وأيد هذا العمل المعاهد الوطنية للصحة منح AG040191 و AG054566 على VML. أجرى هذا البحث في حين كان VML مستلم عفر "منحة بحثية" من "الاتحاد الأمريكي" "بحوث الشيخوخة".

<ol>
	<li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+stress+and+apoptosis.">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).</li><li>Tanenbaum, M. E., Stern-Ginossar, N., Weissman, J. S., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mRNA+translation+during+mitosis.">Regulation of mRNA translation during mitosis.</a> Elife. 4, (2015).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li><li>Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+translational+profiling+by+ribosome+footprinting.">Genome-wide translational profiling by ribosome footprinting.</a> Methods Enzymol. 470, 119-142 (2010).</li><li>Brar, G. A., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling+reveals+the+what,+when,+where+and+how+of+protein+synthesis.">Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 651-664 (2015).</li><li>Wolin, S. L., Walter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+pausing+and+stacking+during+translation+of+a+eukaryotic+mRNA.">Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA.</a> EMBO J. 7 (11), 3559-3569 (1988).</li><li>Guo, H., Ingolia, N. T., Weissman, J. S., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+microRNAs+predominantly+act+to+decrease+target+mRNA+levels.">Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels.</a> Nature. 466 (7308), 835-840 (2010).</li><li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments.">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nat Protoc. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li><li>Bartholomaus, A., Del Campo, C., Ignatova, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+non-standardized+biases+of+ribosome+profiling.">Mapping the non-standardized biases of ribosome profiling.</a> Biol Chem. 397 (1), 23-35 (2016).</li><li>Larsson, O., Sonenberg, N., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=anota:+Analysis+of+differential+translation+in+genome-wide+studies.">anota: Analysis of differential translation in genome-wide studies.</a> Bioinformatics. 27 (10), 1440-1441 (2011).</li><li>Zhong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RiboDiff:+detecting+changes+of+mRNA+translation+efficiency+from+ribosome+footprints.">RiboDiff: detecting changes of mRNA translation efficiency from ribosome footprints.</a> Bioinformatics. 33 (1), 139-141 (2017).</li><li>Xiao, Z., Zou, Q., Liu, Y., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+assessment+of+differential+translations+with+ribosome+profiling+data.">Genome-wide assessment of differential translations with ribosome profiling data.</a> Nat Commun. 7, 11194 (2016).</li><li>Chung, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+duplex-specific+nuclease+in+ribosome+profiling+and+a+user-friendly+software+package+for+Ribo-seq+data+analysis.">The use of duplex-specific nuclease in ribosome profiling and a user-friendly software package for Ribo-seq data analysis.</a> RNA. 21 (10), 1731-1745 (2015).</li><li>Popa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RiboProfiling:+a+Bioconductor+package+for+standard+Ribo-seq+pipeline+processing.">RiboProfiling: a Bioconductor package for standard Ribo-seq pipeline processing.</a> F1000Res. 5, 1309 (2016).</li><li>Dunn, J. G., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastid:+nucleotide-resolution+analysis+of+next-generation+sequencing+and+genomics+data.">Plastid: nucleotide-resolution analysis of next-generation sequencing and genomics data.</a> BMC Genomics. 17 (1), 958 (2016).</li><li>Baranov, P. V., Michel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+translation+with+ribosome+profiling+spectra.">Illuminating translation with ribosome profiling spectra.</a> Nat Methods. 13 (2), 123-124 (2016).</li><li>Calviello, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+actively+translated+open+reading+frames+in+ribosome+profiling+data.">Detecting actively translated open reading frames in ribosome profiling data.</a> Nat Methods. 13 (2), 165-170 (2016).</li><li>Michel, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RiboGalaxy:+A+browser+based+platform+for+the+alignment,+analysis+and+visualization+of+ribosome+profiling+data.">RiboGalaxy: A browser based platform for the alignment, analysis and visualization of ribosome profiling data.</a> RNA Biol. 13 (3), 316-319 (2016).</li><li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet J. 17 (1), 10-12 (2011).</li><li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome.">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).</li><li>Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTSeq--a+Python+framework+to+work+with+high-throughput+sequencing+data.">HTSeq--a Python framework to work with high-throughput sequencing data.</a> Bioinformatics. 31 (2), 166-169 (2015).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).</li><li>van den Elzen, A. M., Schuller, A., Green, R., Seraphin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dom34-Hbs1+mediated+dissociation+of+inactive+80S+ribosomes+promotes+restart+of+translation+after+stress.">Dom34-Hbs1 mediated dissociation of inactive 80S ribosomes promotes restart of translation after stress.</a> EMBO J. 33 (3), 265-276 (2014).</li><li>Guydosh, N. R., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dom34+rescues+ribosomes+in+3'+untranslated+regions.">Dom34 rescues ribosomes in 3' untranslated regions.</a> Cell. 156 (5), 950-962 (2014).</li><li>Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling:+new+views+of+translation,+from+single+codons+to+genome+scale.">Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale.</a> Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).</li><li>Gerashchenko, M. V., Lobanov, A. V., Gladyshev, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+ribosome+profiling+reveals+complex+translational+regulation+in+response+to+oxidative+stress.">Genome-wide ribosome profiling reveals complex translational regulation in response to oxidative stress.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (43), 17394-17399 (2012).</li><li>Weinberg, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+ribosome-footprint+and+mRNA+measurements+provide+insights+into+dynamics+and+regulation+of+yeast+translation.">Improved ribosome-footprint and mRNA measurements provide insights into dynamics and regulation of yeast translation.</a> Cell Rep. 14 (7), 1787-1799 (2016).</li><li>Park, J. E., Yi, H., Kim, Y., Chang, H., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+poly(A)+tail+and+translation+during+the+somatic+cell+cycle.">Regulation of poly(A) tail and translation during the somatic cell cycle.</a> Mol Cell. 62 (3), 462-471 (2016).</li><li>Howard, M. T., Carlson, B. A., Anderson, C. B., Hatfield, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+redefinition+of+UGA+codons+is+regulated+by+selenium+availability.">Translational redefinition of UGA codons is regulated by selenium availability.</a> J Biol Chem. 288 (27), 19401-19413 (2013).</li><li>Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribonuclease+selection+for+ribosome+profiling.">Ribonuclease selection for ribosome profiling.</a> Nucleic Acids Res. 45 (2), e6 (2017).</li><li>Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+inhibitors+cause+abnormalities+in+ribosome+profiling+experiments.">Translation inhibitors cause abnormalities in ribosome profiling experiments.</a> Nucleic Acids Res. 42 (17), e134 (2014).</li><li>O'Connor, P. B., Andreev, D. E., Baranov, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+survey+of+the+relative+impact+of+mRNA+features+on+local+ribosome+profiling+read+density.">Comparative survey of the relative impact of mRNA features on local ribosome profiling read density.</a> Nat Commun. 7, 12915 (2016).</li></ol>

