وأيده هذه الدراسة الوطنية للبحوث والتنمية والابتكار مكتب لهنغاريا (منحة 116912 ÁH)، مكتب التكلفة (الأغذية والزراعة تكلفة العمل FA1205: أكواجاميتي)، هونجاريكوم ستيبينديوم وبرنامج المنح الدراسية (المنح إلى ZM) والجديد المجرية الوطنية التميز بريدوكتورال زمالة (منحة كرونة إستونية).

جميع الأساليب الموصوفة هنا أقرها "قانون رعاية الحيوان الهنغارية".
1-كاشف إعداد
<ol><li>حلول الأسهم<ol>
<li>إعداد تريهالوسي م 1 بإضافة 0.378 ز من ثنائي هيدرات تريهالوسي إلى 1 مل من مزيج O. dH2جيدا حتى أنه يذوب تماما.</li>
		<li>إعداد السكروز 1 م بإضافة ز 0.342 السكروز إلى 1 مل من مزيج O. dH2جيدا حتى أنه يذوب تماما.</li>
		<li>تحضير 1 م حبيس بإضافة 0.238 ز حبيس إلى 1 مل من مزيج O. dH2جيدا حتى أنه يذوب تماما.</li>
		<li>إعداد 20 ملغ/مل كولاجيناز (290 ش/mg) بإضافة 100 مغ إلى 5 مل من برنامج تلفزيوني. المزيج جيدا حتى يذوب عليه. تصفية العقيمة من خلال 0.2 ميكرون المرشحات. اليكووت ميليلتر 50 إلى 0.2 مل PCR أنابيب وتجميد عند-20 درجة مئوية.</li>
		<li>إعداد التربسين 15 ملغ/مل (~ 10000 U/mg) بإضافة 75 ملغ إلى 5 مل من برنامج تلفزيوني. المزيج جيدا حتى يذوب عليه. تصفية العقيمة من خلال 0.2 ميكرون المرشحات. اليكووت ميليلتر 50 إلى 0.2 مل PCR أنابيب وتجميد عند-20 درجة مئوية.</li>
		<li>إعداد 1 ملغ/مل الدناز أنا (~ 3000 يو/mg) بإضافة 5 ملغ إلى 5 مل من برنامج تلفزيوني. المزيج جيدا حتى يذوب عليه. تصفية العقيمة من خلال 0.2 ميكرون المرشحات. اليكووت ميليلتر 50 إلى 0.2 مل PCR أنابيب وتجميد عند-20 درجة مئوية.</li>
		<li>إعداد 0.4% تريبان الأزرق بإضافة 40 مغ تريبان الأزرق إلى 10 مل من برنامج تلفزيوني. تصفية العقيمة من خلال 0.2 ميكرون المرشحات. 1 مل الكوة في أنابيب 1.5 مل.</li>
		<li>إعداد 200 مغ/لتر MS-222 (تريكيني الميثان المشبعة بالفلور أوكتين) بإضافة 200 مغ من مرض التصلب العصبي المتعدد-222 إلى 1 لتر من dH2ميكس O. جيدا حتى أنه يذوب تماما. بالإضافة إلى ذلك، المخزن المؤقت حل مرض التصلب العصبي المتعدد-222 مع بيكربونات الصوديوم للرقم الهيدروجيني محايدة من 7.0.</li>
	</ol>
</li>
	<li>حلول التزجيج<ol>
<li>إعداد الموازنة الحل (ES): إعداد 2 مل وفاق بخلط 121.5 ميليلتر من الميثانول (ميوه؛ 1.5 متر)، 220 ميليلتر من البروبيلين غليكول (PG؛ 1.5 متر)، 200 ميليلتر من FBS (10%)، 200 ميليلتر حل الأسهم تريهالوسي (0.1 M)، 50 ميليلتر حبيس حل الأسهم (25 مم) و 1208.5 ميليلتر من L-15 إلى 2 أنبوب مل.</li>
		<li>إعداد الحل التزجيج (مقابل): إعداد 2 مل مقابل بخلط 439 ميليلتر من PG (3 م)، 426 ميليلتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (لي2حتى؛ م 3)، 200 ميليلتر FBS (10%)، 200 ميليلتر من حل تريهالوسي الأسهم (0.1 M)، 50 ميليلتر من هيبيس الأسهم والحل (25 مم) 685 ميليلتر من L-15 إلى أنبوب 2 مل.</li>
	</ol>
</li>
	<li>حلول للاحترار<ol>
<li>إعداد الحل الاحترار 1 (WS1): تعد 1.5 مل WS1 في أنبوب 2 مل بخلط 150 ميليلتر من FBS (10%)، 450 ميليلتر من محلول السكروز الأسهم (م 3) و 900 ميليلتر من L-15.</li>
		<li>إعداد الحل الاحترار 2 (WS2): تعد 1.5 مل WS2 في أنبوب 2 مل بخلط 150 ميليلتر من FBS (10%)، 150 ميليلتر من محلول السكروز الأسهم (1 م) و 1200 ميليلتر من L-15.</li>
		<li>إعداد الحل الاحترار 3 (WS3): تعد 1.5 مل WS2 في أنبوب 2 مل بخلط 150 ميليلتر FBS (10 في المائة) و 1350 ميليلتر من L-15.</li>
