ونود أن نعترف بوين أنتوني الشرائح التي استخدمت كمقارنة جنبا بجنب بشرية ثانية فضلا عن نولان سابرينا الشرائح التي استخدمت كثالث البشرية-جنب والثانية مجهر المقارنة.

1-إعداد الشرائح الحبر الهند
<ol><li>"الماصة؛" 10 ميكروليتر من عينة الفطري إلى شريحة. سيعمل أي سلالة الخميرة التعميم ولكن لهذه التجربة كان H99 السلالة الوحيدة المستخدمة. ملاحظة: إذا كانت العينة مباشرة من وسائط الثقافة، تمييع 1:2 مع برنامج تلفزيوني أو المياه يمكن أن تساعد على منع الحبر الهند من التثاقل.</li>
	<li>"الماصة؛" 2 ميليلتر من وصمة الحبر الهند على العينة ومزيج ماديا دفع طرف الماصة للعينة وتتحرك في حركة دائرية حتى يظهر الحبر الهند موزعة بالتساوي.</li>
	<li>ضع ساترة على العينة بالضغط باستمرار على الحافة اليسرى من ساترة ضد سطح الشريحة، ثم بلطف وبشكل متساو خفض الجانب المعاكس ساترة على العينة.</li>
	<li>تسمح الشريحة للهواء الجاف لمدة 5 دقائق.</li>
	<li>بلطف تطبيق طبقة خفيفة من طلاء الأظافر على الحدود ساترة لتشكيل ختم والحفاظ على وصمة الحبر الهند.</li>
</ol>2-تصوير الشريحة
<ol><li>وضع الشرائح في مجهر حقل مشرق مع مرفق الكاميرا والمعروفة بكسل إلى ميكرون التحويل. ضبط عوامل التصفية، وأهداف، والتباين حيث أن الكبسولات الخلية واضحة والهيئات الخلية عصابات الظلام، مركزة. ملاحظة: مختلف المرشحات، والأهداف، وإعدادات التباين ستعمل ولكن ينصح 20 × الهدف وتصفية Ph1 binning 2 × 2.</li>
	<li>ضمان مجال الرؤية كثيفة ولكن لا المكتظة بالسكان مع خلايا الفطري، مع تباين واضح بين كبسولة الخلية والخلفية، ومركزة بشكل صحيح مع خلايا الجسم تصور كعصابة الظلام. ملاحظة: العدد الدقيق للخلايا لصورة مثلى ستختلف بعينه والهدف قيد الاستخدام. الجوانب الهامة لضمان الخلايا غير متفاوت المسافات أو متداخلة، وأن الطائرتين تنسيق الخلية لا تختلف اختلافاً كبيرا، وأنه لا يوجد كبير الهند الحبر وصمة عار مرئية بوضوح في الخلفية (25 في المائة على الأقل من الحقل).</li>
	<li>حفظ الصور بدليل واحد مع عناوين واضحة، كما سيتم تشغيل خوارزمية القياس على الصور في دليل واحد، وسيتم تنظيم بيانات الإخراج حسب أسماء ملفات الصور.</li>
</ol>3-خوارزمية برنامج الإعداد
<ol><li>تثبيت بيثون الإصدار 2.7 من</li>
	<li>تثبيت مكتبات بايثون إضافية عن طريق تشغيل الأوامر "نقطة تثبيت وسادة" و "تثبيت برنامج تطبيق السلام أوبينبيكسل".</li>
	<li>تثبيت MATLAB باتباع الإرشادات التي تظهر في</li>
	<li>بناء مكتبة بيثون MATLAB باتباع الإرشادات المتوفرة في https://www.mathworks.com/help/matlab/matlab_external/install-the-matlab-engine-for-python.html.</li>
	<li>تنزيل الملفات المطلوبة الثلاث المدرجة في "المواد التكميلية" هذه المخطوطة ("QCA.py" و "Analysis2.m" و "TestRun.m"). ملاحظة: يمكن استخراج هذه الملفات إلى أي مكان، ولكن يجب أن يكون الثلاثة في نفس الدليل.</li>
</ol>4-استخدام خوارزمية
<ol><li>قم بتشغيل التطبيق بالنقر المزدوج على QCA.py. ملاحظة: التطبيق قد يستغرق عدة دقائق لبدء. يحتوي الملف "QCA.py" على هيكل البرنامج الذي يستدعي الملفات ".m" لتشغيل خوارزمية الفعلية.</li>
	<li>اتبع الخطوات الموضحة في البرنامج.<ol>
<li>إدخال نوع ملحق ملفات الصور التي تسبقه فترة ومفصولة بفواصل منقوطة (ex. ". معرض طرابلس؛. jpeg ") ثم اضغط على الزر Enter .</li>
		<li>اختر الدليل الذي توجد ملفات الصور بالنقر فوق الزر تحديد دليل تحديد المجلد الذي يحتوي على الصور.</li>
		<li>إنشاء قائمة ملفات الصور في الدليل عن طريق النقر فوق الزر إنشاء قائمة الصور . سيتم سرد الصور في مربع النص إلى اليمين. مراجعة والتأكد من القائمة دقيقة وكاملة.</li>
		<li>حدد صورة عشوائية من القائمة لاستخدامها كمعاينة قبل النقر فوق الزر تحديد صورة عشوائية . ملاحظة: إذا كانت الصورة غير قادر على فتح بسبب "خطأ وضع صورة غير صحيحة"، الخوارزمية سوف لا تزال تعمل بشكل صحيح على الرغم من عدم عرض الصورة. بعد خطوة 4.2.7، لا يزال سيتم عرض صورة الاختبار.</li>
		<li>مجهر الإدخال الهدف و binning الإعدادات. إذا لم تتطابق المجهر يستخدم الإعدادات الافتراضية، حدد "مخصص بكسل تحويل '' والمدخلات بكسل-إلى-أم التحويل لملفات الصور. وبمجرد اختيار، انقر فوق الزر حساب التحويل وضمان التحويل بشكل صحيح وفقا لمربع النص على الحق. ملاحظة: الصور التمثيلية هو مبين في الشكل 1 حسبت مع 40 x التكبير و 2 × 2 binning المحددة.</li>
		<li>إدخال معلمات خوارزمية للكشف عن الدائرة.<ol>
<li>إدخال دائرة نصف قطرها الحد الأدنى والحد الأقصى يمكن كشفها للكشف عن كبسولة الخارجي كإدخالات Min و Max كبسولة Radius. مجموعة أصغر تسمح نتائج أكثر دقة.</li>
			<li>إدخال دائرة نصف قطرها الحد الأدنى والحد الأقصى يمكن كشفها للكشف عن خلايا الجسم كإدخالات دقيقة ونصف قطر جسم الخلية ماكس. ملاحظة: كل أربعة من هذه الإدخالات يجب أن تكون الأرقام تمثل قيمها كل بكسل، وفقا لمصدر الصور.</li>
			<li>حرك مربعات التمرير الكبسولة وحساسية خلايا الجسم لضبط عتبة حساسية الخوارزمية. حساسية منخفضة ستكون صارمة والحد من الكشف عن دائرة إيجابية كاذبة، ولكن يمكن أيضا الكشف عن الدوائر الحقيقية أقل. على العكس من ذلك، ستزيد من معدل اكتشاف حساسية عالية لكن قد ينتج أيضا عن دوائر إيجابية كاذبة. ملاحظة: تم الحصول على النتائج الممثلة مع الحد الأدنى من دائرة نصف قطرها كبسولة من 7، الحد الأقصى من دائرة نصف قطرها كبسولة من 45، نصف قطر الجسم الحد الأدنى من 4، الجسم أقصى دائرة نصف قطرها 30، حساسية كبسولة من 87، وحساسية الجسم من 87.</li>
		</ol>
</li>
		<li>اختبار المعلمات على الصورة تم اختيارها عشوائياً بواسطة النقر فوق الزر تشغيل الاختبار . سيتم عرض النتائج في مركز العليا للبرنامج، استبدال الصورة الأصلية. إذا كانت النتائج تبدو دقيقة، من المستحسن لتحديد صورة عشوائية إضافية لمحاولة كذلك لكفالة المعلمات المحددة تناسب كافة الصور المحددة.<ol>
