ومولت هذه البحوث الوطنية العلم مؤسسة جائزة عدد 1237969، "كشف هيتيروزيجوسيتي والتكوين الاليلي، وتباين عدد نسخة من البطاطا" ووزارة الزراعة الأمريكية الخاصة منحة 2014-34141-22266 (جامعة ماين) إلى rv.

ملاحظة: من المهم لتشمل الضوابط المناسبة، عادة في شكل أنسجة نبات ploidy نفسه كنماذج تجريبية. وهذا لأنه قد يكون ذروة ج 2 من عينات درنة صغيرة ويصعب تحديد.
1-الأعمال التحضيرية
ملاحظة: الحلول المدرجة هنا قد أعد قبل الوقت المحدد وتخزينها في 4 درجات مئوية لكن تلك التي قدمت في الخطوات اللاحقة يجب أن الطازجة في يوم الاستخدام.
<ol><li>جعل وحدة تخزين مناسبة لحل حضانة Plasmolysis (PIS) (15 مل في عينة): المانيتول 0.55 م، كاكل 2 مم2، 1 مم خ2ص4، 1 مم مجكل2، 50 مم تريس المخزن المؤقت pH 7.5 (المعدل مع HCl).</li>
	<li>جعل وحدة تخزين مناسبة للحل أغسل Plasmolysis (PWS) (15 مل في عينة) وهو مطابق لحزب القانون والعدالة باستثناء إضافة المانيتول 0.71 متر.</li>
	<li>جعل 250 مل من تعديل غالبريث التدفق الخلوي العازلة11 (FCB): 13.6 ملم سترات الصوديوم (الصوديوم)، والمماسح 8 مم، 18 مم مجكل2، 0.4% v/v X-100 تريتون. إثارة لمالا يقل عن 30 دقيقة لتوزيع X-100 تريتون.</li>
	<li>فلتر تعقيم الحلول PIS و PWS مع عامل تصفية بولييثيرسولفوني غير المتناظر (القرود) 0.22 ميكرومتر. استخدام وحدات الترشيح مدفوعة فراغ.</li>
	<li>
إعداد ميكرومتر 106 مش مرشحات لتفكيك بروتوبلاستس. إعداد 1.5 مل أنابيب ميكروسينتريفوجي التي يمكن أن تتداخل مباشرة إلى أنابيب جمع، ولكن يمكن استخدام أي طريقة لتمرير المعلقات من خلال عامل تصفية 106 ميكرومتر. ملاحظة: هذه لا تحتاج إلى أن تكون عقيمة.<ol>
<li>في حالة استخدام أنابيب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل، قطع 1 سم من الطرف كل أنبوبة ميكروسينتريفوجي. باستخدام لوحة الساخن أو الحرارة مصدر الحرارة الأخرى مش 1 سم2 قطعة 106 ميكرومتر الصلب على قطعة من رقائق الألومنيوم. اضغط قطع نهاية الأنبوب إلى الشبكة حتى أنهم قد تنصهر فيها.</li>
	</ol>
</li>
	<li>تغسل البطاطس أخذ عينات، إزالة جميع التربة والحطام. ملاحظة: حجم الدرنات والعمر ينبغي أن تكون مناسبة لأهداف التجربة ولكن لا يبدو أن تؤثر على نوعية النتائج. أننا قد طبقت بنجاح هذا البروتوكول الدرنات التي ظلت في التخزين البارد (4 درجة مئوية، 95% رطوبة نسبية) يصل إلى 8 أشهر. في حين قد تكون الدرنات مع العيوب (مثل درنة نهاية العفن، قلب أجوف، مناطق نخرية براون) استجابة، ينبغي تجنبها، إذا كان ذلك ممكناً.</li>
</ol>2-يوم 1: بلاسموليزي الأنسجة درنة
ملاحظة: عنصر تحكم ورقة عينات يمكن تضمينها هنا لإنتاج بروتوبلاستس أو في الخطوة 5، 2 إذا كانت الاستعدادات الخام المفضلة. يجب إجراء هذا باستخدام أدوات معقمة في بيئة معقمة مثل غطاء الاندفاق الصفحي.
<ol><li>سطح تعقيم درنات البطاطا عبر الانغماس في الإيثانول 75% لمدة 5 دقائق على الأقل.</li>
	<li>إزالة الدرنات من الإيثانول والهواء الجاف. هذا عادة ما يستغرق ~ 5 دقيقة، أطول إذا كانت الدرنة أكبر من 100 غرام.</li>
	<li>إعداد وتسمية العقيمة 50 مل أنابيب مخروطية الشكل لكل عينة والكوة 15 مل من تصفية تعقيم PIS إلى كل.</li>
	<li>
عينة تقريبا 1 سم3 من الأنسجة المرجوة من تعقيم الدرنات استخدام مشرط معقم أو حفار الفلين. ملاحظة: اعتماداً على الأنسجة يتم أخذ عينات واحد استخدام سكين/مشرط أو حفار الفلين معقمة. على سبيل المثال، إذا كان المطلوب هو لب حفار الفلين يمكن استخدامها لاتخاذ مجموعة أساسية من قمي للغاية البعيدة من الدرنة وقد أخذ عينات الكسر المركزية الأساسية. ومع ذلك، نظراً مورفولوجية الداخلية غير المتناظر لدرنات البطاطا، قد يكون أكثر دقة للعينة حمة أو اللحاء إلى النصف الدرنات ونسق الأنسجة المرجوة. انظر الشكل 1 لتصوير مورفولوجيا درنة الداخلية.<ol>
<li>ختم خشنا الأنسجة باستخدام مشرط معقم إلى حوالي 3 مم3 قطع ونقل الأنسجة للأنبوبة المخروطية التي تحتوي على PIS. تبني بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. ملاحظة: هذا لتحقيق أقصى قدر من المساحة السطحية حتى PIS، وبعد حل الإنزيم، قد تتخلل تماما الأنسجة الناتجة في الهضم أكثر اكتمالا.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57134/57134fig1.jpg"> رقم 1: مورفولوجيا الداخلية لدرنات البطاطس. ويوضح الفصل بين لب (P) ولحمة بيريميدولاري (م) مع خطوط سوداء. يتم الرمز إلى الحلبة والأوعية الدموية، الذي يفصل بين لحمه من القشرة (ج) مع سهم أسود. نهاية رئد (S) وعيون درنة (ه) المسماة كذلك. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57134/57134fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
3-يوم 2: تولد بروتوبلاستس البطاطا
ملاحظة: هذا يجب إجراء مع أدوات معقمة في بيئة معقمة مثل غطاء الاندفاق الصفحي.
<ol><li>إعداد والتصفية (تصفية القرود 0.45 ميكرومتر) مبلغ مناسب لحل الإنزيم (ES) (10 مل في عينة): المانيتول م 0.71، كاكل 3 مم2، 1 مم خ2ص4، 1 مم مجكل2، 4% R أونوزوكا-10 cellulase، 0.8% ماسيروزيمي R-10، هيميكولولاسي 1%، 10 مم مس العازلة، 5.8 درجة الحموضة. ضمان أن يتم استخدام عوامل التصفية المناسبة في هذه الخطوة؛ عوامل التصفية مع المسام حجم أصغر من 0.45 ميكرومتر المعرضة لانسداد حين غشاء ملزمة بروتين منخفض، مثل القرود، يقلل من فقدان إنزيم أثناء الترشيح.</li>
	<li>نضح قبالة PIS من العينات في أنابيب مخروطية استخدام ماصة مصلية عقيمة.</li>
	<li>أضف 10 مل ES كل عينة وعكس 2 – 3 مرات.</li>
	<li>احتضان عينات بين عشية وضحاها في 29 درجة مئوية مع الهز الأفقي 180 لفة في الدقيقة. احتضان عينات لمالا يقل عن 16 ح.</li>
</ol>4-يوم 3: بروتوبلاستس الحصاد واغسل بروتوبلاستس
ملاحظة: ظروف معقمة ضرورية لا طويلاً عند هذه النقطة.
<ol><li>إزالة عينات من شاكر والسماح لهم بتسوية ل ~ 10 دقيقة.</li>
	<li>
نضح قبالة قدر من الحل دا قدر الإمكان.
	<ol>
<li>إزالة جزء كبير من الحل دا ممكن ماصة مصلية، مع الحرص على تجنب إزالة الأنسجة هضمها.</li>
		<li>استخدام إزالة ميكروبيبيتي أي حل وفاق المتبقية، مرة أخرى تجنب الأنسجة هضمها. ويتم ذلك أكثر سهولة بعقد الأنبوبة بزاوية حيث أن الحل دا التدفقات نحو الغطاء بينما تظل الأنسجة هضمها في الجزء السفلي.</li>
	</ol>
</li>
	<li>إضافة 15 مل PWS لكل عينة، وعكس بلطف 2-3 مرات. السماح بروتوبلاستس على تسوية لمدة 10 دقائق.</li>
	<li>إزالة PWS مع ماصة مصلية. استخدام ميكروبيبيتي لإزالة أي سائل المتبقية. ملاحظة: هذه الخطوة غاية الأهمية لضمان سلامة الأنوية عينة أثناء التدفق الخلوي. في استكشاف الأخطاء وإصلاحها، تم العثور على هذه الخطوة لتكون المصدر الأكثر احتمالاً لفشل في عينة.</li>
</ol>5-يوم 3: إعداد العينات للتدفق الخلوي
ملاحظة: العينات ينبغي أن تظل على الجليد من هنا ما لم يذكر خلاف ذلك.
<ol><li>تحضير يوديد propidium (0.4 ملغ propidium يوديد/mL FCB) وحلول رناسي (0.8 ملغ رناسي A/مل FCB) بحل كل منهما في FCB. تنبيه: يوديد Propidium عالية السمية. تجنب ملامسة الجلد أو العينين. ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة.</li>