	</ol>
</li>
	<li>إعداد الحل الهضم: لكل عينة إعداد 500 ميليلتر من الحل الهضم بخلط 50 ميليلتر من حل الأسهم كولاجيناز (2 مغ/مل)، 50 ميليلتر من حل الأسهم التربسين (1.5 ملغ/مل)، 10 ميليلتر من الدناز أنا (20 ميكروغرام/مل) و 390 ميليلتر من L-15 في 2 مل أنبوب.</li>
	<li>الحصول على أدوات تشريح: مقص، ميكروسسيسورس، ملاقط، ملاقط المنحنى، والعلاج بوخز الإبر.</li>
</ol>2-الخصيتين جمع
<ol><li>Euthanize السمك بوضعه في طبق يحتوي على 200 مغ/لتر MS-222 (pH = 7). قبل المتابعة مع التشريح، تأكد من أن الخياشيم توقفت عن التحرك، وأن مالا يقل عن 10 دقيقة مرت منذ تلك اللحظة لضمان الموت بنقص.</li>
	<li>الجاف للأسماك طريق الربت عليه على منشفة ورقية ووضعها على جانبها الظهرية على حصيرة تشريح.<ol>
<li>أولاً قطع زعانف الحوض وصدري لتشريح أسهل.</li>
		<li>أفقياً قص الجلد على بطن السمك بين الزعانف الصدرية وقطع الجلد والعضلات الأساسية على طول البطن حتى الزعنفة الشرجية.</li>
		<li>فتح تجويف الجسم من الأسماك ودبوس الجدار الجسم الأيمن والأيسر إلى حصيرة تشريح مع الإبر. ملاحظة: توجد الخصيتين أعلاه الأجهزة الجهاز الهضمي على كلا جانبي المثانة السباحة (الشكل 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>لمنع التلوث، لا تأخذ بها أجهزة الجهاز الهضمي، ولكن بلطف دفعهم إلى جانب واحد وإزالة الخصية من الجانب الآخر. الخصيتين متصلاً بجدار الجسم حتى إزالتها بعناية وقطع الصفاق يربط طريق ميكروسسيسورس.</li>
	<li>بالإضافة إلى ذلك، من أجل منع التلوث، أولاً تعقيم الخصيتين قبل وضعها في الإيثانول 70% 2 ثانية، والمكان ثم لهم في L-15 على لوحة 96-جيدا على الجليد. ملاحظة: إذا لزم الأمر، الخصيتين نظيفة من الأنسجة الدهنية وكبير الأوعية الدموية تحت ستيريوميكروسكوبي الضبط</li>
</ol>3. فائقة السرعة تبريد أنسجة الخصية
<ol><li>اكتب الإبر مارك مع التسميات المناسبة تبعاً للنموذج وإعداد الموازنة (ES) وحلول التزجيج (مقابل).</li>
	<li>نقل الخصيتين صفيحة جيدا أكبر أو طبق ودبوس ثلاثة الخصيتين (أو أكثر تبعاً لحجم الإبرة) بإبرة الوخز بالإبر معقمة.<ol>
<li>أولاً ضع في الخصية على رأس الملاقط منحنية. ضع نقطة الإبرة في وسط الخصية وسحب بعناية في الخصية نحو الأعلى مع الملاقط.</li>
		<li>بعد ثقب في الخصية، اسحبه برفق صعودا نحو الأعلى من الإبرة. تأكد من الخصيتين مفصولة عن بعضها البعض، وأنها لم تسقط أو الانزلاق إلى أسفل.</li>
		<li>مكان شغل الإبر مع الخصيتين المثبتة في أنبوب 2 مل مع L-15 حتى التزجيج (في ˚C 25؛ التخزين ينبغي أن لا يتجاوز الوقت ح 1). ملاحظة: تعلق الخصيتين في الإبرة ينبغي أن يتم سريعاً إلى منع الخصيتين من الجفاف.</li>
	</ol>
</li>
	<li>نقل الإبرة مع الخصيتين إلى الحل الموازنة واحتضان لمدة 5 دقائق في 25˚C.</li>
	<li>تحويل الإبرة إلى الحل التزجيج واحتضان لمدة 30 ثانية في 25˚C.</li>
	<li>إزالة الإبرة من حل التزجيج، وتستوعب بسرعة ولطف الحل المتبقي من الأنسجة بمنشفة ورقية معقمة. توخي الحذر لتجنب الخصيتين التمسك بمنشفة ورقية أو السقوط.</li>
	<li>بسرعة ضع الإبرة في نيتروجين سائل يوضع في مربع الستايروفوم. ملاحظة: قم بهذه الخطوة بسرعة لتفادي التعرض للأنسجة لبخار النتروجين السائل. استخدام وحدات التخزين المنخفضة من النيتروجين السائل لمنع التلوث عبر العينات.</li>