<li>زيادة عدد الهيئات والكشف عن كبسولات وبصريا فحص ما إذا كانت الدوائر التي تظهر لتناسب بشكل صحيح. سيتم عرض العدد الهيئات داخل كبسولات كشف في مربع النص إلى اليمين. وبخلاف ذلك، معالجة معلمات خوارزمية حتى تكون النتائج دقيقة. ملاحظة: دوائر ملونة سميكة فقط للمساعدة في التصور. الدوائر الفعلية التي تم إنشاؤها لقياس منحنى رياضية حسابها بواسطة خوارزمية كليات التقنية العليا.</li>
		</ol>
</li>
		<li>تشغيل خوارزمية الكشف على الدليل بأكمله لملفات الصور بالنقر فوق زر البدء في التحليل . وسيتم تحليل كل صورة، وسيعرض البرنامج "انتهت" في مربع النص إلى اليمين عند كل الصور قد تم تحليلها.</li>
		<li>انقر فوق الزر المباراة وتنظيف . وهذا تتطابق مع الهيئات الخلية المكتشفة على كبسولات المكتشفة يقيمون في، وحساب نصف قطر كبسولة الحقيقية عن طريق طرح مجموعة من كبسولة. ملاحظة: إذا كان يتم استخدام الخوارزمية للكشف عن الأسفار أو حالة أخرى فيها دائرة واحد فقط الكشف عن هذه الخطوة غير ضرورية. بدلاً من ذلك انقر فوق سحب الهيئات فقط أو الزر سحب كبسولات فقط لجمع البيانات للأزرق فقط أو فقط دوائر خضراء، على التوالي. من المهم ملاحظة أن إلا إذا كان يتم استرداد البيانات كبسولة دائرة نصف قطرها سوف تشير إلى مجموع نصف قطر الخلية كما لا يمكن طرح نصف قطر جسم الخلية.</li>
		<li>تحديد موقع البيانات المنجزة في الملف "CleanedOuput.csv" في الدليل الصورة. إلا إذا تم اختيار قطعة واحدة من البيانات، سيتم تسمية الملف "CleanedBodies.csv" أو "CleanedCapsules.csv".</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Park, B. J., Wannemuehler, K. A., Marston, B. J., Govender, N., Pappas, P. G., Chiller, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+the+current+global+burden+of+cryptococcal+meningitis+among+persons+living+with+HIV/AIDS.">Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS.</a> AIDS. 23 (4), 525-530 (2009).</li><li>Kwon-Chung, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+and+Cryptococcus+gattii,+the+etiologic+agents+of+cryptococcosis.">Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii, the etiologic agents of cryptococcosis.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (7), 019760 (2014).</li><li>Granger, D. L., Perfect, J. R., Durack, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virulence+of+Cryptococcus+neoformans.+Regulation+of+capsule+synthesis+by+carbon+dioxide.">Virulence of Cryptococcus neoformans. Regulation of capsule synthesis by carbon dioxide.</a> J Clin Invest. 76 (2), 508 (1985).</li><li>Rumbaugh, J., Pool, A., Gainey, L., Forrester, K., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Cryptococcal+Capsule+in+Pathogenesis+of+Cryptococcal+Meningitis.">The Role of Cryptococcal Capsule in Pathogenesis of Cryptococcal Meningitis.</a> Neurology. 80 (7), 007 (2013).</li><li>Bojarczuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+Intracellular+Proliferation+and+Capsule+Size+Determines+Early+Macrophage+Control+of+Infection.">Cryptococcus neoformans Intracellular Proliferation and Capsule Size Determines Early Macrophage Control of Infection.</a> Sci Rep. 6, (2016).</li><li>Robertson, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+Ex+Vivo+Capsule+Size+Is+Associated+With+Intracranial+Pressure+and+Host+Immune+Response+in+HIV-associated+Cryptococcal+Meningitis.">Cryptococcus neoformans Ex Vivo Capsule Size Is Associated With Intracranial Pressure and Host Immune Response in HIV-associated Cryptococcal Meningitis.</a> J Infect Dis. 209 (1), 74-82 (2014).</li><li>Araujo, G. d. e. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capsules+from+Pathogenic+and+Non-Pathogenic+Cryptococcus+spp.+Manifest+Significant+Differences+in+Structure+and+Ability+to+Protect+against+Phagocytic+Cells.">Capsules from Pathogenic and Non-Pathogenic Cryptococcus spp. Manifest Significant Differences in Structure and Ability to Protect against Phagocytic Cells.</a> PLoS One. 7 (1), 29561 (2012).</li><li>Garc&#237;a-Rivera, J., Chang, Y. C., Kwon-Chung, K. J., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+CAP59+(or+Cap59p)+Is+Involved+in+the+Extracellular+Trafficking+of+Capsular+Glucuronoxylomannan.">Cryptococcus neoformans CAP59 (or Cap59p) Is Involved in the Extracellular Trafficking of Capsular Glucuronoxylomannan.</a> Eukaryot Cell. 3 (2), 385-392 (2004).</li><li>Guimar&#227;es, A. J., Frases, S., Cordero, R. J. B., Nimrichter, L., Casadevall, A., Nosanchuk, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+responds+to+mannitol+by+increasing+capsule+size+in+vitro+and+in+vivo:+Mannitol+impacts+the+structure+of+C.+neoformans+capsule.">Cryptococcus neoformans responds to mannitol by increasing capsule size in vitro and in vivo: Mannitol impacts the structure of C. neoformans capsule.</a> Cell Microbiol. 12 (6), 740-753 (2010).</li><li>Zaragoza, O., Fries, B. C., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Capsule+Growth+in+Cryptococcus+neoformans+by+Mammalian+Serum+and+CO2.">Induction of Capsule Growth in Cryptococcus neoformans by Mammalian Serum and CO2.</a> Infect and Immun. 71 (11), 6155-6164 (2003).</li><li>Rossi, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Resistance+to+Fluconazole+on+Virulence+and+Morphological+Aspects+of+Cryptococcus+neoformans+and+Cryptococcus+gattii+Isolates.">Impact of Resistance to Fluconazole on Virulence and Morphological Aspects of Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii Isolates.</a> Front Microbiol. 7, (2016).</li></ol>

الكتاب قد لا يوجد تضارب في الكشف عن.