	<li>
إضافة 1.5 مل جليد الباردة FCB لكل عينة. باختصار اهتزاز أو دوامة كل عينة لتفريق تجمع الأنسجة. من المهم أن تفتيت كتل الأنسجة درنة حيث أن FCB الكامل قد تتخلل الخلايا وإطلاق سراح الأنوية. عينات مختلفة قد تتطلب أكثر أو أقل من الانفعالات تبعاً للنمط الوراثي والأنسجة. ملاحظة: FCB بروتوبلاستس، الإفراج عن الأنوية. ومن ثم ضرورة حفظ العينات على الجليد للحيلولة دون تدهور.<ol>
<li>إذا لم تدرج مراقبة التدفق الخلوي عينات في الخطوة جيل جبلة مجردة أنها يمكن أن تدرج هنا. إذا كان عنصر تحكم المراد إضافتها، ختم ناعما ورقة صغيرة (~ 3 سم2) في 1.5 مل جليد الباردة FCB باستخدام شفرة حلاقة. يجب أن تكون عينات مراقبة ploidy نفسه كنماذج تجريبية، يفضل أن يكون نفس النمط الوراثي. في المختبر النبيتات تميل إلى إعطاء قمم أنظف من الاحتباس الحراري أو النباتات التي تزرع في الحقل.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
تمرير 1 مل تعليق FCB/الأنسجة من خلال عامل تصفية شبكة 106 ميكرومتر. استخدام أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل مع نصيحة قطع ومش معدنية ذاب إلى الأسفل كما هو موضح في الخطوة 1.5.1. قد تتداخل هذه الأنبوبة ميكروسينتريفوجي مباشرة في أنبوب ميكروسينتريفوجي 2 مل والعينة مرت مباشرة. في حالة استخدام أسلوب آخر للترشيح، قد جمعت في صفيحة بيتري المثلج فيلتراتي وثم نقل إلى أنبوب 2 مل. ملاحظة: في بعض الأحيان المجاميع المتبقية والحطام الخلوية قد تسد مش عامل التصفية. وفي هذه الحالة، ببساطة اضغط اثنان أنابيب متداخلة ميكروسينتريفوجي عدة مرات لإزاحة الأنقاض.</li>
	<li>إضافة 250 ميليلتر من الحل رناسي لكل عينة. عكس واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT). ملاحظة: هذه الخطوة يهدف إلى إزالة الجيش الملكي النيبالي من العينات، مما يؤدي إلى أقل ضوضاء أثناء التدفق الخلوي. كما النواة لم تدم طويلاً، بيد أن تقرر الباحثين إنقاص وقت الحضانة أو تنفيذ على الجليد إذا كانت تعاني من تدهور شديد في العينات الخاصة بهم.</li>
	<li>إضافة ميليلتر 125 الحل يوديد propidium لكل عينة. عكس واحتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة. ملاحظة: يجب استخدام عينات للتدفق الخلوي، في أقرب وقت ممكن كما تدهور واضح ضمن ح 2، حتى على الجليد.</li>
</ol>6-يوم 3: التدفق الخلوي نويات درنة البطاطا
ملاحظة: تدفق العملية سيتوميتير، والبرمجيات سوف تختلف تبعاً للصك، والشركة المصنعة. سيتم توفير إرشادات مفصلة عن عملية محددة من سيتوميتير التدفق في "دليل المستخدم" هذا الصك.
<ol><li>إنشاء قطعتي دوت باستخدام مقياس لوغاريتمي للأمام مبعثر مقابل مبعثر الجانب والجانب مقابل (PI) يوديد propidium المبعثر. أيضا إنشاء مدرج تكراري مع PI على المحور س. مطلوب مقياس لوغاريتمي لضمان كافة الأحداث داخل النطاق كما نوى قد تختلف اختلافاً شاسعاً في الأسفار.</li>
	<li>
تحميل أنبوب عينة تحكم معروفة وضبط الجهد حيث تكون كافة الأحداث بمقياس. ونحن نستخدم نسيج ليف في المختبر وراثي عينة. في حالة تشغيل عينات بلويديس مختلفة، ينبغي إدراج نموذج تحكم لكل.
	<ol>
<li>جعل علما لقناة لذروة ج 2 في نموذج عنصر تحكم. ينبغي أن تقع على قمم ج 2 من العينات التجريبية في نفس الموقع.</li>
	</ol>
</li>
	<li>تحميل نموذج تجريبي (درنة) ومرة أخرى التأكد من أن كافة الأحداث بمقياس. إذا كانت هناك تعديلات مطلوبة، كرر الخطوة 6.2 لتحديد قناة ج 2، قمم.</li>
	<li>بوابة الأنوية جبلة مجردة باستخدام الأرض مقابل PI مبعثر الجانب يدوياً.</li>
	<li>تعيين الرسم البياني PI لإظهار منطقة نوى بوابات جبلة مجردة فقط.</li>
	<li>جمع العدد المطلوب من الأحداث من كل عينة. كثيرا ما استخدم الباحثون أحداث بوابة 10,000 للتدفق الخلوي؛ ولكن نستخدم 2,000 أحداث درنة جبلة مجردة عينات لاستيعاب المزيد من العينات والعينات بتركيزات منخفضة.</li>
	<li>حساب الصناعات الاستخراجية كل عينة من رسوم بيانية بي باستخدام الصيغة التالية: الصناعات الاستخراجية =<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57134/57134eq1.jpg"> ج 8 حيثما ج 4 النسبة المئوية للنوى وهي ج 4 (تمثل جولة واحدة من اندوريدوبليكيشن)، هو النسبة المئوية التي ج 8، وهلم جرا. انظر الشكل 4 للحصول على أمثلة من رسوم بيانية وقيم ج الذري.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Wilson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The karyoplasmic ratio. 727, (1925).</li><li>Szymanski, D. B., Marks, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLABROUS1+overexpression+and+TRIPTYCHON+alter+the+cell+cycle+and+trichome+cell+fate+in+Arabidopsis.">GLABROUS1 overexpression and TRIPTYCHON alter the cell cycle and trichome cell fate in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 10 (12), 2047-2062 (1998).</li><li>Melaragno, J. E., Mehrotra, B., Coleman, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+endopolyploidy+and+cell+size+in+epidermal+tissue+of+Arabidopsis.">Relationship between endopolyploidy and cell size in epidermal tissue of Arabidopsis.</a> Plant Cell. 5 (11), 1661-1668 (1993).</li><li>Grafi, G., Larkins, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoreduplication+in+maize+endosperm:+involvement+of+M+phase--promoting+factor+inhibition+and+induction+of+S+phase--related+kinases.">Endoreduplication in maize endosperm: involvement of M phase--promoting factor inhibition and induction of S phase--related kinases.</a> Science. 269 (5228), 1262-1264 (1995).</li><li>Schweizer, L., Yerk-Davis, G., Phillips, R., Srienc, F., Jones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+maize+endosperm+development+and+DNA+endoreduplication.">Dynamics of maize endosperm development and DNA endoreduplication.</a> Proc Natl Acad Sci. 92 (15), 7070-7074 (1995).</li><li>Chen, C. T., Setter, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+potato+tuber+cell+division+and+growth+to+shade+and+elevated+CO2.">Response of potato tuber cell division and growth to shade and elevated CO2.</a> Ann Bot. 91 (3), 373-381 (2003).</li><li>Chen, C. T., Setter, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+potato+dry+matter+assimilation+and+partitioning+to+elevated+CO2+at+various+stages+of+tuber+initiation+and+growth.">Response of potato dry matter assimilation and partitioning to elevated CO2 at various stages of tuber initiation and growth.</a> Environ Exp Bot. 80, 27-34 (2012).</li><li>Cheniclet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+expansion+and+endoreduplication+show+a+large+genetic+variability+in+pericarp+and+contribute+strongly+to+tomato+fruit+growth.">Cell expansion and endoreduplication show a large genetic variability in pericarp and contribute strongly to tomato fruit growth.