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

النهج Seq ريبو الذي برز كتقنية قوية لتحليل مرناً الترجمة في فيفو على نطاق الجينوم المستوى 3. الدراسات باستخدام هذا النهج، الذي يسمح برصد الترجمة مع القرار كودون واحد، قد ساهم في فهمنا للتنظيم متعدية الجنسيات. وعلى الرغم من مزاياه، Seq ريبو نقائص عديدة. شظايا الريباسي الحمض النووي الريبي (الرنا الريباسي) دائماً شارك المنقي أثناء عزلة أقدام محمية الريبوسوم تناقص محصول ما يلي تسلسل المفيدة التي يمكن الحصول عليها في ريبو-Seq تجارب 9،25. وتبين البيانات المتوفرة لدينا أن تلوث الرنا الريباسي يمكن أن تسهم بما يصل إلى 40-50% من جميع ما يلي: (الشكل 8). إحدى الطرق للتغلب على هذا القيد زيادة عمق التسلسل. ينبغي إجراء جولات إضافية من التسلسل حتى يتم تحقيق العدد المطلوب من تسلسل ما يلي لكل من العينات التي تم تحليلها. ويبين تحليل المكتبات تسلسل إعدادها باستخدام بروتوكول لدينا أنه يمكن الحصول على أكثر من 5 مليون بصمة ما يلي: لكل مكتبة البصمة، عندما يتم متعدد عينات 12 معا في عمل قياسية 50-بي بي واحد-تشغيل على منصة إيلومينا هيسيق 2000. ومع ذلك، إذا لوحظ تلوث كبيرة مع الرنا الريباسي، يمكن إجراء خطوة إزالة الرنا الريباسي اختيارية.
واحدة من استراتيجيات لإزالة الرنا الريباسي تلويث شظايا من مكتبات البصمة استخدام التهجين الاختزالي مع النوكليوتيد بيوتينيلاتيد كما هو موضح سابقا 8،26،27. وبدلاً من ذلك، يمكن إزالة الرنا الريباسي تلويث ما يلي باستخدام مجموعات استنفاد الرنا الريباسي المتاحة تجارياً. لهذا، يمكن أداء الباحثين استنفاد الرنا الريباسي الشظايا المنقي البصمة 3 '--محول-متصلة من الخطوة 5.4. التالي استنفاد الرنا الريباسي، البصمة يمكن عجلت العينات وتستخدم مباشرة للنسخ العكسي (الخطوة 6) كما هو موضح في البروتوكول.
بالإضافة إلى تنقية مونوسوميس استخدام تجزئة التدرج السكروز المبينة في البروتوكول لدينا، أساليب عدة وضعت التي تستخدم تنقية المستندة إلى عمود 28 وتنبيذ فائق من خلال وسادة سكروز 8 ،29. في حين أن هذه الأساليب يمكن تسريع عملية إعداد مكتبة البصمة وهي صعبة من الناحية التقنية أقل بالمقارنة مع وجود التدرج السكروز، أنها لا تسمح التحليل النوعي من مونوسوميس المنقي وكفاءة نوكلياسي الخطوة الهضم. في الآونة الأخيرة، أظهرت اختيار nuclease تؤثر على كفاءة تنقية محمية الريبوسوم الأجزاء رنا في 30من مختلف الأنواع. وفي حين قد ثبت رناسي أنا بنشاط قوي في الخميرة الخلية ليساتيس، نشاطها تؤثر على سلامة ريبوسوم في الأنسجة الماوس فضلا عن ذباب الفاكهة. ولذلك، ينبغي أن يكون الأمثل بالاختيار وتركيز نوكلاس عند اعتماد هذا البروتوكول للأنواع الأخرى.
ثمة اعتبار هام آخر هو استخدام مثبطات الترجمة. معظم البروتوكولات للتنميط الريبوسوم وعادة ما تشمل علاج الخلايا مع مثبطات استطالة، مثل سيكلوهيكسيميدي أو هارينجتونيني، منعا لجولة إعادة ريبوسوم أثناء الحصاد 3الخلية. واحدة من القيود المفروضة على استخدام مثبطات الترجمة أن المخدرات منتشر تدريجيا في الخلية، الذي يحفز تثبيط تدريجي من ريبوسوم 31. وعلاوة على ذلك، لا تمنع الأدوية الشروع في الترجمة أو إنهائها. نتيجة لذلك، ريبوسوم تتراكم في كودون بداية غير متناسب وتنضب في إيقاف كودون 8،،من2731. من أجل الحد من هذه القطع الأثرية، اخترنا فلاش تجميد الخلايا في النتروجين السائل، وتعامل مع سيكلوهيكسيميدي في وقت الاستخراج في تحلل المخزن المؤقت فقط.
رغم وجود عدد كبير نسبيا من التقارير التي استخدمت ريبو-Seq في الأنواع المختلفة، تفتقر إلى بروتوكولات موحدة لإجراء تحليل Seq ريبو. نتيجة لذلك، لا يمكن مقارنة ريبو-تسلسل البيانات التي تم إنشاؤها بواسطة مختبرات مختلفة مباشرة. على سبيل المثال، كشفت مقارنة لنشر الريبوسوم التنميط datasets اختلافات كبيرة في النتائج بين الدراسات 32. وهذا يرجع جزئيا إلى التحسينات المستمرة التي بذلت كبروتوكول تطورت على مدى السنوات العديدة الماضية. وبالإضافة إلى ذلك، تعديل العديد من الباحثين الريبوسوم التنميط البروتوكول على اعتماده للاحتياجات المحددة لهذه الدراسة أو نموذج نظام 9،25. مواصلة توحيد الريبوسوم التنميط البروتوكول فضلا عن تحليل البيانات والتطبيع، سيتيح منع بعض التحيزات التجريبية وضمان القياس الكمي الدقيق واستنساخه في فيفو الترجمة.