الخطوات الحاسمة لهذا الأسلوب هي إعداد الشريحة الحبر الهند وحيازة صور المجهر. حين تم بنجاح اختبار الخوارزمية مع مجموعة متنوعة من تقنيات الشريحة والصورة هو وصف البروتوكول الموصى بها في هذه المخطوطة. تم الكشف عن الكبسولة السكاريد استناداً إلى استبعاد جزيئات الحبر الهند من المجال الكبسولة كما هذه الجزيئات كبيرة جداً لاختراق الشبكة فيبريل السكاريد. نتائج الاستبعاد الحبر الهند في دائرة مشرقة على رأس خلفية داكنة. الخوارزمية الكشف عن الدوائر يستند جيدا كيف أنها على النقيض مع خلفيتهم. وهكذا، سيؤدي إلى وصمة حبر الهند ثقيلة أعلى النقيض بين كبسولة السكاريد والخلفية، زيادة إشارة إلى نسبة الضوضاء، وتحسين نوعية النتائج. على العكس من ذلك، يتم الكشف عن خلايا الجسم كدائرة الظلام على رأس خلفية ساطعة. سيتم تغيير الجسم خلية المظهر استناداً إلى المستوى البؤري الذي يتم تعيين المجهر، الظهور كما منتشر غراي دائرة في الأعلى أو أسفل الخلية كعصابة الظلام مكثف في المركز. لنفس الأسباب التي سبق أن ناقشت، ينبغي أن تستخدم المستوى البؤري حيث يظهر نص الخلية كعصابة الظلام، مكثف للحصول على الصور كهذا سيؤدي إلى الكشف عن دائرة الأكثر دقة.
الطريقة التي ذكرت هنا تطورت من خلال العديد من التعديلات وجولات لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها. وكان الخوارزمية المبرمج يتوقعون أن الخلايا لن يكون أصغر من 4 أو أكبر من 60 بكسل استناداً إلى المجهر الذي تم استخدامه في البداية. لتوسيع نطاق تطبيق هذه الخوارزمية لتكبير مختلفة وأحجام الخلايا بدلاً من ذلك استعيض عن هذه الحدود حقول الإدخال المستخدم المبينة في البروتوكول. يمكن إدخال المستخدمين الآن معلمات محددة لكل تجربة لأقصى قدر من الدقة. إذا كان يتم تطبيق هذه الخوارزمية لحالة خارج القياس بين كبسولة من المستحسن لأول إعداد سلسلة من نطاق إيجاد الظروف لتحديد كيف ينبغي إنشاؤها العينات وتصويرها.
تحديد أهم من هذا الأسلوب أنه يهدف بتطبيق معين في الاعتبار، إلا وهي قياس كبسولة الفطري. في حين أنه يمكن تعديل سهولة لتناسب تطبيقات إضافية، هذا السيناريو فقط تنطبق مباشرة على البروتوكول القياس كبسولة المبينة أعلاه. ومع ذلك، يصف هذا القيد أيضا أهمية هذا الأسلوب فيما يتعلق بهذا المجال والأساليب القائمة. بالإضافة إلى ذلك، مهدها خلايا الخميرة يمكن أن تشكل مشكلة بالنسبة للمحققين الذين يرغبون في قياس الأحجام الخلية الأصل فقط. هذه الخوارزمية قادرة على اكتشاف براعم كخلايا فريدة من نوعها (S2A الشكل). أولاً، وهذا يمكن أن يكون مشكلة إذا كان المحقق في الحالة التي يودون إزالة برعم القياسات، أو إزالة كل الخلايا إذا كان لا يمكن أن يحدد الذي كشف عن دائرة المهد، والتي هي الأصل. ثانيا، وهذا يمكن أن يسبب مشكلة أخرى إذا تم الكشف عن البرعم كهيئة الخلية لا تزال ضمن حدود الكبسولة الأبوية (S2B الشكل) الذي سوف قياس الحالة الخوارزمية برعم إشارة إلى الكبسولة الأبوية. في هذا المثال سوف تحسب كل خلية مرتين لكل جسم الخلية موجود داخل كبسولات اثنين. أي من هذه المشاكل يمكن معالجتها بسهولة بمجرد الانتهاء من البروتوكول. مجموعة البيانات النهائية سوف تظهر كجدول بيانات التي يكتشف فيها كل فرد يسمى خلية طبقاً لملف الصورة من جاء، وعلامة x و y إحداثيات من جسم الخلية (S3 الرقم). يمكن ببساطة العثور على المحققين واستبعاد البيانات التي تطابق في مهدها. على الرغم من الحجم الكبسولة يتم هامة ودراستها بشكل كبير عامل فوعة الميدان بين لم تنشئ البروتوكولات القياسية لاقتناء القياس أو صورة كبسولة. تم تصميم هذه التقنية لملء هذه الأدوار بطريقة دقيقة ومريحة متاحة بحرية للمختبرات مع الحد الأدنى من المتطلبات الأساسية.
التطبيقات المستقبلية لهذه التقنية إلى حد كبير لتطبيقه على تجارب أخرى. أي صورة على أساس الكشف أو ينبغي أن يكون قياس الأجسام الدائرية أناليزابلي عن طريق هذه الخوارزمية. يمكن تحليل الصور مجهر فلوري بتطبيق الخوارزمية على القنوات الفردية الليزر. عد مستعمرة بكتيرية يمكن أن يتحقق، ومع تعديل إضافية يمكن أن تميز بين الصحفيين اللبن. يمكن أيضا تقييم الخميرة مستعمرة فحوصات النمو باستخدام هذه الخوارزمية لتقدير حجم المنطقة مستعمرة.