</a> Plant Physiol. 139 (4), 1984-1994 (2005).</li><li>Pirrello, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+fruit+developmental+biology+makes+use+of+flow+cytometry+approaches.">How fruit developmental biology makes use of flow cytometry approaches.</a> Cytometry Part A. 85 (2), 115-125 (2014).</li><li>Chevalier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoreduplication+and+fruit+growth+in+tomato:+evidence+in+favour+of+the+karyoplasmic+ratio+theory.">Endoreduplication and fruit growth in tomato: evidence in favour of the karyoplasmic ratio theory.</a> J Exp Bot. 65 (10), 2731-2746 (2014).</li><li>Galbraith, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+flow+cytometric+analysis+of+the+cell+cycle+in+intact+plant+tissues.">Rapid flow cytometric analysis of the cell cycle in intact plant tissues.</a> Science. 220 (4601), 1049-1051 (1983).</li><li>Dole&#382;el, J., Greilhuber, J., Suda, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry+with+Plants:+An+Overview.">Flow Cytometry with Plants: An Overview.</a> Flow Cytometry with Plant Cells. , 41-65 (2007).</li><li>Dole&#382;el, J., Barto&#353;, J. A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+DNA+flow+cytometry+and+estimation+of+nuclear+genome+size.">Plant DNA flow cytometry and estimation of nuclear genome size.</a> Ann Bot. 95 (1), 99-110 (2005).</li><li>Doke, N., Tomiyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+hyphal+wall+components+from+Phytophthora+infestans+on+protoplasts+of+potato+tuber+tissues.">Effect of hyphal wall components from Phytophthora infestans on protoplasts of potato tuber tissues.</a> Phys Plant Path. 16 (2), 169-176 (1980).</li><li>Davis, D. A., Currier, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+the+phytoalexin+elicitors,+arachidonic+and+eicosapentaenoic+acids,+and+other+unsaturated+fatty+acids+on+potato+tuber+protoplasts.">The effect of the phytoalexin elicitors, arachidonic and eicosapentaenoic acids, and other unsaturated fatty acids on potato tuber protoplasts.</a> Physiol Mol Plant Pathol. 28 (3), 431-441 (1986).</li><li>Laimbeer, F. P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protoplast+isolation+prior+to+flow+cytometry+reveals+clear+patterns+of+endoreduplication+in+potato+tubers,+related+species,+and+some+starchy+root+crops.">Protoplast isolation prior to flow cytometry reveals clear patterns of endoreduplication in potato tubers, related species, and some starchy root crops.</a> Plant Methods. 13 (1), 27 (2017).</li><li>Uijtewaal, B. A., Huigen, D. J., Hermsen, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+potato+monohaploids+(2n=x=12)+through+prickle+pollination.">Production of potato monohaploids (2n=x=12) through prickle pollination.</a> Theor Appl Genet. 73 (5), 751-758 (1987).</li><li>Karp, A., Risiott, R., Jones, M. G. K., Bright, S. W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+doubling+in+monohaploid+and+dihaploid+potatoes+by+regeneration+from+cultured+leaf+explants.">Chromosome doubling in monohaploid and dihaploid potatoes by regeneration from cultured leaf explants.</a> Plant Cell Tiss Org Cult. 3 (4), 363-373 (1984).</li><li>Doke, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+superoxide+anion+by+potato+tuber+protoplasts+during+the+hypersensitive+response+to+hyphal+wall+components+of+Phytophthora+infestans+and+specific+inhibition+of+the+reaction+by+suppressors+of+hypersensitivity.">Generation of superoxide anion by potato tuber protoplasts during the hypersensitive response to hyphal wall components of Phytophthora infestans and specific inhibition of the reaction by suppressors of hypersensitivity.</a> Phys Plant Path. 23 (3), 359-367 (1983).</li><li>Doke, N., Tomiyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+the+hypersensitive+response+of+potato+tuber+protoplasts+to+hyphal+wall+components+by+water+soluble+glucans+isolated+from+Phytophthora+infestans.">Suppression of the hypersensitive response of potato tuber protoplasts to hyphal wall components by water soluble glucans isolated from Phytophthora infestans.</a> Phys Plant Path. 16 (2), 177-186 (1980).</li><li>Saxena, P. K., King, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reuse+of+enzymes+for+isolation+of+protoplasts.">Reuse of enzymes for isolation of protoplasts.</a> Plant Cell Rep. 4 (6), 319-320 (1985).</li><li>Sgorbati, S., Levi, M., Sparvoli, E., Trezzi, F., Lucchini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytometry+and+flow+cytometry+of+4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole+(DAPI)-stained+suspensions+of+nuclei+released+from+fresh+and+fixed+tissues+of+plants.">Cytometry and flow cytometry of 4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)-stained suspensions of nuclei released from fresh and fixed tissues of plants.</a> Physiol Plant. 68 (3), 471-476 (1986).</li><li>Bhojwani, S. S., Dantu, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+and+cell+culture.">Tissue and cell culture.</a> Plant Tissue Culture: An Introductory Text. , 39-50 (2013).</li><li>Flores, H. E., Kaur-Sawhney, R., Galston, A. W., Maramorosch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protoplasts+as+Vehicles+for+Plant+Propagation+and+Improvement.">Protoplasts as Vehicles for Plant Propagation and Improvement.</a> Advances in Cell Culture. 1, 241-279 (1981).</li><li>Reeve, R. M., Timm, H., Weaver, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parenchyma+cell+growth+in+potato+tubers+I.+Different+tuber+regions.">Parenchyma cell growth in potato tubers I. Different tuber regions.</a> Am Potato J. 50 (2), 49-57 (1973).</li><li>Scholes, D. R., Paige, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+in+ploidy:+a+generalized+response+to+stress.">Plasticity in ploidy: a generalized response to stress.</a> Trends Plant Sci. 20 (3), 165-175 (2015).</li></ol>

