يصف هذا البروتوكول جمع بيانات ضخمة من البروتين والحمض النووي microarray ملزمة لل primase، وهو الانزيم الذي يرتبط عابرة لتسلسلات الحمض النووي محددة، وبالتالي يحفز تشكيل الائلية RNA. سيغطي هذا الفيديو كيف يمكن أن تساعد تقنية microarray في إعادة تعريف مواقع التعرف على التسلسل الرئيسي وكيف يمكن لنهج الإنتاجية العالية أن يكمل الكيمياء الحيوية الكلاسيكية. هذه التقنية يجمع بين نهجين: primase DNA microarray ملزمة ومجايسة النشاط الرئيسي.
microarray يوفر بيانات ضخمة من بريماسي ملزمة لتسلسل الحمض النووي، حيث كما المقايسة الكيميائية الحيوية يوفر معلومات عن تشكيل التمهيدي RNA من قبل بريماسي الحمض النووي. يعتمد النشاط الأنزيمي المختبر على البصيرة من تجربة microarray وإنتاجيتها المنخفضة في طبيعتها. يتم التحقيق في العلاقة بين كفاءة الربط ، واختيار تسلسل الحمض النووي ونشاط الإنزيم.
تحديد تحديد التسلسل باستخدام microarray، يسمح لنا باستخلاص استنتاجات دقيقة استنادا إلى بيانات ضخمة من microarray. وقد استخدم هذا النهج حتى الآن لوصف تسلسلات الحمض النووي الملزمة لعوامل النسخ. عوامل النسخ هي بروتينات ثابتة ترتبط بإحكام بالحمض النووي.
(سيُظهر الإجراء سيكون (ستيفان ايليتش لبدء هذا الإجراء، قبل الرطب الشريحة microarray عن طريق وضعه في جرة كوبلين تحتوي على 0.01٪ تريتون-X 100. وتدوير على جهاز تدوير مختبر، إضافة 125 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق.
الماصات الحل حظر في مربع من البلاستيك. ثم إزالة الشريحة microarray من جرة كوبلين. استخدام مسح غرامة لدفع الجانب غير الحمض النووي حواف الشريحة.
ضع ببطء microarray في مربع من البلاستيك. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة مع اهتزاز بطيء. بعد ذلك، غسل الشريحة مرة واحدة مع 0.01٪ Tween-20 في برنامج تلفزيوني.
على جهاز دوار مختبر عند 125 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق. إزالة Tween-20 وشطف الشريحة مرة واحدة مع 0.01٪ تريتون X 100 في برنامج تلفزيوني على مدار دورة مختبر في 125 دورة في الدقيقة لمدة دقيقتين. ثم نقل بسرعة الشريحة إلى جرة كوبلين تحتوي على برنامج تلفزيوني.
أولاً، قم بتجميع غرفة PMB كما هو موضح في بروتوكول النص. ضع الشريحة في المساحة المعينة. استخدام ملاقط لدفعه إلى أسفل واليسار.
ضع طوقا السيليكون على القمة ، مع التأكد من أن يتم محاذاته بشكل جيد مع الجزء السفلي من غرفة PBM. ثم أغلق الغرفة وشد البراغي قطريا. الماصات بروتين ملزمة الخليط في كل بئر من طوقا.
ثم، احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. للبدء ، ماصة 0.05 ٪ Tween - 20 في برنامج تلفزيوني في غرفة PBM لغسل الشريحة لفترة وجيزة. باستخدام ازاحة فراغ، إزالة الحل من آبار الغرفة مع الحرص على عدم لمس البقع الحمض النووي.
كرر هذا، وغسل لفترة وجيزة الشريحة مع برنامج تلفزيوني. واستخدام الفراغ لإزالة الحل من آبار الغرفة مع الحرص على عدم لمس البقع الحمض النووي. بعد ذلك ، أضف Alexa 488 مترافقًا ضد الأجسام المضادة له إلى كل بئر من غرفة PBM.