هو المرسلة بين خميرة المسببة للأمراض العثور على أوبيكويتوسلي من جميع أنحاء العالم التي ترتبط مع الأمراض البشرية أساسا في إيمونوسوبريسيد السكان. وتستأثر المرسلة جيم- أبرزها سببا هاما من مجموع الوفيات السنوية في أفريقيا جنوب الصحراء بسبب الأمراض المعدية1. المظاهر السريرية الرئيسية الإصابة الفطري هو التهاب السحايا والدماغ، الذي يتبع غزو للجهاز العصبي المركزي بالنقل في الضامة المصابة (طريقة حصان طروادة) أو مباشرة من عبور حاجز الدم في الدماغ. جيم-المرسلة وتعرب عن عدة عوامل الفوعة بما في ذلك القدرة على إجراء نسخ متماثل في درجة حرارة جسم الإنسان والنشاط آريس، شكل الميلانين وتشكيل السكاريد كبسولة2. كبسولة السكاريد يتكون من تكرار جلوكورونوكسيلومانان والبوليمرات جلوكورونوكسيلومانانجالاكتان والمهام كحاجز وقائي ضد عوامل الإجهاد البيئي و الاستجابات المناعية المضيف2.
على الرغم من أن حجم الحجم الكبسولة السكاريد الفطري لم يكن دائماً مقترنة بضراوة، هناك أدلة على أنها عامل في نشوء المرض2،3،،من45، 6،7. الحجم الكبسولة يرتبط ب أمراض التهاب السحايا6ويمكن أن تؤثر على بلعم القدرة على التحكم في العدوى بين 5، ويمكن أن يؤدي فقدان الفوعة إذا تغيب8. ومن ثم، قياسات الحجم الكبسولة المشتركة في البحوث الفطري، لكن هناك لا فيلدويدي القياسية لطريقة قياس الكبسولة.
في الوقت الراهن، المرسلة C. السكاريد كبسولة قياس يستند إلى دليل قياسات الصور مجهرية، وتختلف أساليب الشراء الصورة والقياس الدقيق عبر المختبرات9،10، 11. مصدر قلق فوري لهذا الأسلوب هو أن بعض الدراسات تتطلب الحصول على آلاف قياسات الفردية، مما يجعل من الصعب الحفاظ على الدقة والموثوقية. وعلاوة على ذلك، حتى عندما يتم نشر النتائج، هناك غالباً عدم كفاية وصف طريقة القياس. العديد من المنشورات لا تفسر كيف تم الحصول على هذه القياسات، واستخدمت ما هو المستوى البؤري، وكيفية تحديد الحد الأدنى لتحديد الكبسولة، سواء كانوا نصف القطر أو القطر، وما إذا كانت تستخدم في قياس واحد أو بلغ عدة، أو غيرها التفاصيل. بعض المنشورات الدولة الوحيدة على الأسلوب كالبرنامج الذي المستخدم، مثلاً، "أدوبي فوتوشوب CS3 استخدمت لقياس الخلايا"11. وهذا الافتقار إلى التوحيد القياسي، والإبلاغ عن تفاصيل يمكن جعل إمكانية تكرار نتائج صعبة إذا لم يكن من المستحيل. شريحة الاختلافات في البصر البشري، وسطوع الكمبيوتر، إعدادات المجهر، الإضاءة، وعوامل أخرى يمكن أن تختلف ليس فقط بين الأفراد ولكن بين العينات، بينما العمليات الحسابية المستندة إلى نسب لقيم الكثافة بكسل سوف تظل ثابتة و المعمول بها بين العينات. تم إنشاء هذا الأسلوب في سياق توفير تقنية موحدة ودقيقة وسريعة وبسيطة لقياس الأحجام كبسولات لحقل الذي كان هناك لا شيء قبل.
كما ذكر آنفا، الخوارزمية سلاسل تلال تشيتاجونج منذ أمد طويل، وقد كتب بالكشف تلقائياً عن دوائر البرامج النصية قبل. ويحسن هذا الأسلوب في هذين المجالين حيث سيقع مخطوطات أخرى قصيرة. أولاً، مجرد الكشف عن الدوائر لا يكفي، لأنه يجب الكشف عن دائرتين متميزة مع خلايا الفطري بالنسبة لبعضها البعض. هذا الأسلوب يكتشف الهيئات الخلية داخل كبسولات على وجه التحديد، يميز بين الاثنين، ويتولى إجراء العمليات الحسابية فقط على أزواج كبسولة الهيئة ذات الصلة. ثانيا، حتى عند اتباع نفس البروتوكول، والمحققين مختلفة سوف ينتهي مع مختلف الحصول على الصور. السماح بمراقبة كل معلمة خوارزمية المحقق، يمكن تعديل هذه الأداة لتتناسب مع مجموعة واسعة من طرق اكتساب. ليس هناك حاجة لنطاق موحدة، والهدف، والتصفية، وهكذا.
يمكن تطبيق هذا الأسلوب يسهل على أي الحالة التي يحتاج المحقق إلى الكشف عن الدوائر داخل صورة هذا التباين مع خلفيتهم. كل الدوائر أخف وزنا وأكثر قتامة مما يمكن الكشف عن خلفيتهم، عد، وتقاس باستخدام هذا الأسلوب.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:875px;" width="875">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:213px;">India Ink</td>
			<td style="width:99px;">Becton, Dickinson and Co.</td>
			<td style="width:119px;">261194</td>
			<td style="width:444px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:213px;">Fisherbrand Superfrost Microscope Slides</td>
			<td style="width:99px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-550-143</td>
			<td>25x75x1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:213px;">Fisherfinest Premium Cover Glass</td>
			<td style="width:99px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-548-B</td>
			<td>22x22-1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:213px;">Sally Hansen HardasNails Xtreme Wear Nail Polish</td>
			<td style="width:99px;">Sally Hansen</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>109 invisible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">SAB Media</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Cryptotoccus neoformans</td>
			<td style="width:99px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">208821</td>
			<td>H99 strain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Olympus AX70 Microscope</td>
			<td style="width:99px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">AX70TRF</td>
			<td>Discontinued ; Bright Field Microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Qimaging Retiga 1300</td>
			<td style="width:99px;">Qimaging</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Discontinued ; Camera Microscope Attachment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">MATLAB</td>
			<td style="width:99px;">MathWorks</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Most recent version recommended</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Python Programming Language</td>
			<td style="width:99px;">Python</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Version 2 necessary ; 2.7 recommended</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Microsoft Excel</td>
			<td style="width:99px;">Microsoft</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Most recent version recommended</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:213px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P3813</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated measurement of cryptococcal species polysaccharide capsule and cell body

والغرض من هذا الأسلوب لتوفير عملية متسقة ودقيقة، ويمكن التحكم فيها لعدد كبير من القياسات كبسولة السكاريد.
أولاً، يتم إنشاء صورة عتبة استناداً إلى قيم الكثافة حساب فريد لكل صورة. ثم، يتم الكشف عن الدوائر استناداً إلى التباين بين الكائن والخلفية باستخدام خوارزمية التحويل هوغ دائرة (CHT) الراسخة. وأخيراً، تتم مطابقة كبسولات الخلية المكتشفة والهيئات وفقا لإحداثيات مركز وحجم دائرة نصف قطرها، ويتم تصدير البيانات إلى المستخدم في جدول بيانات يمكن التحكم فيها.
مزايا هذه التقنية بسيطة ولكنها هامة. أولاً، لأنه يتم تنفيذ هذه العمليات الحسابية خوارزمية بدلاً من إنسان زيادة الدقة والموثوقية. لم يكن هناك أي انخفاض في دقة أو موثوقية بغض النظر عن كم عدد العينات ويتم تحليل. ثانيا، هذا النهج يضع إجراءات تشغيل موحدة محتملة للحقل بين بدلاً من الوضع الراهن حيث يختلف القياس كبسولة من مختبر. ثالثا، نظراً لأن قياسات كبسولة اليدوية بطيئة ورتيبة، يسمح أتمتة القياسات السريعة على عدد كبير من خلايا الخميرة الذي بدوره يسهل تحليل البيانات عالية الإنتاجية وإحصاءات قوية على نحو متزايد.
تأتي القيود الرئيسية لهذا الأسلوب من كيفية وظائف الخوارزمية. أولاً، سوف تولد الخوارزمية الدوائر. بينما بين الخلايا وعلى كبسولات تأخذ على مورفولوجيا دائرية، سيكون من صعوبة في تطبيق هذا الأسلوب للكشف عن كائن غير دائرية. ثانيا، بسبب كيفية الكشف عن الدوائر يمكن الكشف عن الخوارزمية سلاسل تلال تشيتاجونج هائلة الدوائر الزائفة استناداً إلى الحواف الخارجية لعدة دوائر متفاوت المسافات. ومع ذلك، أي الهيئات الخلية محرفة اشتعلت داخل دائرة الزائفة يمكن بسهولة الكشف عن وإزالتها من مجموعات البيانات الناتجة.
المقصود من هذا الأسلوب لقياس كبسولات السكاريد دائرية بين الأنواع استناداً إلى الحبر الهند ميدان مشرق المجهري؛ على الرغم من أنه يمكن أن تطبق على أساس التباين الأخرى قياسات كائن دائري.