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

وينص البروتوكول على المقدمة في هذه الوثيقة الباحثين مع وسيلة لتقييم اندوريدوبليكيشن داخل درنات البطاطا، الذين الخلوية تعديل المحتوى، وزيادة حجم الخلية على ما يبدو يحول دون غيرها الاستعدادات التدفق الخلوي. يعتمد البروتوكول على توليد جبلة مجردة كوسيلة للحد من الضوضاء والحطام مع الحفاظ على السلامة النووية. سابقا، الباحثين قد وصف الأعمال التحضيرية مشابهة للمعاندة لا سيما التدفق الخلوي عينات، فضلا عن استخدام بروتوبلاستس الدرنات لدراسة مجموعة متنوعة من المواضيع مثل المرضية19،20. ومع ذلك، على حد علمنا، بلا تضافرت استخدام مثل هذه بروتوبلاستس الدرنات مع التدفق الخلوي غرض دراسة اندوريدوبليكيشن. وعلاوة على ذلك، وجدنا استخدام بروتوبلاستس أن تكون أكثر موثوقية من الاستعدادات الخام النموذجية فضلا عن التقنية تستخدم في الاثنين فقط دراسات أخرى لتقييم درنة اندوريدوبليكيشن6،7. هنا نناقش أوجه القصور في البروتوكول، والمزالق المحتملة في إعداد التنفيذ، وعينه، ونتائج تجربة نموذجية التي توظف أنه.
على الرغم من فائدة والتكرار درنة التدفق الخلوي البروتوكول، لديه بعض نقاط الضعف التي ينبغي أن تناقش. للبدء، هو البروتوكول الوقت المكثفة، التي تتطلب اثنين إينكوباتيونس بين عشية وضحاها. وعلاوة على ذلك، يتطلب البروتوكول بعض الكواشف باهظة الثمن، لا سيما سيلولاسي وماسيروزيمي. بالإضافة إلى ذلك، الأعمال التحضيرية العالية الحساسة للوقت، ومهينة في غضون ساعات قليلة، مما قد يحد من الإنتاجية خلال يوم واحد، لا سيما إذا رغبت في العديد من المناسبات. وأخيراً، البروتوكول، بينما يعول عليها، الحساسة للأخطاء ضمن إعداد العينة التي يبدو أن ينجم عنه ضرر إلى نويات وانخفاض نوعية النتائج. على سبيل المثال، قد يحدث التلوث الميكروبي أثناء بلاسموليسيس وجبلة مجردة جيل الخطوات (1 – 3، 4) بسبب الأسلوب العقيم غير لائق. تلوث العينة، بينما لم يكن دائماً تحول دون نجاح عينة، يبدو أن كبير انخفاض الجودة للحصول على رسوم بيانية، مرة أخرى المحتمل نظراً الأضرار التي لحقت النوى.
كما ذكر سابقا، هي المآخذ الرئيسية للبروتوكول تكاليف ووقت وحساسية للأخطاء. ولعل الباحثين على اتخاذ خطوات للتخفيف من كل من هذه. أما بالنسبة للتكلفة، تعتزم تطبيق البروتوكول على عينات العديد من الباحثين قد تنظر في تعديل تركيزات الإنزيم و/أو مدة الخطوة الهضم كأنسجة مختلفة وقد تختلف الأنماط الجينية في الاستجابة. وهذا يشمل إمكانية تصفية وإعادة تدوير ES التي قد سبق ثبت لكنه لم يعمل هنا21. أما بالنسبة للوقت، وفي ملاحظتنا، من الممكن أن تستغني الحضانة الأولى (الخطوة بلاسموليسيس) وما زال استخراج بروتوبلاستس؛ ومع ذلك، سلامتهم ووفرة ستعاني، مما يؤثر سلبا على النتائج. للحد من التدهور لعينات قد ينظر الباحثون أن بعض النهج التدفق الخلوي تنطوي على استخدام المصفف (مثلاً، والفورمالديهايد) للحفاظ على سلامة العينة22. وهذا قد يكون وسيلة مفيدة لكل منع التدهور والسماح لنموذج التخزين بدلاً من جبلة مجردة الابتزاز والتدفق الخلوي تحدث في نفس اليوم وقدم. قد تكون وسيلة أخرى لمنع استنزاف نويات ليشمل مثبط نوكلاس ES و/أو المعمرون؛ بينما 2-mercaptoethanol تتم لا تغييرات ملحوظة خلال التنمية، لم يتم اختبارها مثبطات أخرى هنا.
في ملاحظتنا، الخطوة الأكثر أهمية واحدة خطوة 4.4، الإزالة جميع الحل أغسل plasmolysis قبل إضافة المخزن المؤقت التدفق الخلوي (FCB). إذا حتى كمية صغيرة (< 10 ميليلتر) بقايا العينات أكثر بكثير من المحتمل أن يكون المتدهورة التي يمكن أن تؤدي إلى عينة ضعف أو فشل حتى. ومن المرجح نتيجة للشوائب داخل الحل إنزيم (مثل نوكليسيس، البروتياز)23،24 التي تتحلل بسرعة الأنوية أثناء فترات حضانة والوقت بين تشغيل العينة، وحتى بتركيزات منخفضة. ثمة اعتبار هام آخر هو مدة حضانة الخطوات PI ورناسي. كما ورد في البروتوكول، العينات التي لا تزال مستقرة لأكثر من بضع ساعات بعد تشغيل إضافة FCB حتى الباحثين قد تقرر خفض مدة هذه الخطوات لاستيعاب المزيد من عينات أو مطولة التدفق الخلوي الناجم عن نويات منخفضة تركيزات. وهذا يتطلب أيضا الباحث للنظر في المفاضلة بين عدد من الأحداث في كل عينة والعدد الإجمالي للعينات تشغيلها أو النظر في استخدام المصفف كما ذكر سابقا.
الاختلافات بين الأنسجة والأنماط الجينية
تقديم نتائج ممثل البروتوكول صممنا تجربتين بسيطة تأكيد التباين المبلغ عنها سابقا بالانسجة، ودراسة تأثير بلويدي والتركيب الوراثي. نتائج التجربة الأنسجة تثبت أن البروتوكول يثمر نتائج استنساخه، كما تبين أن الصناعات الاستخراجية أعلى مرة أخرى لانسجة لب. وكان المثير للدهشة إلى حد ما حمة الأنسجة، والتي لم يجر تقييم سابقا، قيمة الصناعات الاستخراجية مشابهة للأنسجة القشرية وأقل بكثير من لب. وكان هذا غير متوقعة كخلايا حمة أكبر عادة من لب أو الخلايا القشرية، على الأقل في مرحلة النضج. أحد التفسيرات المحتملة هو أن الدرنات (90-130 غ) كانت غير ناضجة جداً لخلايا حمة، التي تضم الغالبية حجم الدرنات عند النضج الكامل الموسع وبلغ بهم ج-القيم القصوى25. وهذا قد يفسر أيضا لماذا ديهابلويد (VT_SUP_19)، وتضاعف ديهابلويد (VT_SUP_19 4 x) أظهرت الصناعات الاستخراجية أكبر بكثير من عام الدرنات متفوقة؛ في حين أخذت عينات الدرنات تقريبا متساوية في الحجم من كل الوراثي، الحد الأقصى لحجم الدرنات من VT_SUP_19 أو تيترابلويد اسوي أصغر بكثير من أن السلف. وهكذا، قد يكون من أن عرض أكبر الصناعات الاستخراجية ببساطة لأنها كانت أكبر مقارنة بحجمها يمكن بلوغه الحد الأقصى. وبدلاً من ذلك، قد يكون الفرق نتيجة لتكملة الوراثية VT_SUP_19 الواردة من السلف تيترابلويد. وثمة إمكانية أخرى هي أن تخفيض الجينوم الذي وقع في استخراج ديهابلويد من تيترابلويد قد يكون العراقية الآليلات الضارة الناتجة في الإجهاد النبات على نطاق المنظومة، التي أظهرت أيضا تسهم الصناعات الاستخراجية مرتفعة26. ومع ذلك، يوضح هذا يجب توظيف الباحثين النظر بعناية عند اختيار الدرنات والأنسجة لاستخدامها للمقارنة بين قيم المنظمة الدولية للتعليم، لا سيما بين الأنماط الجينية.
التطبيقات المستقبلية
ينص البروتوكول على الموضحة في هذه المقالة الباحثين مع أداة هامة لفهم اندوريدوبليكيشن في البطاطا. فإنه قد يسمح للدراسات في العناصر الوراثية والبيئية من اندوريدوبليكيشن، في الوقت-مسار التنمية عبر أنسجة الدرنات، وتقييم التباين الطبيعي. وفي نهاية المطاف، قد جعل اندوريدوبليكيشن هدفا واعدة لتحسين البطاطا، تعهد الذي سوف تحتاج إلى وسيلة يمكن الاعتماد عليها لتقييم.