الترجمة مرناً هو إحدى العمليات الأساسية في الخلية، والتي تلعب دوراً هاما في تنظيم التعبير البروتين. ولذلك، الترجمة مرناً مراقبة شديدة واستجابة لمختلف المحفزات الفسيولوجية الداخلية والخارجية 1،2. ومع ذلك، تظل آليات التنظيم متعدية المداريين. هنا، نحن تصف البروتوكول للتحديد الكمي للترجمة في مهدها الخميرة على نطاق الجينوم بالتنميط الريبوسوم. والهدف العام لأسلوب التنميط الريبوسوم هو دراسة وتحديد مقدار ترجمة مرناس محددة تحت ظروف مختلفة الخلوية. هذا الأسلوب يستخدم التسلسل الجيل القادم لتحليل كمي شغل الريبوسوم في جميع أنحاء الجينوم ويتيح رصد معدل البروتين التوليف في فيفو كودون واحد القرار 3،4. حاليا، هذا الأسلوب يوفر الوسائل الأكثر تقدما لقياس مستويات البروتين الترجمة، وقد ثبت أن تكون أداة اكتشاف مفيدة توفر معلومات يمكن الكشف عنها بغيرها من التقنيات المتوفرة حاليا، مثل [ميكروارس] أو ترجمة الدولة مصفوفة تحليل (تسا) 5. الريبوسوم التنميط تقارير عن التغيرات مجتمعة في مستويات النص والإخراج متعدية الجنسيات، كما أنه يوفر الكثير من حساسية أكبر مقارنة بالأساليب الأخرى.
يقوم هذا النهج على تسلسل العميقة المحمية الريبوسوم مرناً شظايا 3. أثناء ترجمة البروتين، حماية ريبوسوم ~ 28 nt أجزاء من مرناً (تسمى أقدام) 6. قبل تحديد تسلسل أجزاء محمية الريبوسوم، يمكن تعيين موضع ريبوسوم في مرناً المترجمة Seq ريبو وتحديد المناطق التي من مرناً يرجح أن تترجم بنشاط البروتين 3،7. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن نقيس الكمية ترجمة مرناً بإحصاء عدد المسارات التي تتوافق مع نسخة مرناً معين.
بغية عزل الأجزاء المحمية الريبوسوم، تعامل ليساتيس خلية في البداية مع مثبط ترجمة إلى المماطلة ريبوسوم تليها الهضم ريبونوكليسي. بينما هي أفسدتها الحرة مرناً وأجزاء من مرناس المترجمة التي لا تحميها ريبوسوم ribonuclease، يمكن استرداد الشظايا مرناً محمية الريبوسوم بتنقية مجمعات البصمة الريبوسوم سليمة. هذه آثار أقدام مرناً ثم تحويلها إلى مكتبة كدنا وتحليلها بواسطة تسلسل العميق (الشكل 1). وبالتوازي مع الريبوسوم التنميط، المستخرجة من نفس العينة سليمة مرناً ومتسلسلة. بمقارنة مستوى الترجمة التي حددها ريبو-Seq مع قياسات الوفرة مرناً، يمكننا تحديد الجينات التي هي على وجه التحديد أعلى أو أسفل-التنظيم على مستوى الترجمة وحساب كفاءة الترجمة مرناً على مستوى المنظومة الجينوم. بينما البروتوكول الموصوفة في هذه المقالة محددة للخميرة، ينبغي أيضا مفيدة للباحثين الذين سيحاولون وضع البروتوكول ريبو-Seq في النظم الأخرى.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;M membrane filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>HVLP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mL centrifugal filters (100 kDa MWCO)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC510024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl, pH 7.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9850G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl, pH 7.5 (pH 8.0 at 4&#176;C)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15567-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X TBE buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% TBE-urea gel</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EC6875BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15% TBE-urea gel</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EC6885BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 M MgCl2</td>
			<td>RPI</td>
			<td>M24500-10.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X TBE-urea sample buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M NaOAc, pH 5.5</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39; Deadenylase (10 U/&#956;L)</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>DA11101K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X Nucleic acid sample loading buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8% TBE gel</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EC6215BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue light transilluminator</td>
			<td>Clare Chemical Research</td>
			<td>DR-46B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chrome-steel beads, 3.2 mm</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>11079132c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogrinder</td>
			<td>Biospec product</td>
			<td>3110BX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>RPI</td>
			<td>C81040-5.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Acquisition System</td>
			<td>DATAQ Instruments</td>
			<td>DI-245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0447L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gradient fractionation system</td>
			<td>Brandel</td>
			<td>BR-184X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-fidelity DNA polymerase (2,000 U/mL)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0530S</td>
			<td>Supplied with 5X Phusion HF Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Next-generation sequencing library quantification kit</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KK4824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleic acid gel stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XE-90 ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A94471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(A) mRNA isolation kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>61011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rec J exonuclease (10 U/&#956;L)</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>RJ411250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse transcriptase (200 U/&#956;L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18080093</td>
			<td>Supplied with 5X first-strand buffer and 0.1 M DTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA fragmentation buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E6186A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase I (100 U/&#956;L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM2295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor (20 U/&#956;L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM2696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone rubber caps</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>2008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ssDNA ligase (100 U/&#956;L)</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>CL9021K</td>
			<td>Supplied with 10X CircLigase II buffer and 50 mM MnCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel microvials, 1.8 mL</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>2007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>RPI</td>
			<td>S24060-5000.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW-41 Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>New Era Pump Systems</td>
			<td>NE-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 polynucleotide kinase (10,000 U/mL)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0201S</td>
			<td>Supplied with 10X T4 polynucleotide kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA ligase 2 truncated KQ (200,000 U/mL)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0373S</td>
			<td>Supplied with 10X T4 RNA ligase buffer and 50% PEG8000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1851148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thinwall polyallomer tubes, 13.2 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV monitor</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7318160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saccharomyces cerevisiae strain BY4741</td>
			<td>Open Biosystems</td>
			<td>YSC1048</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome-wide quantification of translation in budding yeast by ribosome profiling