يتم أولاً الحصول على الصور بالفحص المجهري للحبر الهند الشرائح باستخدام مجهر حقل مشرق مقترنة بكاميرا (الشكل 1أ). من المهم أن تكون الخلايا المنفصلة وفي كثافة منخفضة بما فيه الكفاية لا باكتساح ميدان عرض، كذلك فيما يتعلق باستخدام وصمة عار ما يكفي لخلق تباين بين الخلايا والخلفية. وكما ورد في البروتوكول، ستختلف العدد الدقيق للخلايا لصورة مثلى عينة ومجهر والهدف المستخدمة. الجوانب الهامة لضمان الخلايا غير متفاوت المسافات أو متداخلة، وأن الطائرتين تنسيق الخلية لا تختلف اختلافاً كبيرا، وأنه لا يوجد كبير الهند الحبر وصمة عار مرئية بوضوح في الخلفية (25 في المائة على الأقل من الحقل). تسمح هذه الاتجاهات الخوارزمية لتحديد عتبة فريدة من نوعها لكل صورة بأخذ قيمة بكسل متوسط الكثافة وأضاف الانحراف المعياري. يعتبر أي بكسل مع قيمة كثافة أعلى من عتبة قال أبيض وأي مع قيمة كثافة أقل يعتبر أسود. الصورة الناتجة يسمح تمييز واضحة ونقية من حيث ينتهي الكبسولة (الشكل 1ب). الخوارزمية ثم دائرة تباين أبيض على أسود قوية تعتمد على كشف للكبسولة والصورة الأصلية توفر دائرة أبيض على أسود قوية للأجهزة المحمولة. يتم إنشاء مرئيات ممثل من الدوائر تم الكشف عنها كجزء من البرنامج (الشكل 1ج). وهذا يسمح للمستخدم لتحليل من خلال معالجة الصور بسرعة وضمان ظهور النتائج دقيقة.
من الضروري أن يتبع البروتوكول المحدد الحصول على صور أفضل. عادة ما يؤدي الصور دون المستوى الأمثل من عدم التناقض بين الكبسولة والحبر (الشكل 2أ). معلمات التباين واقتناء الأمثل يختلف استناداً إلى عينة، والتجربة، وكاميرا ومجهر نماذج، إلخ. صورة مثلى هي واحدة حيث يتم فصل خلايا الخميرة إذا كان ذلك ممكناً، حيث الحافة الخارجية للكبسولة على النقيض الواضح لوصمة عار الحبر الهند، وحيث يتركز جسم الخلية تظهر كعصابة الظلام الذي يتناقض بشدة مع خلفيتها. إذا كانت الخلايا كثيرة جداً في مجال الرؤية أو إذا كانت وصمة عار خفيفة جداً، سيتم تجميع قيم كثافة بكسل والبرنامج لن يكون قادراً على تحديد عتبة قادرة على توضيح الحجم الكبسولة (الشكل 2ب). عندما تستخدم الصور دون المستوى الأمثل البرنامج يمكن الكشف عن دوائر من أحجام غير صحيحة لا تكون قادرة على الكشف عن أي دوائر أو الكشف عن عدة دوائر الزائفة استناداً إلى النتائج الملموسة في الصورة عتبة (الشكل 2-ج).
الكشف عن الأجهزة المحمولة يطرح مشكلة مماثلة في ذلك يجب أن تصور الجسم خلية كقوى دائرة سوداء على خلفية بيضاء الكبسولة. وتعالج هذه المشكلة في البروتوكول عندما تصف المستوى البؤري المطلوب للحصول على الصور. أفضل تنسيق لاستخدام الطائرة هو واحد التي يظهر فيها الجسم خلية كعصابة الظلام، مركزة (الشكل 3أ). هذا المستوى البؤري مقبولة كمعيار لأنه يركز بشكل صحيح في الخلايا. وهذا ما أكده تصور جدار الخلية مع أوفيتيكس، وصمة عار كيتين (الشكل 3ب). وصمة عار ويبين بوضوح هش، ركز أوفيتيكس جدار الخلية مع إشارة ضعيفة في الوسط (حيث العلوي والسفلي من جسم الخلية سوف تكون الملون، خارج التركيز).
في تطوير هذا الأسلوب من المهم أيضا التأكد من أن هذه الخوارزمية يمكن تحديد دقة القياسات الكبسولة وجسم الخلية. بينما الدوائر الممثلة في الأرقام السابقة واعدة، تم مقارنة القياسات الفعلية بين الكمبيوتر والقياسات البشرية. عندما يتم اتباع البروتوكول بدقة وهي الحصول على صور أفضل، الخوارزمية دقيقة وموثوق بها (الشكل 4أ). ومع ذلك، إذا كان يتبع البروتوكول بشكل غير صحيح، ويتم الحصول على الصور دون المستوى الأمثل بسبب تلطيخ الفقراء، واكتظاظ السجون، أو معلمات أخرى سبق ذكرها، الخوارزمية يفقد الدقة ولا يمكن تلخيص القياسات البشرية (الشكل 4ب ). وبهذا الأسلوب وضعت أصلاً لشخص معين (البلاغ الأول)، طلب من شخص آخر لاستخدامها لتحديد إذا كانت الاختلافات بين أنماط تلطيخ وقياس سيؤثر على الدقة على الرغم من البروتوكول التالي. وأظهرت النتائج أن هذا الأسلوب لا ينطبق على نطاق واسع طالما كان يتبع البروتوكول كتعليمات (الشكل 4ج). وبالمثل، يمكن استخدام هذا الأسلوب مع أي مجهر قادرة على الحصول على مرحلة التباين الصور من الشرائح الحبر الهند مستعدة. لضمان لا يزال الخوارزمية دقيقة مع سائر الأجهزة مجهر وتكررت هذه التجربة بالثلث المحقق باستخدام مجهر حقل مشرق مختلفة مقترنة بكاميرا ومقارنة مع أقطار كبسولة المكتشفة مع كبسولة المقاسة يدوياً أقطار. ولوحظ لا يوجد فرق كبير بين الكمبيوتر والقياسات البشرية (الشكل 4د).