اندوريدوبليكيشن هي العملية التي خلية فورجويس دورة الخلية النموذجية، ويخضع بالطبع بديلة للتنمية تتكون من جولات متكررة من تكرار الحمض النووي دون الخلوية شعبة بدلاً من ذلك. الخلية الناتجة ستكون قد زادت الحمض النووي حجم المحتوى والنووية التي يعتقد أن تلعب دوراً في التنظيم الخلوية، والتوسع، والتخصص. وبوجه عام، جولة من اندوريدوبليكيشن (يطلق عليها اندوسيكلي)، وما يقابل ذلك من الزيادة في محتوى الحمض النووي المرتبطة بالزيادة في حجم الخلية، ملاحظة أن عجلت "نظرية كاريوبلاسميك" أن زيادة محتوى الحمض النووي مطلوب بشكل صحيح تنظيم أكبر، ربما كانت أكثر تعقيداً، الخلية1. هذه الظاهرة شائعة في النباتات العليا، وقد لوحظت في مجموعة من الأنسجة بما في ذلك مع الهيكلية/الدفاعية (trichomes)2،3، التغذوية (السويداء الذرة)4،5، و (الحوض/التخزين أهمية الطماطم؛ درنة البطاطا)6،،من78 وظائف. في الفاكهة، واقترح أن اندوريدوبليكيشن تلعب دوراً في تيسير التوسع السريع للقشرة كما يتضح من العلاقة السلبية بين اندوريدوبليكيشن والفواكه الإنمائية الفترة9. فعلى سبيل المثال الخلايا مع الحمض النووي محتوى ما يصل إلى 512 ج (512 مرات الجينوم فرداني) قد لوحظت في أهمية الطماطم8. علاوة على ذلك وسام et al. (2014) أظهرت أن التغيرات في التعبير عن الجينات دورة الخلية يمكن أن يؤدي إلى زيادات في مستويات اندوريدوبليكيشن داخل القشرة التي ينتج الفاكهة أكبر10ثم. وهكذا، يقدم تحوير الجينات تعزيز اندوريدوبليكيشن هدفا محتملاً للتحسين من الكتلة الحيوية أو العائد من خلال تربية النباتات أو التلاعب بالجينات. هذا التحسين غير مرهونة بمزيد من الفهم لأسباب وعواقب اندوريدوبليكيشن.
يتم قياس اندوريدوبليكيشن في أغلب الأحيان عن طريق التدفق الخلوي حيث يتم المحتضنة النوى، أفرج عنه في الأعمال التحضيرية النسيج الخام11، مع فلوروفوري الحمض النووي ملزمة، مثل يوديد propidium12 (PI). ثم يتم تمرير العينات التي تم تصفيتها بالليزر من سيتوميتير تدفق حيث يمكن ملاحظة الانبعاثات أطوال موجية محددة فلوروفوري. كثافة الأسفار في كل حدث (أي نواة) ارتباطاً مباشرا مع الحمض النووي--محتوى الجسيمات. وهكذا، عن طريق مقارنة بمعيار معروف، قد يكون حساب محتوى الحمض النووي المطلقة والنسبية للخلايا في نموذج معين. اندوريدوبليكيشن الأرقام القياسية (الصناعات الاستخراجية) تتحدد بتحديد متوسط عدد اندوسيكليس كل خلية داخل عينة بمراقبة محتوى الحمض الخلوي (ج-القيمة) حيث ج 1 هو محتوى الحمض النووي لخلية فرداني (الصيغة المعروضة في الخطوة 6.7 من البروتوكول). على سبيل المثال، هو قاعدة محتوى الحمض النووي للخلايا الجسدية في كائن مثنوية، جيم 2 إذا كان قد عينة الخلايا القليلة مع ج 4، المقابلة لجولة واحدة من اندوريدوبليكيشن، أو أكبر سيكون الصناعات الاستخراجية القرب من 0؛ لكن إذا ما يقرب من جميع الخلايا ج 4 الصناعات الاستخراجية سيكون حوالي 1. ومع ذلك، كما جولات متعددة من اندوريدوبليكيشن شائعة في النباتات لوحظت أعلى الصناعات الاستخراجية القيم قد تكون أكبر بكثير. أثناء حساب الأرقام القياسية اندوريدوبليكيشن قد يكون بسيط نسبيا، فإنه يقتضي أن وفرة نسبية من نويات ج-قيم موثوق تأكدت، التي تنتفي في بعض الأنواع والأنسجة (بما في ذلك درنات البطاطا). ومن المرجح أن تؤدي الاختلافات في تكوين التشريح، والكيمياء أو خلية جدار خلوي13 هذه العينات أن المعاندة في الأعمال التحضيرية النموذجية باستخدام شفرة حلاقة للإفراج عن الأنوية مباشرة إلى مخازن المناسبة المستخدمة بشكل شائع مع الأنسجة، مثل أهمية الطماطم والدراسات نموذجا اندوريدوبليكيشن8.
في البطاطا، لا يزال النظر في اندوريدوبليكيشن داخل الدرنة تقتصر على بضع دراسات، وربما كان يرجع جزئيا إلى عدم وجود بروتوكول يمكن الاعتماد عليها كما الاستعدادات الخام المذكورة تسفر عن نتائج غير متناسقة. في حين أن مثل هذا النهج تعمل بشكل جيد يترك تجربة العينات درنة التدهور الشديد ووفرة من الضوضاء في نموذج الحطام، مما يجعل التفريق بين قمم تتألف من نواة مع اختلاف القيم ج يكاد يكون من المستحيل. ولعل هذا سبب الاختلافات في التركيب الخلوي ووفرة من الحطام الخلوية داخل الخلايا درنة (على سبيل المثال-تخزين النشاء amyloplasts). للتغلب على هذه العقبة، وضعنا مؤخرا بروتوكولا أكثر موثوقية للحصول على قمم يمكن تمييزها في التدفق الخلوي لدرنات البطاطا. ثم يمكن استخدام تردد الخلايا داخل كل ذروة لحساب مستويات اندوريدوبليكيشن دقيقة لمختلف الأنماط الجينية أو الأنسجة المختلفة التي تتألف منها درنة. البروتوكول الذي يستخدم أسلوب استخراج معدلة جبلة مجردة سابقة15 14،الموصوفة سابقا التدفق الخلوي11، أظهرت تباينا كبيرا داخل الأقارب البطاطا، والأصناف، والأنسجة16 . هنا نقدم البروتوكول بالتفصيل عن طريق تقييم الصناعات الاستخراجية في سياقات ploidy، الأنسجة، وحجم الدرنات.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Serological pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-676-10k</td>
			<td>(sterile)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Aid XP (autopipettor)</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>4-000-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes (50 ml)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td>(sterile)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (1.5 ml)</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>111558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (2 ml)</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>111552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filtration unit (0.22&#181;m)(aPES)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>564-0020</td>
			<td>(sterile)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filtration unit (0.45&#181;m)(aPES)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>168-0045</td>
			<td>(sterile)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulase &#34;Onozuka R-10&#34;</td>
			<td>Yakult</td>
			<td></td>
			<td>contact company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macerozyme &#34;Onozuka R-10&#34;</td>
			<td>Yakult</td>
			<td></td>
			<td>contact company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemicellulase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H2125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES buffer</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>172590250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>MP Biochemicals</td>
			<td>194854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (hexahydrate)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M35-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride (dihydrate)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>423922500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>17263-0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate (monobasic, anhydrous)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-5379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170</td>
			<td>For flow cytometry preparations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonuclease A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R5000</td>
			<td>For flow cytometry preparations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cork borers with punch</td>
			<td>American Scientific</td>
			<td>2093-02</td>
			<td>For smapling desired tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16-31</td>
			<td>For smapling desired tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>08-920B</td>
			<td>For smapling desired tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>106um stainless steel mesh or other seive of same pore size</td>
			<td>New Jersey Wire Mesh Co.</td>
			<td></td>
			<td>contact company</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring endoreduplication by flow cytometry of isolated tuber protoplasts