ترجمة مرناً إلى البروتينات عملية معقدة تنطوي على عدة طبقات من اللائحة. كثيرا ما يفترض أن تعكس التغييرات في النسخ مرناً التغييرات في تخليق البروتين، ولكن الكثير من الاستثناءات قد لوحظت. في الآونة الأخيرة، برزت تقنية تسمى الريبوسوم التنميط (أو Seq ريبو) كطريقة قوية تتيح تحديد الهوية، مع درجة عالية من الدقة، أي مناطق مرناً يتم ترجمتها إلى بروتينات والتحديد الكمي للترجمة على مستوى المنظومة الجينوم. نقدم هنا، بروتوكول معممة على نطاق الجينوم التقدير الكمي للترجمة باستخدام Seq ريبو في مهدها الخميرة. وباﻹضافة إلى ذلك، الجمع بين البيانات ريبو-Seq مع قياسات الوفرة مرناً يسمح لنا بقياس كفاءة الترجمة الآلاف من النصوص مرناً في نفس العينة في وقت واحد، ومقارنة التغيرات في هذه المعلمات في الاستجابة إلى تجريبية التلاعب أو في حالات فسيولوجية مختلفة. يصف لنا بروتوكول مفصل لجيل أقدام الريبوسوم باستخدام نوكلاس الهضم، عزل مجمعات البصمة الريبوسوم سليمة عن طريق تجزئة السكروز التدرج، وإعداد مكتبات الحمض النووي لتسلسل العميقة جنبا إلى جنب مع المناسبة نوعية الضوابط اللازمة لضمان دقة التحليل في فيفو الترجمة.