وأخيراً، تم استكشاف التطبيقات المستقبلية لهذه الخوارزمية في سياق تلطيخ الأسفار. منذ تصوير الأسفار تزال تعتمد على إشارة إلى نسب الضوضاء من قيم بكسل الكثافة ينبغي أن تكون الخوارزمية سهولة المنطبقة على الصور fluorescence طالما وصمة التعميم في الطبيعة. وقد تأكد هذا التطبيق عندما الخوارزمية كانت قادرة على كشف بنجاح أوفيتيكس الملون الهيئات الخلية من الصور تم وصفه مسبقاً (الشكل 5أ، 5). المستخدمين يجب أن تكون حذراً لتحسين معلمات خوارزمية لتجربتهم، وينبغي وضع بروتوكولات موحدة في المستقبل لأي طلبات جديدة.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56957/56957fig1.jpg"> الشكل 1 : نتائج تمثيلية للصورة التي تم الحصول عليها على النحو الأمثل. ألف الصورة الأولية المكتسبة بالفحص المجهري الحقل مشرق شريحة الحبر الهند. ب الصورة الثنائية التي تم إنشاؤها باستخدام عتبة محسوبة من كثافة بكسل متوسط القيمة المضافة للانحراف المعياري. وتعتبر كافة قيم أعلى من هذا الحد الأبيض وتعتبر جميع أدناه الأسود. جيم تصور كبسولات (الأخضر) وخلية الهيئات (أزرق) الكشف عنها بواسطة الخوارزمية. تم الحصول على جميع الصور في 40 x التكبير مع binning 2 × 2. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56957/56957fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56957/56957fig2.jpg"> الشكل 2 : نتائج الممثل صورة أمثل الفرعية التي تم الحصول عليها. ألف الشريحة الحبر الهند الأولية المكتسبة عن طريق مجهر الحقل مشرق. التفاوت وعدم كفاية تلطيخ النتائج في خلفية ساطعة لا سيما مع التدرجات من الكثافة. ب ثنائية الصورة الناتجة، التي لا يمكن تمييزها الواضح كبسولات سبب إشارة خلفية عالية. جيم كبسولات عدة لا يمكن اكتشافها. تم الحصول على جميع الصور في 40 x التكبير مع binning 2 × 2. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56957/56957fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56957/56957fig3.jpg"> الشكل 3: كشف خلية الهيئات. أ حقل مشرقة صورة كبسولة تركزت في المستوى البؤري المفضل. باء أوفيتيكس fluorescence صورة الجسم خلية في المستوى البؤري المفضل. تم الحصول على الصور في 100 x التكبير مع binning 2 × 2. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56957/56957fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56957/56957fig4.jpg"> الشكل 4: تحليلات إجراء مقارنات للنتائج خوارزمية (أسود) والإنسان (رمادي). ألف عندما يتم إعداد الشرائح وفقا للبروتوكول وهي الحصول على صور الأمثل هناك أي اختلاف ملحوظ بين القياسات. ب إذا لم يتبع البروتوكول الخوارزمية لا يمكن بدقة تحديد وقياس كبسولات. هنا تحديداً الخلفية لم يكن متسقا، وهناك لم يكن واضحا التباين بين الخلفية وكبسولات. ويلاحظ وجود تباينات كبيرة حسابها عن طريق اختبار t ك * لقيم P < 0.05. جيم طلب محقق مستقل يتبع البروتوكول وقارن تحليلاتها مع الخوارزمية. هو الحفاظ على موثوقية عبر المراقبين طالما أن الصور يتم الحصول عليها بشكل صحيح. د محقق مستقل ثانية مع مجهر ثانية استخدمت لتأكيد الخوارزمية يحتفظ بدقة عبر الأفراد والأجهزة. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56957/56957fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56957/56957fig5.jpg"> الشكل 5 : إمكانية تطبيق الخوارزمية بديل: تحديد وقياس مجهرية fluorescence. كانت الهيئات الخلية الملون وتصويرها مع أوفيتيكس، ثم حددت بواسطة خوارزمية. تمتد دائرة تم الكشف عنها في الماضي ما يسمى كجدار الخلية لأنه يستند إلى الكشف عن إشارة الأسفار. خوارزمية الكشف يمكن تكييفها للتعرف على وجه التحديد تراكم ألمع إشارة (جدار الخلية) عن طريق تعديل العتبة المستخدمة لتوليد صورة ثنائية الأولى ممثلة في الأرقام 1B و 2B. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56957/56957fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Supplemental Figure 1" src="/files/ftp_upload/56957/56957supfig1.jpg"> تكميلية الشكل 1: لقطة تمثيلية من تطبيق قيد التشغيل في بيئة ويندوز. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56957/56957supfig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Supplemental Figure 2" src="/files/ftp_upload/56957/56957supfig2.jpg"> تكميلية الشكل 2: تمثيلات للكشف عن مهدها الخميرة الخلايا. يمثل الشريط مقياس 10 ميكرون. أ حساب كل من خلية أصل وبرعم كخلايا منفصلة داخل الكبسولة الخاصة بهم. حساب كل من الخلية الأصل أ ب وبرعم مرتين، مجرد كبسولة ومرة واحدة للكبسولة خلية أخرى، أسفر عن أربع خلايا مجموع اكتشاف من أحد الوالدين وبرعم واحد. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56957/56957supfig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Supplemental Figure 3" src="/files/ftp_upload/56957/56957supfig3.jpg"> تكميلية الشكل 3: تمثيل البيانات النهائية المقدمة بعد الكشف عن الخلية والقياس. يشير ملف الصورة إلى اسم للصورة الأصلية. مجموع نصف قطر يشير إلى دائرة نصف قطرها دوائر خضراء الممثل والكبسولة وجسم الخلية جنبا إلى جنب. كبسولة x و y كبسولة تشير إلى إحداثيات الكبسولة التي ينطبق عليها هذه البيانات إلى. نصف قطر الجسم يشير إلى دائرة نصف قطرها الدوائر الزرقاء الممثل. دائرة نصف قطرها كبسولة يشير إلى نصف القطر الإجمالي ناقص نصف قطر الجسم، الناتجة في دائرة نصف قطرها من مجرد الكبسولة. ستكون هذه القيم في ميكرون طالما أن المستخدم وشملت نسبة تحويل بكسل إلى ميكرون في خطوة 3.2.5. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56957/56957supfig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body at JoVE.com

Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

القياس الآلي كبسولة السكاريد الأنواع الفطري وجسم الخلية

ويصف هذا الأسلوب معالج صورة دفعي الآلي المصممة لقياس إنصاف أقطار الجسم وكبسولة السكاريد. بينما في البداية مصممة لقياسات المرسلة بين كبسولة يمكن أيضا تطبيق معالج الصور الآلي الأخرى الكشف عن التباين على أساس من الكائنات دائرية.

The purpose of this technique is to provide a consistent, accurate, and manageable process for large numbers of polysaccharide capsule measurements.
...

automated-measurement-cryptococcal-species-polysaccharide-capsule

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

7.2K Views.  Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health. ويصف هذا الأسلوب معالج صورة دفعي الآلي المصممة لقياس إنصاف أقطار الجسم وكبسولة السكاريد. بينما في البداية مصممة لقياسات المرسلة بين كبسولة يمكن أيضا تطبيق معالج الصور الآلي الأخرى الكشف عن التباين على أساس من الكائنات دائرية.

Video: Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

تعيش خلية من التصوير<emالعصوية الرقيقة> و العقدية الرئوية الآلي باستخدام الميكروسكوب مرور الزمن

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Measurement of &#947;HV68 Infection in Mice

&gamma;-Herpesviruses (&gamma;-HVs) are notable for their ability to establish latent infections of lymphoid cells1. The narrow host range of human &gamma;-HVs, such as EBV and KSHV, has severely hindered detailed pathogenic studies. Murine &gamma;-herpesvirus 68 (&gamma;HV68) shares extensive genetic and biological similarities with human &gamma;-HVs and is a natural pathogen of murid rodents2. As such, evaluation of &gamma;HV68 infection of mice inbred strains at different stages of viral infection provides an important model for understanding viral lifecycle and pathogenesis during &gamma;-HVs infection.
Upon intranasal inoculation, &gamma;HV68 infection results in acute viremia in the lung that is later resolved into a latent infection of splenocytes and other cells, which may be reactivated throughout the life of the host3,4. In this protocol, we will describe how to use the plaque assay to assess infectious virus titer in the lung homogenates on Vero cell monolayers at the early stage (5 - 7 days) of post-intranasal infection (dpi). While acute infection is largely cleared 2 - 3 weeks postinfection, a latent infection of &gamma;HV68 is established around 14 dpi and maintained later on in the spleen of the mice. Latent infection usually affects a very small population of cells in the infected tissues, whereby the virus stays dormant and shuts off most of its gene expression. Latently-infected splenocytes spontaneously reactivate virus upon explanting into tissue culture, which can be recapitulated by an infectious center (IC) assay to determine the viral latent load. To further estimate the amount of viral genome copies in the acutely and/or latently infected tissues, quantitative real-time PCR (qPCR) is used for its maximal sensitivity and accuracy. The combined analyses of the results of qPCR and plaque assay, and/or IC assay will reveal the spatiotemporal profiles of viral replication and infectivity in vivo.

&#947;-Herpesviruses (&#947;-HVs) establish life-long persistency in their host. Infection of mice with &#947;-HV68 provides a genetically tractable in vivo model for the characterization of the lifecycle/pathogenesis of &#947;HVs. This protocol describes the detection and quantitation of &#947;HV68 infection at acute and latent stages following infection by plaque-forming, infectious center, and qPCR assays.

قياس γHV68 العدوى في الفئران

&gamma;-Herpesviruses (&gamma;-HVs) are notable for their ability to establish latent infections of lymphoid cells1. The narrow host range of human ...

Automated Cell Enrichment of Cytomegalovirus-specific T cells for Clinical Applications using the Cytokine-capture System

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection occurring after allogeneic hematopoietic stem-cell transplantation. Viral-specific T cells from allogeneic donors, including third party donors, can be propagated ex vivo in compliance with current good manufacturing practice (cGMP), employing repeated rounds of antigen-driven stimulation to selectively propagate desired T cells. The identification and isolation of antigen-specific T cells can also be undertaken based upon the cytokine capture system of T cells that have been activated to secrete gamma-interferon (IFN-&#947;). However, widespread human application of the cytokine capture system (CCS) to help restore immunity has been limited as the production process is time-consuming and requires a skilled operator. The development of a second-generation cell enrichment device such as CliniMACS Prodigy now enables investigators to generate viral-specific T cells using an automated, less labor-intensive system. This device separates magnetically labeled cells from unlabeled cells using magnetic activated cell sorting technology to generate clinical-grade products, is engineered as a closed system and can be accessed and operated on the benchtop. We demonstrate the operation of this new automated cell enrichment device to manufacture CMV pp65-specific T cells obtained from a steady-state apheresis product obtained from a CMV seropositive donor. These isolated T cells can then be directly infused into a patient under institutional and federal regulatory supervision. All the bio-processing steps including removal of red blood cells, stimulation of T cells, separation of antigen-specific T cells, purification, and washing are fully automated. Devices such as this raise the possibility that T cells for human application can be manufactured outside of dedicated good manufacturing practice (GMP) facilities and instead be produced in blood banking facilities where staff can supervise automated protocols to produce multiple products.

The goal of this protocol is to manufacture pathogen-specific clinical-grade T cells using a bench-top, automated, second generation cell enrichment device that incorporates a closed cytokine capture system and does not require dedicated staff or use of a GMP facility. The cytomegalovirus pp65-specific-T cells generated can be directly administered to patients.

الآلي إثراء خلية من الفيروس المضخم للخلايا محددة خلايا T للتطبيقات السريرية باستخدام نظام خلوى التقاط

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection ...

Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. While virus-cell attachment can be measured through the use of virions labeled with biotin, radioactive isotopes, or fluorescent dyes, these approaches typically require high multiplicities of infection (MOI) to enable detection of bound virus. We describe a quantitative (q)RT-PCR-based assay that measures Junin virus strain Candid 1 attachment via quantitation of virion-packaged viral genomic RNA. This assay has several advantages including its extreme sensitivity and ability to measure attachment over a large dynamic range of MOIs without the need to purify or label input virus. Importantly, this approach can be easily tailored for use with other viruses through the use of virus-specific qRT-PCR reagents. Further, this assay can be modified to permit measurement of particle endocytosis and genome uncoating. In conclusion, we describe a simple, yet robust assay for highly sensitive measurement of arenavirus-cell attachment.

The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. We report a quantitative (q)RT-PCR-based assay for ultrasensitive detection and quantitation of arenavirus attachment events.

الفحص حساس للغاية لقياس مرفق الفيروسة الرملية خلية

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal of immunosuppression. The mixed leukocyte reaction (MLR), limiting dilution assays, and trans-vivo delayed-type hypersensitivity (DTH) assay have all been applied to this question, but these methods have limited predictive ability and/or significant practical limitations that reduce their usefulness. Imaging flow cytometry is a technique that combines the multiparametric quantitative powers of flow cytometry with the imaging capabilities of fluorescent microscopy. We recently made use of an imaging flow cytometry approach to define the proportion of recipient T cells capable of forming mature immune synapses with donor antigen-presenting cells (APCs). Using a well-characterized mouse heart transplant model, we have shown that the frequency of in vitro immune synapses among T-APC membrane contact events strongly predicted allograft outcome in rejection, tolerance, and a situation where transplant survival depends on induced regulatory T cells. The frequency of T-APC contacts increased with T cells from mice during acute rejection and decreased with T cells from mice rendered unresponsive to alloantigen. The addition of regulatory T cells to the in vitro system reduced prolonged T-APC contacts. Critically, this effect was also seen with human polyclonally expanded, naturally occurring regulatory T cells, which are known to control the rejection of human tissues in humanized mouse models. Further development of this approach may allow for a deeper characterization of the alloreactive T-cell compartment in transplant recipients. In the future, further development and evaluation of this method using human cells may form the basis for assays used to select patients for immunosuppression minimization, and it can be used to measure the impact of tolerogenic therapies in the clinic.

This paper describes a method for measuring alloreactivity in a mixed population of T cells using imaging flow cytometry.

قياس T خلية Alloreactivity عن طريق التصوير التدفق الخلوي

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular disease (CVD). The structure and function of HDL rather than HDL-C may more accurately predict atherosclerosis. Several HDL protein and lipid compositional changes that impair HDL function occur in inflammatory states such as atherosclerosis. HDL function is usually determined by cell based assays such as cholesterol efflux assay but these assays have numerous drawbacks lack of standardization. Cell-free assays may give more robust measures of HDL function compared to cell-based assays. HDL oxidation impairs HDL function. HDL has a major role in lipid peroxide transport and high amount of lipid peroxides is related to abnormal HDL function. Lipid-probe interactions should be considered when interpreting the results of non-enzymatic fluorescence assays for measuring the lipid oxidative state. This motivated us to develop a cell-free biochemical enzymatic method to assess HDL lipid peroxide content (HDLox) that contributes to HDL dysfunction. This method is based on the enzyme horseradish peroxidase (HRP) and the fluorochrome Amplex Red that can quantify (without cholesterol oxidase) the lipid peroxide content per mg of HDL-C. Here a protocol is describedfor determination of HDL-lipid peroxidation using the fluorochrome reagent. Assay variability can be reduced by strict standardization of experimental conditions. Higher HDLox values are associated with reduced HDL antioxidant function. The readout of this assay is associated with readouts of validated cell-based assays, surrogate measures of cardiovascular disease, systemic inflammation, immune dysfunction, and associated cardiovascular and metabolic risk phenotypes. This technical approach is a robust method to assess HDL function in human disease where systemic inflammation, oxidative stress and oxidized lipids have a key role (such as atherosclerosis).