الخلايا التي تحتوي على محتوى الحمض النووي زيادة غلة اندوريدوبليكيشن، النسخ المتماثل من الجينوم لخلية النووي دون cytokinesis اللاحقة، ويرتبط بالتخصص وتنمية وزيادة في حجم الخلايا. ويبدو اندوريدوبليكيشن في النباتات، لتسهيل النمو والتوسع في بعض الأنسجة والأعضاء. ومن درنة البطاطس (البطاطا)، الذي يخضع لتوسيع الخلوية كبير في أداء وظيفتها المتمثلة في تخزين الكربوهيدرات. وهكذا، اندوريدوبليكيشن قد تلعب دوراً هاما في كيفية الدرنات تكون قادرة على استيعاب هذه الوفرة من الكربون. ومع ذلك، الحطام الخلوية الناتجة عن أساليب العزلة النووية الخام من الدرنات، الأساليب التي يمكن استخدامها بفعالية مع الأوراق، ويمنع تقدير مؤشر اندوريدوبليكيشن الدرنات (الصناعات الاستخراجية). تعرض هذه المقالة تقنية لتقييم اندوريدوبليكيشن الدرنات عن طريق عزل بروتوبلاستس بينما إثبات النتائج التمثيلية التي تم الحصول عليها من مختلف الأنماط الجينية ومجزأة أنسجة الدرنات. وهي القيود الرئيسية للبروتوكول تكاليف الوقت وكاشف المطلوبة لإعداد عينة فضلا عن عمر قصيرة نسبيا من العينات بعد تحلل بروتوبلاستس. في حين البروتوكول حساسة للتغير التقني، فإنه يمثل تحسنا مقارنة الأساليب التقليدية للعزلة النووية من هذه الخلايا المتخصصة الكبيرة. ويقترح إمكانيات إجراء تحسينات في البروتوكول مثل إعادة تدوير الإنزيم واستخدام المصفف وتغييرات أخرى.