احتضان في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، وغسل لفترة وجيزة الشريحة داخل غرفة PBM بإضافة بضع قطرات من 0.05 ٪ Tween - 20 في برنامج تلفزيوني في كل بئر. واستخدام التعرق فراغ لإزالة الحل من آبار الغرفة، مع الحرص على عدم لمس البقع الحمض النووي.
تفكيك غرفة PBM وإزالة الشريحة. شطف الشرائح مرتين في 0.05٪ Tween-20 في برنامج تلفزيوني، مع كل شطف تستمر ثلاث دقائق. ثم، شطف الشرائح مرتين في برنامج تلفزيوني، مع كل شطف تستمر ثلاث دقائق لكل منهما.
و مرة واحدة في الماء المقطر المزدوج لمدة ثلاث دقائق جفف الشرائح بالهواء المضغوط. وتخزينها في مربع شريحة داكنة حتى تصبح جاهزة للمسح الضوئي.
عندما تكون جاهزة، استخدم ماسح ضوئي microarray لمسح الشريحة مع استثارة من 495 نانومتر وانبعاث 19 نانومتر. وجمع متوسط كثافة الفلورس. في هذه الدراسة pi إنتاجية primase التنميط يستخدم لرسم خريطة primase ملزمة المواقع ، بما في ذلك تلك التي يصعب إن لم يكن من المستحيل أن نلاحظ باستخدام الأدوات الكلاسيكية.
الأهم من ذلك ، pi إنتاجية primase التنميط تمكن من إعادة النظر في الفهم التقليدي لمواقع ملزمة primase. خاصة pi الإنتاجية primase التنميط يكشف عن خصوصيات ملزمة بالإضافة إلى معروفة 5'GTC3'الاعتراف تسلسل، الأمر الذي يؤدي إلى تغييرات في الأنشطة الوظيفية من T7 DNA primase. أي أنه تم تحديد مجموعتين من التسلسلات.
تسلسل الحمض النووي ملزمة قوية التي تحتوي على TG في الجناحين وتسلسل الحمض النووي ملزمة ضعيفة التي تحتوي على AG في الجناحين. لم يتم الكشف عن أي ربط بريما لقوالب الحمض النووي التي كانت مفقودة 5'GTC3'داخل تسلسلها. مواقع التعرف على الحمض النووي بريماسي التي تحتوي على ميزات محددة مثل الجناحين الغنية TG، وزيادة بريماسي الحمض النووي ملزمة تصل إلى 10 أضعاف.
والمثير للدهشة، أنها أيضا زيادة طول الحمض النووي الريبي شكلت حديثا. الأهم من ذلك ، ارتفاع الإنتاجية primase التنميط يسمح لنا لمراقبة وقياس التباين في طول التمهيدي بالنسبة لتسلسل قالب الحمض النووي. عند تنفيذ هذا الإجراء يجب أن تكون خطوات الغسيل خفية.
ويجب أن تحتوي المخازن المؤقتة على مكونات تسجيل بريما على الحمض النووي. أيضا حدّ من عبثيّة ييحدّد اتّزاميّة حادثات يميّا. ولذلك فإن تحليل الميكروساومي غير كاف.
يمكن أن تحدد أساليب مثل الرنين البلازما السطحية ومقايسات تحول الجل تقارب ملزم من primase لتحديد تسلسل الحمض النووي. مختبري ينفذ نماذج التنبؤ التعلم الآلي للكشف عن محددات تسلسل الرئيسيات التي تنتج التمهيديات المنتجة التي يمكن تمديدها بواسطة بوليميراز الحمض النووي. في عصر البيانات الضخمة ، وتنفيذ الطرق الإحصائية لتحليل البيانات الضخمة ، فإن هذه التقنية ستساعد بالتأكيد على تحديد تسلسل الحمض النووي المحدد بشكل أفضل وربط التعرف على التسلسل بنشاط primase.
وينبغي أن يكون لدى أي شخص يعمل مع الإشعاع فهم دقيق للوائح والأخطار المرتبطة باستخدام الإشعاع المؤين. يجب أن يخضع للتدريب وينبغي أن تعمل مع معدات السلامة.