We describe here a fluorometric cell-free biochemical assay for determination of HDL-lipid peroxidation. This rapid and reproducible assay can be used to determine HDL function in large scale studies and can contribute to our understanding of HDL function in human disease.

الخلية الحرة البيوكيميائية المقايسة الانزيمية فلوروميتريك لقياس الفائق وبيروكسيد في البروتين الدهني العالي الكثافة

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. albicans is its ability to form biofilms, structured communities of cells attached to biotic and abiotic surfaces. C. albicans biofilms can form on host tissues, such as mucosal layers, and on medical devices, such as catheters, pacemakers, dentures, and joint prostheses. Biofilms pose significant clinical challenges because they are highly resistant to physical and chemical perturbations, and can act as reservoirs to seed disseminated infections. Various in vitro assays have been utilized to study C. albicans biofilm formation, such as microtiter plate assays, dry weight measurements, cell viability assays, and confocal scanning laser microscopy. All of these assays are single end-point assays, where biofilm formation is assessed at a specific time point. Here, we describe a protocol to study biofilm formation in real-time using an automated microfluidic device under laminar flow conditions. This method allows for the observation of biofilm formation as the biofilm develops over time, using customizable conditions that mimic those of the host, such as those encountered in vascular catheters. This protocol can be used to assess the biofilm defects of genetic mutants as well as the inhibitory effects of antimicrobial agents on biofilm development in real-time.

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

This protocol describes the use of a customizable automated microfluidic device to visualize biofilm formation in Candida albicans under host physiological conditions.

التصور "تشكيل بيوفيلم" في المبيضات البيض باستخدام جهاز موائع جزيئية الآلي

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

The polysaccharide capsule of Cryptococcus neoformans is the primary virulence factor and one of the most commonly studied aspects of this pathogenic yeast. Capsule size can vary widely between strains, has the ability to grow rapidly when introduced to stressful or low nutrient conditions, and has been positively correlated with strain virulence. For these reasons, the size of the capsule is of great interest to C. neoformans researchers. The growth of the C. neoformans capsule is induced during phenotypic testing to help understand the effects of different treatments on the yeast or size differences between strains. Here we describe one of the standard methods of capsule induction and compare two accepted methods of staining and measuring capsule diameter: (i) India ink, a negative stain, used in conjunction with conventional light microscopy and (ii) co-staining with fluorescent dyes of both the cell wall and capsule followed by confocal microscopy. Finally, we show how measurement of capsule diameter from India ink-stained samples can be automated using computational image analysis.

Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

The polysaccharide capsule is the primary virulence factor in Cryptococcus neoformans, and its size correlates with strain virulence. Capsule diameter measurements are used in phenotypic testing and to gauge therapeutic efficacy. Here a standard method of capsule induction is presented, and two methods of staining and measuring diameter are compared.

المسائل الحجم: قياس "القطر كبسولة" في المرسلة بين

The polysaccharide capsule of Cryptococcus neoformans is the primary virulence factor and one of the most commonly studied aspects of this pathogenic ...

Mouse Body Temperature Measurement Using Infrared Thermometer During Passive Systemic Anaphylaxis and Food Allergy Evaluation

Mouse body temperature measurement is of paramount importance for investigating allergies and anaphylactic symptoms. Rectal probes for temperature readings is common, and they have been proven to be accurate and invaluable in this regard. However, this method of temperature measurement requires the mice to be anesthetized in order to insert the probe without injury to the animal. This limits the ability to observe other phenotypes of the mouse simultaneously. In order to investigate other phenotypes while measuring temperatures, rectal probes are not ideal, and another method is desired. Here, we introduce a noninvasive method of temperature measurement that foregoes the requirement for mouse anesthesia while maintaining equal reliability to rectal probes in measuring body temperature. We use an infrared thermometer that detects body surface temperatures at ranges between 2 and 150 mm. This method of body temperature measurement is successful in reliably replicating temperature change trends during passive system anaphylaxis experiments in mice. We show that body surface temperatures are about 2.0 &#176;C lower than rectal probe measurements, but the degree of temperature drop follows the same trend. Furthermore, we use the same technique to observe mice in a food allergy model to evaluate temperature and activity levels simultaneously.

Here we present a new method to accurately measure body temperature differences in passive systemic anaphylaxis (PSA) and food allergy mouse models using an infrared thermometer. This procedure has been accurately duplicated in previous PSA results.

قياس درجة حرارة الجسم الماوس استخدام الأشعة تحت الحمراء الحرارة خلال تاق الجهازية السلبي وتقييم الحساسية الغذائية

Mouse body temperature measurement is of paramount importance for investigating allergies and anaphylactic symptoms. Rectal probes for temperature ...

In Vivo Imaging of Reactive Oxygen Species in a Murine Wound Model

The generation of reactive oxygen species (ROS) is a hallmark of inflammatory processes, but in excess, oxidative stress is widely implicated in various pathologies such as cancer, atherosclerosis and diabetes. We have previously shown that dysfunction of the Nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2 (Nrf2)/ Kelch-like erythroid cell-derived protein 1 (Keap1) signaling pathway leads to extreme ROS imbalance during cutaneous wound healing in diabetes. Since ROS levels are an important indicator of progression of wound healing, specific and accurate quantification techniques are valuable. Several in vitro assays to measure ROS in cells and tissues have been described; however, they only provide a single cumulative measurement per sample. More recently, the development of protein-based indicators and imaging modalities have allowed for unique spatiotemporal analyses. L-012 (C13H8ClN4NaO2) is a luminol derivative that can be used for both in vivo and in vitro chemiluminescent detection of ROS generated by NAPDH oxidase. L-012 emits a stronger signal than other fluorescent probes and has been shown to be both sensitive and reliable for detecting ROS. The time lapse applicability of L-012-facilitated imaging provides valuable information about inflammatory processes while reducing the need for sacrifice and overall reducing the number of study animals. Here, we describe a protocol utilizing L-012-facilitated in vivo imaging to quantify oxidative stress in a model of excisional wound healing using diabetic mice with locally dysfunctional Nrf2/Keap1.

In Vivo Imaging of Reactive Oxygen Species in a Murine Wound Model

We describe a non-invasive in vivo imaging protocol that is streamlined and cost-effective, utilizing L-012, a chemiluminescent luminol-analog, to visualize and quantify reactive oxygen species (ROS) generated in a mouse excisional wound model.

في فيفو تصوير للأنواع الأكسجين التفاعلية في الفاري الجرح النموذجي

The generation of reactive oxygen species (ROS) is a hallmark of inflammatory processes, but in excess, oxidative stress is widely implicated in various ...