إنتاج بروتوبلاستس
جيل بروتوبلاستس ضروري لتحقيق نتائج قياس تدفق قابل للتكرار من درنات البطاطا، مورفولوجية العامة التي يتم عرضها في الشكل 1. ولعل الباحثين لضمان بروتوبلاستس عالية الجودة وقد صدرت قبل إضافة FCP، لا سيما في حالة أن استكشاف الأخطاء وإصلاحها. غالبية بروتوبلاستس يجب أن تكون كروية مع نتوءات الحد الأدنى (الشكل 2)، وقد تختلف اختلافاً كبيرا في الحجم، وربما تعكس الاختلافات في الصناعات الاستخراجية.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57134/57134fig2.jpg"> رقم 2: الممثل بروتوبلاستس أوراق ودرنات المكتسبة في الخطوة 4-4 البروتوكول. ينبغي أن تكون معزولة بروتوبلاستس كروية ومتناظرة مع غشاء البلازما سليمة. ملاحظة حجم الاختلاف بين أوراق (أ-ج) والدرنات (د، ه) بروتوبلاستس، فضلا عن الاختلافات في الحجم داخل أنسجة التي قد تشير إلى مستويات مختلفة من اندوريدوبليكيشن. بروتوبلاستس أوراق تحتوي على المعايشة حين amyloplasts مرئية داخل بروتوبلاستس الدرنات. تغيير حجم أشرطة = 1,000 ميكرومتر. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57134/57134fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
تقييم نتائج التدفق الخلوي
قد يمكن قياس نجاح أو فشل تجربة من عرض قمم وانفصالهما في رسوم بيانية الخلوي التدفق. كما يتطلب قياس اندوريدوبليكيشن حساب الوفرة النسبية للنوى في كل ذروة، مجرد وجود أو عدم وجود قمم غير كاف إذا كان هناك الكثير من الضجيج رسم حدود ذات مغزى فيما بينهما. يعرض الشكل 3 التباين في النتائج التي قد تواجه الباحثين في التدفق الخلوي التبعثر مؤامرات ورسوم بيانية. الأسباب المحتملة لفشل عينات ترد ضمن المناقشة.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57134/57134fig3.jpg"> الشكل 3: الممثل النتائج التي تم الحصول عليها من التدفق الخلوي نويات جبلة مجردة من سليمة والمتدهورة عينات لب. إظهار نويات سليمة (أ) فصل نظيف بين قمم التحديد الكمي للوفرة النسبية للخلايا في كل استخدام البرنامج المناسب حين تظهر قمم في عينات المتدهورة (ب) قواعد تحول وواسعة ومتداخلة. في scatterplots المتدهورة (د) عينات وسليمة (ج)، تشير المربعات السوداء إلى الحدث النووي النابضة لرسوم بيانية وتجميع الأحداث وينعكس في عرض على قمم الرسم البياني. تبين الأحداث خارج الأبواب الحطام، ونوى المتدهورة شديدة، أو المجاميع الأخرى. ح بي يتوافق مع كثافة الأسفار التي تقاس بوحدات التعسفي. وتناقش طرق استكشاف الأخطاء وإصلاحها لمنع تدهور عينة داخل النص. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57134/57134fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
اندوريدوبليكيشن الخلافات بين الأنسجة
سبق أبلغنا أن أنسجة لب درنة لديها مستويات أكبر بكثير من اندوريدوبليكيشن من أنسجة اللحاء16. لتأكيد وتوسيع هذا ونحن ننظر في مستويات اندوريدوبليكيشن من ثلاثة أنسجة مختلفة في عام متفوقة: لب، بيريميدولاري حمة واللحاء، تتكرر في ثلاث نسخ مع أحداث بوابة 2,000 كل عينة. وأكدت النتائج التي توصلنا إليها ملاحظتنا السابقة أن أنسجة لب لديه أكبر بكثير من الصناعات الاستخراجية من الأنسجة القشرية مع وسائل اندوسيكليس 1.79 و 1.12 كل خلية، على التوالي (p = 0.018؛ الطالب الاختبار t). بعض الشيء المثير للدهشة، أظهرت صورة مماثلة لقشرة لحمه النسيج وكان أيضا تختلف اختلافاً كبيرا عن أنسجة لب (يعني = 1.14؛ p = 0.013؛ الطالب الاختبار t). يتم تلخيص هذه النتائج في الشكل 4.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57134/57134fig4.jpg"> الشكل 4: اندوريدوبليكيشن في الأنسجة الثلاثة من عام متفوقة. رسوم بيانية لليف (A) وقشرة الدرنات (ب)، حمة (ج) وأنسجة لب (د) تظهر جنبا إلى جنب مع الصناعات الاستخراجية قيمة محسوبة من تلك الرسوم البيانية. الاختلافات في الوفرة النسبية لنواة تضم كل ذروة بادية للعيان، لا سيما بين أنسجة النبات والدرنات. ج-عرض قيم لكل ذروة هي أيضا. ح بي يتوافق مع كثافة الأسفار التي تقاس بوحدات التعسفي. يعني إجراء مقارنات للصناعات الاستخراجية أنسجة الدرنات يتم عرضها في ه حيث تشير العلامة النجمية إلى فرق كبير (ف < 0.05) وإظهار أشرطة الخطأ المعياري. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57134/57134fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
تأثير حجم الدرنات و ploidy
نحن ذكرت سابقا أن درنات مختلفة الحجم ولكن نضج مماثل النمط وراثي معين، لم يتم عرض فرق مقابلة في الصناعات الاستخراجية16. نحن تهدف إلى تأكيد هذه النتيجة، فضلا عن تقييم العلاقة بين بلويدي واندوريدوبليكيشن. استخدمنا لهذه التجربة، replicates ثلاثة من نسيج حمة الأنماط الجينية المختلفة الثلاثة: عام متفوقة (4 x)، VT_SUP_19 (2x) وهو ديهابلويد المستخرجة من عام متفوقة ب التلقيح بركل17، VT_SUP_19 x 4 وديهابلويد الضعف 18 اسوي إلى VT_SUP_19. قمنا بتضمين مجموعة من replicates الصغيرة والكبيرة (90-130 غ) (< ز 35) الدرنات لعام العليا بينما الدرنات للأنماط الجينية الأخرى اثنين ز 90 – 130. كانت جميع الدرنات المحصودة من الدفيئة تزرع النباتات في مرحلة النضج الكامل، أي قمم النباتات قد سينيسسيد. لاحظنا فرق كبير بين VT_SUP_19 والسلف متفوقة (p = 0.04)؛ ومع ذلك، كان هناك لا يوجد فرق كبير بين VT_SUP_19 و VT_SUP_19 4 x (p = 0.69). يشير هذا إلى أن بينما هناك مكون وراثية المحتمل إلى اندوريدوبليكيشن، كغير المقنعة بتخفيض الجينوم، هو لا تمليها ploidy، على الأقل في هذه الخلفية. وأخيراً، مرة أخرى لاحظنا لا اختلافات كبيرة بين عام الكبيرة والصغيرة الدرنات متفوقة كما هو موضح في الشكل 5.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57134/57134fig5.jpg"> الرقم 5: اندوريدوبليكيشن في اثنين من أحجام الدرنات متفوقة عام والنباتات (VT_Sup_19) وتيترابلويد (VT_Sup_19 4 x) المشتقات المالية- ويبين الرسم البياني بار يعني الصغيرة (< ز 35) والكبيرة (90-130 غ) عام الدرنات متفوقة، فضلا عن الدرنات الكبيرة (90-130 غ) ديهابلويد VT_SUP_19 وديهابلويد تضاعف اسوي VT_SUP_19 4 x. اختلافات كبيرة (ف < 0.05) المشار إليها بواسطة تقرير رسالة الاتصال. أشرطة الخطأ تصور الانحراف المعياري. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57134/57134fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Endoreduplication by Flow Cytometry of Isolated Tuber Protoplasts at JoVE.com

Measuring Endoreduplication by Flow Cytometry of Isolated Tuber Protoplasts

قياس اندوريدوبليكيشن بقياس التدفق الدرنات المعزولة بروتوبلاستس

البروتوكول الموضحة هنا طريقة لقياس اندوريدوبليكيشن داخل درنات البطاطس (البطاطا). أنه يتضمن خطوات استخراج بلاسموليسيس وجبلة مجردة لتقليل الضوضاء والحطام في تحليل سيتوميتريك تدفق المتلقين للمعلومات.

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated ...

measuring-endoreduplication-flow-cytometry-isolated-tuber

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

10.1K Views.  Virginia Tech. البروتوكول الموضحة هنا طريقة لقياس اندوريدوبليكيشن داخل درنات البطاطس (البطاطا). أنه يتضمن خطوات استخراج بلاسموليسيس وجبلة مجردة لتقليل الضوضاء والحطام في تحليل سيتوميتريك تدفق المتلقين للمعلومات.

Video: Measuring Endoreduplication by Flow Cytometry of Isolated Tuber Protoplasts

IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic principle extends that of sandwich ELISA, wherein the captured primary analyte can be detected together with other molecules physically associated within multiprotein complexes. The procedure involves covalent coupling of polystyrene latex microbeads with immunoprecipitating monoclonal antibodies (mAb) specific for a protein of interest, incubating these beads with cell lysates, probing captured protein complexes with fluorochrome-conjugated probes, and analyzing bead-associated fluorescence by flow cytometry. IP-FCM is extremely sensitive, allows analysis of proteins in their native (non-denatured) state, and is amenable to either semi-quantitative or quantitative analysis. As additional advantages, IP-FCM requires no genetic engineering or specialized equipment, other than a flow cytometer, and it can be readily adapted for high-throughput applications.

The IP-FCM method is presented, which allows a sensitive, robust, biochemical assessment of native protein-protein interactions, without requiring genetic engineering or large sample sizes.

IP - FCM : مناعي التي كشفتها التدفق الخلوي

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic ...

