate (mL/min) of saliva produced in response to pilocarpine stimulation. The collected saliva is a good source for the analyses of protein content, immunoglobulin concentrations, and other biomolecules.

Salivary gland hypofunction is a frequent consequence of autoimmune disease and radiation therapy. Reproducible evaluation of salivary gland function in mouse models of these diseases is a technical challenge. Here, a simple method for accurate and reproducible measurement of saliva production in mice is described.

طريقة لقياس وظيفة الغدة اللعابية في الفئران

Patients with Sj&#246;gren&#39;s syndrome, an autoimmune disease affecting the exocrine glands, develop salivary gland inflammation and have reduced ...