كانت خطوط الأنابيب مفصلة لتحليل بيوينفورماتيك من الريبوسوم التنميط البيانات المذكورة سابقا 8،9. وباﻹضافة إلى ذلك، وضعت عدة مجموعات بحثية أدوات المعلوماتية الحيوية لتحليل التعبير الجيني التفاضلي وتجهيز البيانات التسلسل، التي محددة الريبوسوم التنميط الأسلوب 10،11،12 ،13،،من1415،16،،من1718. الخطوة الأولى في تحليل البيانات ريبو-Seq demultiplexing والتشذيب المحول تسلسل 3 ' أجاتكجاجاجكاكاكجتكت باستخدام البرمجيات كوتادابت 19. ثم تتفق على ما يلي تسلسل ضد الكشف، مثل الرنا الريباسي والحمض الريبي النووي النقال، استخدام Bowtie 20 لإزالة تلويث متواليات، غير الترميز وثم يتم تعيين ما يلي: أن لا تتم محاذاة إلى جينوم الخميرة. قراءة عد كل الجينات يمكن أن يقيمها ثم هتسيق-العد البرمجيات 21، ويتم التعرف على الجينات الأثران عن استخدام DESeq2 22.
يبين الشكل 8 الممثل نتائج التحليل الكمي للترجمة في hbs1Δ،من 2324 الخميرة الحذف المسخ التي تم الحصول عليها باستخدام بروتوكول لدينا. أولاً، قمنا بتقييم عدد ونسبة من القراءات التي تناظر رنا غير الترميز (مثل ررناس) التي تم الحصول عليها بعد تسلسل البصمة ومرناً من المكتبات التي تم إنشاؤها للبرية من نوع الخلايا والمسخ hbs1Δ. وجدنا أنه، حتى بدون أي الرنا الريباسي استنفاد الخطوات (مناقشتها أدناه)، من 50 إلى 60 في المائة من جميع ما يلي التسلسل في البصمة لدينا مكتبات تتوافق مع الشظايا البصمة محمية الريبوسوم (الشكل 8 أ). وفي المقابل، 3 في المائة فقط من شظايا المستمدة من الرنا الريباسي لوحظت في مكتبات مرناً مما يدل على أن العزلة poly(A) مرناً يسمح للقضاء الفعال على ما يلي: الرنا الريباسي. معا، كنا قادرين على الحصول على أكثر من 10 مليون قراءة بصمة لكل من عينات البصمة التسلسل 2 replicates. تقييم التغير من مكتبة الجيل وإمكانية تكرار نتائج البيانات، نحن نحلل عادة replicates البيولوجي المستقلة اثنين على الأقل في كل حالة تجريبية. المكتبات عينة البصمة ومرناً وتظهر إمكانية تكرار نتائج جيدة مع معامل ارتباط Pearson R ~ 0.99 بين العينات المطابقة (8B الشكل).
بالإضافة إلى تقييم مستوى الترجمة البروتين على مستوى المنظومة الجينوم، الريبوسوم التنميط يسمح قياس التغيرات في كفاءة الترجمة بين الظروف التجريبية 3. لذلك، يستخدم قاسمة الخلية ليستي (لا تعامل مع ribonuclease) لعزل مرناً poly(A) وإعداد مكتبة تسلسل الحمض النووي الريبي. لأن البصمة مكتبة ومكتبة تسلسل الحمض النووي الريبي تعد تحت نفس الظروف التي تسيطر عليها، ويمكن أن تعزى إلى كل تكرار الفردية، يمكن مقارنة datasets Seq ريبو وتسلسل الحمض النووي الريبي مباشرة لتحديد الجينات التي تنظم بالتغيرات في مرناً النسخ، وكفاءة الترجمة، أو بتأثير مجتمعة. تحديد الجينات التي تنظم أعلى أو أسفل على وجه التحديد على مستوى الترجمة البروتين في الطور hbs1Δ، قمنا بحساب التغييرات في كفاءة الترجمة بقسمة قيم البصمة ربكم ربكم مرناً لكل من الجينات (الشكل 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56820/56820fig1.jpg"> 
رقم 1: نظرة عامة على البروتوكول ريبو-Seq. يمكن تنفيذ البروتوكول بأكمله في حوالي 11 يوما. يتم عرض الوقت المقدر لكل خطوة. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56820/56820fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56820/56820fig2.jpg"> 
رقم 2: إعداد التدرجات السكروز <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56820/56820fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56820/56820fig3.jpg"> 
الشكل 3: لمحات التدرج السكروز الممثل. (أ) الحصول على الشخصية السكروز التدرج للتحكم (لا تعامل مع رناسي أنا) عينة. (ب) من أجل استخراج الأجزاء رنا محمية الريبوسوم، ليساتيس خلية يتم التعامل مع رناسي أنا ح 1 في درجة حرارة الغرفة (RT). ثم يتم تجميع الكسور المقابلة إلى ذروة مونوسومال لاستخراج البصمة. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56820/56820fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56820/56820fig4.jpg"> 
الشكل 4: الحصول على صور الممثل من المواد الهلامية polyacrylamide 15% بعد T4 بولينوكليوتيدي كيناز العلاج. (أ) يظهر حجم الشريحة جل قصت حول nt 28 و 32 لعينات البصمة. (ب) خفض الشريحة جل حول 50-70 nt لعينات مرناً. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56820/56820fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56820/56820fig5.jpg"> 
الرقم 5: الحصول على صور الممثل من المواد الهلامية polyacrylamide 10% بعد النسخ العكسي- (أ) قطع الشريط العلوي ~ 128 nt لعينات البصمة، المقابلة لمنتج النسخ العكسي. (ب) خفض الفرقة حوالي 150-170 nt للعينات مرناً (الشريط العلوي). وتتوافق مع عصابات أقل التمهيدي RT. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56820/56820fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56820/56820fig6.jpg"> 
رقم 6: تنقية Polyacrylamide جل المكتبات تضخيم PCR. بكر المنتجات التي تم الحصول عليها بعد دورات 8، 10 و 12، و 14 من التضخيم مكتبة تم حلها في جل غير يشوه TBE 8%.حجم المكتبات البصمة كامل طول ~ 150 شركة بريتيش بتروليوم، بينما حجم المكتبات مرناً ~ 170-190 هناك تجنب الشريط السفلي التي لا تحتوي على إدراج.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56820/56820fig7.jpg"> 
رقم 7: تحليل بيواناليزير- (أ) ملامح بيواناليزير ممثل المكتبة بكر تضخيم البصمة. متوسط حجم المكتبة البصمة من المتوقع أن يكون من 148 إلى 152 nt. (ب) الملامح بيواناليزير ممثل مكتبة تسلسل الحصول على عينات مرناً. الحجم المتوقع للمكتبة مرناً من 170-190 nt. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56820/56820fig7large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56820/56820fig8.jpg"> 
الشكل 8: النتائج التمثيلية. (أ) عدد القراءات مرناً وبصمة الرنا الريباسي الحصول على عينة من نوع البرية والمسخ hbs1Δ. مجموع عدد القراءات المتولدة عن تسلسل يتطابق البيولوجية هما ترد البرية من نوع الخلايا والمسخ hbs1Δ. (ب) إمكانية تكرار نتائج القياسات البصمة ووفرة مرناً بين اثنين إنشاء نسخ متماثلة. يتم الإشارة إلى معاملات الارتباط بيرسون (R). (ج) ترانسكريبشونال والتغييرات متعدية الجنسيات في المسخ hbs1Δ. إلى حد كبير يتم تجميع الجينات تنظم أعلى وأسفل-وينظم في hbs1Δ وفقا لما إذا كانت تتأثر بتغيير في النسخ مرناً، كفاءة الترجمة، أو بتأثير مجتمعة. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56820/56820fig8large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>كبسولة تفجير</td>
			<td colspan="5">التسلسل</td>
			<td>فهرس</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 ' محول (100 نانوغرام/ميليلتر)</td>
			<td colspan="5">/5rApp/أجاتكجاجاجكاكاكجتكت/3ddC/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT التمهيدي</td>
			<td colspan="5">بجاتكجتكجاكتجتاجاكتكتجاكجتجتاجاتكتكجتجتكجككجتاتكات/iSp18/جتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكت</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>إلى الأمام بكر التمهيدي</td>
			<td colspan="5">آتجاتاكجكجاككاككجاجاتكتاكاكجتكاجاجتكتاكاجتككجاكج</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>الفهرس التمهيدي 1</td>
			<td colspan="5">كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتكجتجاتجتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكت</td>
			<td>أتكاكج</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>الفهرس التمهيدي 2</td>
			<td colspan="5">كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتاكاتكجتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكت</td>
			<td>كجاتجت</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>الفهرس التمهيدي 3</td>
			<td colspan="5">كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتجككتاجتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكت</td>
			<td>تتاجك</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>الفهرس التمهيدي 4</td>
			<td colspan="5">كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتجتكاجتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكت</td>
			<td>تجاككا</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>الفهرس التمهيدي 5</td>
			<td colspan="5">كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتكاكتجتجتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكت</td>
			<td>أكاجتج</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>الفهرس التمهيدي 6</td>
			<td colspan="5">كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتاتجكجتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكت</td>
			<td>جككات</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
الجدول 1: 3 ' تسلسل محول والتمهيدي.

Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling at JoVE.com

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

تنظيم متعدية الجنسيات دوراً هاما في السيطرة على وفرة البروتين. هنا، يمكننا وصف أسلوب الفائق للتحليل الكمي للترجمة في مهدها الخميرة Saccharomyces cerevisiae.

على نطاق الجينوم الكمي للترجمة في مهدها الخميرة بالتنميط الريبوسوم

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

genome-wide-quantification-translation-budding-yeast-ribosome

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

11.4K Views.  Boston University School of Medicine. تنظيم متعدية الجنسيات دوراً هاما في السيطرة على وفرة البروتين. هنا، يمكننا وصف أسلوب الفائق للتحليل الكمي للترجمة في مهدها الخميرة Saccharomyces cerevisiae.

Video: Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological processes. Affinity purification coupled to mass spectrometry (AP-MS) has become the method of choice for identifying protein-protein interactions. However, conventional AP-MS studies provide information on protein interactions, but the organizational information is lost. To address this issue, we developed a strategy to unravel the distinct functional assemblies a protein might be involved in, by resolving affinity-purified protein complexes prior to their characterization by mass spectrometry. Protein complexes isolated through affinity purification of a bait protein using an epitope tag and competitive elution are separated through blue native electrophoresis. Comparison of protein migration profiles through correlation profiling using quantitative mass spectrometry allows assignment of interacting proteins to distinct molecular entities. This method is able to resolve protein complexes of close molecular weights that might not be resolved by traditional chromatographic techniques such as gel filtration. With little more work than conventional AP-geLC-MS/MS, we demonstrate this strategy may in many cases be adequate for obtaining protein complex topological information concomitantly to identifying protein interactions.

Here we present protocols for affinity purification of protein complexes and their separation by blue native PAGE, followed by protein correlation profiling using label free quantitative mass spectrometry. This method is useful to resolve interactomes into distinct protein complexes.

حل تقارب تنقية البروتين المجمعات التي كتبها Blue الأصلية PAGE والبروتين الارتباط التنميط

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and organogenesis, as well as in multiple diseases. Numerous publications have convincingly shown that specific mechanisms tightly regulate mRNA translation. Increased interest in the translation-induced regulation of protein expression has led to the development of novel methods to study and follow de novo protein synthesis in cellulo. However, most of these methods are complex, making them costly and often limiting the number of mRNA targets that can be studied. This manuscript proposes a method that requires only basic reagents and a confocal fluorescence imaging system to measure and visualize the changes in mRNA translation that occur in any cell line under various conditions. This method was recently used to show localized translation in the subcellular structures of adherent cells over a short period of time, thus offering the possibility of visualizing de novo translation for a short period during a variety of biological processes or of validating changes in translational activity in response to specific stimuli.

This manuscript describes a method to visualize and quantify localized translation events in subcellular compartments. The approach proposed in this manuscript requires a basic confocal imaging system and reagents and is rapid and cost-effective.

الفلورة الكمية لقياس عالمية مترجمة ترجمة

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) coupled to tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) and isobaric labeling multiplexing capacity. Here, we introduce a deep-proteomics profiling protocol that combines 10-plex tandem mass tag (TMT) labeling with an extensive LC/LC-MS/MS platform, and post-MS computational interference correction to accurately quantitate whole proteomes. This protocol includes the following main steps: protein extraction and digestion, TMT labeling, 2-dimensional (2D) LC, high-resolution mass spectrometry, and computational data processing. Quality control steps are included for troubleshooting and evaluating experimental variation. More than 10,000 proteins in mammalian samples can be confidently quantitated with this protocol. This protocol can also be applied to the quantitation of post translational modifications with minor changes. This multiplexed, robust method provides a powerful tool for proteomic analysis in a variety of complex samples, including cell culture, animal tissues, and human clinical specimens.

We present a protocol to accurately quantitate proteins with isobaric labelling, extensive fractionation, bioinformatics tools, and quality control steps in combination with liquid chromatography interfaced to a high-resolution mass spectrometer.

