هذه الطريقة تمكن من تسجيل و كمية النشاط العصبي عبر المناطق الماوس القشرية الثنائية لفترة طويلة في الجسم الحي. تقنية الفوتون اثنين لديه ميزة الكشف عن النشاط في وقت واحد في مجموعات الخلايا العصبية الكبيرة أو المتناثرة على مدى فترة طويلة. امتدت الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو التحقيق في أنماط النشاط في مجموعات الخلايا العصبية المحددة في مناطق مختلفة من الدماغ الحي.
12 ساعة قبل بدء العملية، وساخنة النوافذ البصرية في 50 درجة مئوية في 70٪ الإيثانول. نافذة بصرية تتكون من جولة قطرها خمسة ملليمتر أعلى غطاء الزجاج والجزء السفلي تحتوي على جولة 3 ملليمتر قطر غطاء الزجاج. في نهاية الحضانة الاحترار، تأكيد عدم وجود استجابة لقرصة إصبع قدم على تخدير 20 إلى 25-غرام 1 1/2 إلى 2 1/2 الشهر Thy1 GCaMP6s الماوس، وتطبيق مرهم على عيون الحيوان.
ضع الماوس على وسادة التدفئة المغطاة بستارة معقمة واستخدم محولًا ممسكًا بالرأس للفئران لتثبيت الرأس. حلاقة معظم فروة الرأس مع حلاقة مزدوجة الحافة، وتنظيف الجلد المكشوف مع منصات إعداد الكحول العقيمة متسلسلة والدعك محلول بوديوني اليود. ثم استخدام زوج من مقص لجعل مستطيلة قطعت اثنين من ثلاثة ملليمتر في فروة الرأس على الجانب الأيمن من الجمجمة.
باستخدام مسحة القطن، ودفع الجلد جانبا لخلق منطقة التعرض من أكبر من ثلاثة ملليمترات في القطر، واستخدام شفرة مجهرية حادة لإزالة بلطف النسيج الضام تعلق على الجمجمة. مع حفر الأسنان، وعلامة بلطف دائرة قطرها ثلاثة ملليمتر حول منطقة S1. بعد جعل دائرة مماثلة على الجانب الأيسر من الجمجمة، وتطبيق طبقة رقيقة من الغلوغليات سيانوكريلا على جانبي العظام لتوفير قاعدة لتطبيق أسمنت الأسنان.
تحت مجهر تشريح، واستخدام حفر الدقيقة عالية السرعة لرقيقة أسفل الأخدود الدائري في الجانب الأيمن من الجمجمة حول منطقة S1 لخلق حافة ناعمة، التطلع حطام العظام مع فراغ حسب الضرورة. بعد ما يقرب من 2/3 تم تحقيق عمق العظام، ببطء وبعناية رقيقة المتبقية 1/3 من العظام حتى تم تحرير رفرف العظام دائرية تماما من الجمجمة المحيطة بها. استخدام زوج من 5/45 ملقط لإزالة ببطء وبعناية قطعة دائرية من العظام لفضح دورا، مع الحرص على تجنب إتلاف الأوعية البزى.
بعد إزالة رفرف العظام من الجانب الأيسر من الجمجمة بنفس الطريقة ، شطف النافذة البصرية للجانب الأيمن من الجمجمة مع المالحة العقيمة ، والتحقق من العيوب تحت مجهر ستيريو. تثبيت نافذة بصرية على منطقة القحف مع الجزء العلوي من النافذة يستريح على الجمجمة والجزء السفلي داخل فتحة القحف، يستريح على دورا، في وجود السائل الشوكي الدماغي. استخدام السيلانوكريل superglue لختم الجزء العلوي من حافة النافذة البصرية إلى الجمجمة.
عندما يجف الغراء ، وتطبيق الاسمنت الأسنان السوداء على حافة الزجاج ، وبقية الجانب الأيمن من الجمجمة المكشوفة ، والهوامش الجرح لمنع الضوء. ثم تثبيت نافذة بصرية اليسار والسماح للحيوان لاسترداد مع مراقبة حتى إعادة شغل كامل. بعد سبعة إلى 10 أيام من الإجراء ، ضع الحيوان المُجَدَّد في مهايئ الرأس على وسادة تدفئة تحت مجهر ذي فوتين ، مع الحرص على أن النافذة البصرية والجانب الأيمن من الجمجمة موجهان عموديًا على المحور البصري للمجهر.
الحصول على صورة خريطة مرجعية أولية من النافذة القحفية باستخدام الإضاءة في المجال الساطع في التكبير أربع مرات. بعد الحصول على صور متعددة من نفس المنطقة ذات الاهتمام، صورة ديناميات الكالسيوم داخل منطقة S1 في نصف الكرة الأيسر وحساب التغيرات في الفلوريس من كل منطقة من الاهتمام على جانبي الجمجمة. في هذه الصور التمثيلية، تم تصور التشعبات والأوعية الدموية داخل فأر التعبير عن EGFP في أعماق مختلفة في الطبقة الثانية من منطقة S1 بعد يوم واحد من تركيب النافذة البصرية.
تم التقاط صور الإسقاط Z في اليومين الأول والسابع بعد زرع النافذة البصرية ، مما يدل على عدد مستقر بشكل ملحوظ وموقع الفروع والعمود الفقري التشعبية خلال الفترة التجريبية. قياس عابر الكالسيوم داخل الخلايا في Thy1 GCaMP6s الفئران المعدلة وراثيا يسمح القياس الكمي لنشاط الكالسيوم العفوي والسكان من الطبقة خمس خلايا عصبية هرمية تقع في عمق أكبر من 500 ميكرومتر تحت بيا وكذلك حساب متوسط عدد الاستجابات العفوية مع مرور الوقت. وينبغي أن يكون الباحث المدربين في كل من إعداد نافذة الجمجمة وفي vivo اثنين من الفوتون تقنيات تصوير الكالسيوم تكون قادرة على الحصول على تسجيلات من 100 إلى 200 الخلايا العصبية على جانبي الجمجمة في واحد إلى اثنين في اليوم الواحد.
مع نافذة بصرية مفتوحة على كل جانب من الجمجمة ، تمكن الطريقة من تسجيل النشاط العصبي عبر مناطق الدماغ الثدييات المتماثلة لتصوير الكالسيوم لفترة طويلة ومستقرة في الجسم الحي. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه الطريقة لدراسة النشاط القشرية واللدونية بعد إصابة أحادية الطرفية أو الجهاز العصبي المركزي. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تثبيت النوافذ القحفية الثنائية لقياس ديناميات الكالسيوم باستخدام مجهر فوتون اثنين في Thy1 GCaMP6s الفئران المعدلة وراثيا.