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

قياس الكمي GLUT4 إزفاء إلى غشاء البلازما التي التدفق الخلوي

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

تدفق تنقية الخلوي للخلايا الفأر الانتصافي

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating cells. Cell cycle division is an integral part of growth and reproduction and deregulation of key cell cycle components have been implicated in the precipitating events of carcinogenesis 1,2. Molecular agents in anti-cancer therapies frequently target biological pathways responsible for the regulation and coordination of cell cycle division 3. Although cell cycle kinetics tend to vary according to cell type, the distribution of cells amongst the four stages of the cell cycle is rather consistent within a particular cell line due to the consistent pattern of mitogen and growth factor expression. Genotoxic events and other cellular stressors can result in a temporary block of cell cycle progression, resulting in arrest or a temporary pause in a particular cell cycle phase to allow for instigation of the appropriate response mechanism. 
The ability to experimentally observe the behavior of a cell population with reference to their cell cycle progression stage is an important advance in cell biology. Common procedures such as mitotic shake off, differential centrifugation or flow cytometry-based sorting are used to isolate cells at specific stages of the cell cycle 4-6. These fractionated, cell cycle phase-enriched populations are then subjected to experimental treatments. Yield, purity and viability of the separated fractions can often be compromised using these physical separation methods. As well, the time lapse between separation of the cell populations and the start of experimental treatment, whereby the fractionated cells can progress from the selected cell cycle stage, can pose significant challenges in the successful implementation and interpretation of these experiments.
Other approaches to study cell cycle stages include the use of chemicals to synchronize cells. Treatment of cells with chemical inhibitors of key metabolic processes for each cell cycle stage are useful in blocking the progression of the cell cycle to the next stage. For example, the ribonucleotide reductase inhibitor hydroxyurea halts cells at the G1/S juncture by limiting the supply of deoxynucleotides, the building blocks of DNA. Other notable chemicals include treatment with aphidicolin, a polymerase alpha inhibitor for G1 arrest, treatment with colchicine and nocodazole, both of which interfere with mitotic spindle formation to halt cells in M phase and finally, treatment with the DNA chain terminator 5-fluorodeoxyridine to initiate S phase arrest 7-9. Treatment with these chemicals is an effective means of synchronizing an entire population of cells at a particular phase. With removal of the chemical, cells rejoin the cell cycle in unison. Treatment of the test agent following release from the cell cycle blocking chemical ensures that the drug response elicited is from a uniform, cell cycle stage-specific population. However, since many of the chemical synchronizers are known genotoxic compounds, teasing apart the participation of various response pathways (to the synchronizers vs. the test agents) is challenging. 
Here we describe a metabolic labeling method for following a subpopulation of actively cycling cells through their progression from the DNA replication phase, through to the division and separation of their daughter cells. Coupled with flow cytometry quantification, this protocol enables for measurement of kinetic progression of the cell cycle in the absence of either mechanically- or chemically- induced cellular stresses commonly associated with other cell cycle synchronization methodologies 10. In the following sections we will discuss the methodology, as well as some of its applications in biomedical research.

Tracking subtle changes in the progression and kinetics of cell cycle stages can be accomplished by use of a combination of metabolic labeling of nucleic acids with BrdU and total genomic DNA staining via Propidium Iodide. This method avoids the need of chemical synchronization of cycling cells, thereby preventing the introduction of non-specific DNA damage, which in turn affects cell cycle progression.

قياس حركية تقدم دورة الخلية مع وصفها الأيض والتدفق الخلوي

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

الأمثل أساليب النمذجة وتلوين لرصد انتشار استخدام الأصباغ انقسام الخلية خلية تتبع

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is a simple and very efficient method for the determination of the osmotic water permeability coefficient (Pf) in plant protoplasts, applicable in principle also to other spherical cells such as frog oocytes. The first step of the assay is the isolation of protoplasts from the plant tissue of interest by enzymatic digestion into a chamber with an appropriate isotonic solution. The second step consists of an osmotic challenge assay: protoplasts immobilized on the bottom of the chamber are submitted to a constant perfusion starting with an isotonic solution and followed by a hypotonic solution. The cell swelling is video recorded. In the third step, the images are processed offline to yield volume changes, and the time course of the volume changes is correlated with the time course of the change in osmolarity of the chamber perfusion medium, using a curve fitting procedure written in Matlab (the &#8216;PfFit&#8217;), to yield Pf.

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the osmotic water permeability coefficient (Pf) of cells can help understand the regulatory mechanisms of aquaporins (AQPs). Pf determination in spherical plant cell protoplasts presented here involves protoplasts isolation and numerical analysis of their initial rate of volume change as a result of an osmotic challenge during constant bath perfusion.

قياس معامل نفاذية المياه الأسموزي (P<sub&gt; و</sub&gt;) من خلايا كروية: Protoplasts محطة معزولة كمثال

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Calcium is involved in numerous physiological and pathophysiological signaling pathways. Live cell imaging requires specialized equipment and can be time consuming. A quick, simple method using a flow cytometer to determine relative changes in cytosolic calcium in adherent epithelial cells brought into suspension was optimized.

قياس الكالسيوم عصاري خلوي في الخلايا الظهارية الكلوية بواسطة التدفق الخلوي

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and pathophysiology. This protocol describes a technique where mitochondria isolated from rodent tissue are immunolabeled and analyzed by flow cytometry. Mitochondria are isolated from rodent spinal cords and subjected to a rapid enrichment step so as to remove myelin, a major contaminant of mitochondrial fractions prepared from nervous tissue. Isolated mitochondria are then labeled with an antibody of choice and a fluorescently conjugated secondary antibody. Analysis by flow cytometry verifies the relative purity of mitochondrial preparations by staining with a mitochondrial specific dye, followed by detection and quantification of immunolabeled protein. This technique is rapid, quantifiable and high-throughput, allowing for the analysis of hundreds of thousands of mitochondria per sample. It is applicable to assess novel proteins at the mitochondrial surface under normal physiological conditions as well as the proteins that may become mislocalized to this organelle during pathology. Importantly, this method can be coupled to fluorescent indicator dyes to report on certain activities of mitochondrial subpopulations and is feasible for mitochondria from the central nervous system (brain and spinal cord) as well as liver.

Described here is a method to detect and quantify mitochondrial outer membrane proteins by immunolabeling of mitochondria isolated from rodent tissue and analysis by flow cytometry. This method can be extended to assess functional aspects of mitochondrial subpopulations.

مناعي للبروتينات الغشاء الخارجي بواسطة التدفق الخلوي من الميتوكوندريا المعزولة

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and ...

LED Thermo Flow &#8212; Combining Optogenetics with Flow Cytometry

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the controlled delivery of light to the cell sample and hence the most popular tools for optogenetic studies are microscopy-based cell analyses and in vitro experiments. The flow cytometer has major advantages over a microscope, including the ability to rapidly measure thousands of cells at single cell resolution. However, it is not yet widely used in optogenetics. Here, we present a device that combines the power of optogenetics and flow cytometry: the LED Thermo Flow. This device illuminates cells at specific wavelengths, light intensities and temperatures during flow cytometric measurements. It can be built at low cost and be used with most common flow cytometers. To demonstrate its utility, we characterized the photoswitching kinetics of Dronpa proteins in vivo and in real time. This protocol can be adapted to almost all optically controlled substances and substantially expands the set of possible experiments. More importantly, it will greatly simplify the discovery and development of new optogenetic tools.

Optically controlled substances are powerful tools to study signaling pathways. To expand the spectrum of possible experiments, we developed a device for studying optically controlled substances in real time using flow cytometry: the LED Thermo Flow.

LED الحرارية تدفق - الجمع بين علم البصريات الوراثي مع التدفق الخلوي

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

تحليل معلقات خلية معزولة من الأنسجة الصلبة من قبل الطيفي التدفق الخلوي

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...