التنميط البروتين العميق بوسم إيسوباريك وواسعة النطاق اللوني السائل والطيف الكتلي وساعدت برامج القياس الكمي

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is synthesized in response to multiple cellular and environmental factors. Melanin protects skin cells from ultraviolet damage, but also has biophysical and biochemical functions. Excessive production or accumulation of melanin in melanocytes can cause dermatological problems, such as freckles, dark spots, melasma, and moles. Therefore, the control of melanogenesis with hypopigmentation agents is important in individuals with clinical or cosmetic needs. Melanin is primarily synthesized in the melanosomes of melanocytes in a complex biochemical process called melanogenesis, which is influenced by extrinsic and intrinsic factors, such as hormones, inflammation, age, and ultraviolet light exposure. We describe three methods to determine the hypopigmentation activity of chemicals or natural substances in melanocytes: measurement of the 1) cellular tyrosinase activity and 2) melanin content, and 3) staining and quantifying cellular melanin with image analysis.
In melanogenesis, tyrosinase catalyzes the rate-limiting step that converts L-tyrosine into 3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) and then into dopaquinone. Therefore, the inhibition of tyrosinase is a primary hypopigmentation mechanism. In cultured melanocytes, tyrosinase activity can be quantified by adding L-DOPA as a substrate and measuring dopaquinone production by spectrophotometry. Melanogenesis can also be measured by quantifying the melanin content. The melanin-containing cellular fraction is extracted with NaOH and melanin is quantified spectrophotometrically. Finally, the melanin content can be quantified by image analysis following Fontana-Masson staining of melanin. Although the results of these in vitro assays may not always be reproduced in human skin, these methods are widely used in melanogenesis research, especially as the initial step to identify potential hypopigmentation activity. These methods can also be used to assess melanocyte activity, growth, and differentiation. Consistent results with the three different methods ensure the validity of the effects.

We describe three experimental methods for evaluating the hypopigmentation activity of chemicals in vitro: quantification of 1) cellular tyrosinase activity and 2) melanin content, and 3) measurement of melanin by cellular melanin staining and image analysis.

التحديد الكمي لنشاط نقص التصبغ في المختبر

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of reactive oxygen species (ROS) and reactive nitrogen species (RNS) in eukaryotic cells. Precise identification of nitration sites on proteins is crucial for understanding the physiological and pathological processes related to protein nitration, such as inflammation, aging, and cancer. Since the nitrated proteins are of low abundance in cells even under induced conditions, no universal and efficient methods have been developed for the profiling and identification of protein nitration sites. Here we describe a protocol for nitropeptide enrichment by using a chemical reduction reaction and biotin labeling, followed by high resolution mass spectrometry. In our method, nitropeptide derivatives can be identified with high accuracy. Our method exhibits two advantages compared to the previously reported methods. First, dimethyl labeling is used to block the primary amine on nitropeptides, which can be used to generate quantitative results. Second, a disulfide bond containing NHS-biotin reagent is used for the enrichment, which can be further reduced and alkylated to enhance the detection signal on a mass spectrometer. This protocol has been successfully applied to the model peptide Angiotensin II in the current paper.

Proteomic profiling of tyrosine-nitrated proteins has been a challenging technique due to the low abundance of the 3-nitrotyrosine modification. Here we describe a novel approach for nitropeptide enrichment and profiling by using Angiotensin II as the model. This method can be extended for other in vitro or in vivo systems.

توصيف وتعريف الببتيد الموضحة من قبل أنجيوتنسين الثاني

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. The binding of prokaryotic DnaG-like primases to DNA occurs at a specific trinucleotide recognition sequence. It is a pivotal step in the formation of Okazaki fragments. Conventional biochemical tools that are used to determine the DNA recognition sequence of DNA primase provide only limited information. Using a high-throughput microarray-based binding assay and consecutive biochemical analyses, it has been shown that 1) the specific binding context (flanking sequences of the recognition site) influences the binding strength of the DNA primase to its template DNA, and 2) stronger binding of primase to the DNA yields longer RNA primers, indicating higher processivity of the enzyme. This method combines PBM and primase activity assay and is designated as high-throughput primase profiling (HTPP), and it allows characterization of specific sequence recognition by DNA primase in unprecedented time and scalability.&#160;

Protein binding microarray (PBM) experiments combined with biochemical assays link the binding and catalytic properties of DNA primase, an enzyme that synthesizes RNA primers on template DNA. This method, designated as high-throughput primase profiling (HTPP), can be used to reveal DNA-binding patterns of a variety of enzymes.

الحمض النووي الاعتراف تسلسل بواسطة الحمض النووي البدائي باستخدام عاليه الانتاجيه البدائية التنميط

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

Dual DNA Rulers to Study the Mechanism of Ribosome Translocation with Single-Nucleotide Resolution

The ribosome translocation refers to the ribosomal movement on the mRNA by exactly three nucleotides (nt), which is the central step in protein synthesis. To investigate its mechanism, there are two essential technical requirements. First is single-nt resolution that can resolve normal translocation from frameshifting, during which the ribosome moves by other than 3 nt. The second is the capability to probe both the entrance and exit sides of mRNA in order to elucidate the whole picture of translocation. We report the dual DNA ruler assay that is based on the critical dissociation forces of DNA-mRNA duplexes, obtained by force-induced remnant magnetization spectroscopy (FIRMS).&#160; With 2-4 pN force resolution, the dual ruler assay is sufficient to distinguish different translocation steps. By implementing a long linker on the probing DNAs, they can reach the mRNA on the opposite side of the ribosome, so that the mRNA position can be determined for both sides. Therefore, the dual ruler assay is uniquely suited to investigate the ribosome translocation, and nucleic acid motion in general. We show representative results which indicated a looped mRNA conformation and resolved normal translocation from frameshifting.

Dual DNA ruler assay is developed to determine the mRNA position during ribosome translocation, which relies on the dissociation forces of the formed DNA-mRNA duplexes. With single-nucleotide resolution and capability of reaching both ends of mRNA, it can provide mechanistic insights for ribosome translocation and probe other nucleic acid displacements.

حكام الحمض النووي المزدوج لدراسة آلية نقل ريبوسم مع قرار النيوكليوتيد واحد

The ribosome translocation refers to the ribosomal movement on the mRNA by exactly three nucleotides (nt), which is the central step in protein synthesis. ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed complexes. The latter can be elegantly resolved according to molecular size using native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Coupling of such separations to sensitive mass spectrometry (BN-MS) has been well-established and theoretically allows for exhaustive assessment of the extractable complexome in biological samples. However, this approach is rather laborious and provides limited complex size resolution and sensitivity. Also, its application has remained restricted to abundant mitochondrial and plastid proteins. Thus, for a majority of proteins, information regarding integration into stable protein complexes is still lacking. Presented here is an optimized approach for complexome profiling comprising preparative-scale BN-PAGE separation, sub-millimeter sampling of broad gel lanes by cryomicrotome slicing, and mass spectrometric analysis with label-free protein quantification. The procedures and tools for critical steps are described in detail. As an application, the report describes complexome analysis of a solubilized endosome-enriched membrane fraction from mouse kidneys, with 2,545 proteins profiled in total. The results demonstrate identification of uniform, low-abundance membrane proteins such as intracellular ion channels as well as high resolution, complex protein assembly patterns, including glycosylation isoforms. The results are in agreement with independent biochemical analyses. In summary, this methodology allows for comprehensive and unbiased identification of protein (super)complexes and their subunit composition, providing a basis for investigating stoichiometry, assembly, and interaction dynamics of protein complexes in any biological system.

A versatile cryoslicing BN-MS protocol using a microtome is presented for high-resolution complexome profiling.

التنميط العالي الاستبانة بواسطة Cryoslicing BN-MS التحليل

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...

Phosphoproteomic Strategy for Profiling Osmotic Stress Signaling in Arabidopsis

Protein phosphorylation is crucial for the regulation of enzyme activity and gene expression under osmotic condition. Mass spectrometry (MS)-based phosphoproteomics has transformed the way of studying plant signal transduction. However, requirement of lots of starting materials and prolonged MS measurement time to achieve the depth of coverage has been the limiting factor for the high throughput study of global phosphoproteomic changes in plants. To improve the sensitivity and throughput of plant phosphoproteomics, we have developed a stop and go extraction (stage) tip based phosphoproteomics approach coupled with Tandem Mass Tag (TMT) labeling for the rapid and comprehensive analysis of plant phosphorylation perturbation in response to osmotic stress. Leveraging the simplicity and high throughput of stage tip technique, the whole procedure takes approximately one hour using two tips to finish phosphopeptide enrichment, fractionation, and sample cleaning steps, suggesting an easy-to-use and high efficiency of the approach. This approach not only provides an in-depth plant phosphoproteomics analysis (&#62; 11,000 phosphopeptide identification) but also demonstrates the superior separation efficiency (&#60; 5% overlap) between adjacent fractions. Further, multiplexing has been achieved using TMT labeling to quantify the phosphoproteomic changes of wild-type and snrk2 decuple mutant plants. This approach has successfully been used to reveal the phosphorylation events of Raf-like kinases in response to osmotic stress, which sheds light on the understanding of early osmotic signaling in land plants.

Phosphoproteomic Strategy for Profiling Osmotic Stress Signaling in Arabidopsis

Presented here is a phosphoproteomic approach, namely stop and go extraction tip based phosphoproteomic, which provides high-throughput and deep coverage of Arabidopsis phosphoproteome. This approach delineates the overview of osmotic stress signaling in Arabidopsis.

استراتيجية phosphoproteomic لتوصيف الإشارات الإجهاد التناضح في arabidopsis

Protein phosphorylation is crucial for the regulation of enzyme activity and gene expression under osmotic condition. Mass spectrometry (MS)-based ...

Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the structure and function of an RNA can be modulated by various trans-acting factors, such as proteins, metabolites or other RNAs. Frameshifting RNA molecules, for instance, are regulatory RNAs located in coding regions, which direct translating ribosomes into an alternative open reading frame, and thereby act as gene switches. They may also adopt different folds after binding to proteins or other trans-factors. To dissect the role of RNA-binding proteins in translation and how they modulate RNA structure and stability, it is crucial to study the interplay and mechanical features of these RNA-protein complexes simultaneously.&#160;This work illustrates how to employ single-molecule-fluorescence-coupled optical tweezers to explore the conformational and thermodynamic landscape of RNA-protein complexes at a high resolution. As an example, the interaction of the SARS-CoV-2 programmed ribosomal frameshifting element with the trans-acting factor short isoform of zinc-finger antiviral protein is elaborated. In addition, fluorescence-labeled ribosomes were monitored using the confocal unit, which would ultimately enable the study of translation elongation. The fluorescence coupled OT assay can be widely applied to explore diverse RNA-protein complexes or trans-acting factors regulating translation and could facilitate studies of RNA-based gene regulation.

This protocol presents a complete experimental workflow for studying RNA-protein interactions using optical tweezers. Several possible experimental setups are outlined including the combination of optical tweezers with confocal microscopy.