	<li>الاحتفاظ الإبرة في النتروجين السائل في مربع الستايروفوم مغلقة لمدة 5-10 دقائق.</li>
	<li>بريكول كريوتوبي مل 4.5 فتح وبرنامجه في نفس مربع.</li>
	<li>بعد 5-10 دقيقة، نقل كل إبرة في كريوتوبي منفصلة تحت سطح النتروجين السائل وأغلق كريوتوبي. تنبيه: دائماً استخدام الملابس الواقية (مثل القفازات المعزولة) عند العمل مع النيتروجين السائل كما يمكن أن يؤدي التعرض لقضمة الصقيع الشديد.</li>
	<li>ضع كريوتوبي على عصا معدنية ثم ضعه في علبة cryobank في أسرع وقت ممكن. تخزين العينات في تخزين اسطوانة ديوار حتى استخدامها مرة أخرى.</li>
</ol>4-الاحترار الداخلي
<ol><li>الحارة إبرة كل على حدة. ينبغي أن تكون جميع الحلول الاحترار عند 25 درجة مئوية.</li>
	<li>فصل كريوتوبي من قصب معدنية ويغرق هو في النتروجين السائل المخزنة في مربع الستايروفوم.</li>
	<li>فتح في كريوتوبي في بخار النتروجين السائل (باستخدام الملقط) والإفراج عن الإبرة في النيتروجين السائل.</li>
	<li>نقل الإبرة سريعاً جداً في أول حل الاحترار واحتضان لمدة 1 دقيقة (عند 25 درجة مئوية). تأكد من نقل الإبرة بسرعة لمنع الاحترار في الهواء أثناء النقل.</li>
	<li>تحويل الإبرة إلى الحل الثاني الاحترار واحتضان لمدة 3 دقائق (عند 25 درجة مئوية).</li>
	<li>تحويل الإبرة إلى الحل الثالث الاحترار واحتضان لمدة 5 دقائق (عند 25 درجة مئوية).</li>
	<li>الإفراج عن الخصيتين من الإبرة بانزلاق لهم تخفيضها مع ملاقط منحنية. مكان كل الخصية حرارة منفردة في بئر منفصلة (96-جيدا لوحة) مليئة 250 ميليلتر من L-15 وتستكمل مع 10% FBS. تأكد من أن تتم تسمية الآبار وفقا للعينة. تبقى لوحة جيدا على الجليد حتى تكون درجة حرارة جميع العينات وحتى المزيد من العمل.</li>
</ol>5-الأنسجة الهضم
<ol><li>إعداد 500 ميليلتر من الحل الانفصال لكل عينة في أنابيب منفصلة 2 مل. قم بتسمية هذه الأنابيب وفقا للتعليمات البرمجية العينة. احتضان الحل الانفصال من استعداد لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>إضافة حرارة الأنسجة إلى الحل الهضم ومقطعة إلى قطع صغيرة بحركات مالا يقل عن 30 من مقص صغير.</li>
	<li>احتضان قطع الأنسجة على لوحة تهتز لمدة 90 دقيقة في 25 ˚C.</li>
	<li>إيقاف عملية الهضم عن طريق إضافة 400 ميليلتر من L-15 و 100 ميليلتر من FBS (10% FBS v/v). باختصار يهز الحل واحتضان لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>تصفية الحل التي تم الحصول عليها من خلال 50 ميكرون المرشحات في أنبوب 1.5 مل. قم بتسمية الأنابيب تبعاً لذلك.</li>
	<li>الطرد المركزي الحل التي تمت تصفيتها في ز × 200 لمدة 10 دقائق في 25 ˚C.</li>
	<li>بعناية إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 20 ميليلتر من L15 تكملة مع 10% FBS. يدوياً يهز الأنبوب حتى يذوب بيليه تماما. ستبقى على تعليق خلية على الجليد أو في 4 ˚C حتى استخدامها مرة أخرى.</li>
</ol>6-استمرارية التقييم وخلية العد
<ol><li>مزيج 5 ميليلتر من تعليق خلية وميليلتر 5 0.4% تريبان الأزرق الحل في أنبوب PCR مسماة مناسب 0.2 مل. في حالة استخدام أحجام مختلفة، تأكد من أن نسبة التخفيف من بقايا 1:1.</li>
	<li>احتضان هذا الوقف لمدة 1 إلى 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية).</li>
	<li>التحقق من صلاحية كل عينة في هيموسيتوميتير تحت المجهر.</li>
	<li>حساب عدد الخلايا الحية (أونستينيد قبل blue تريبان) في حقول 15. حساب إجمالي عدد الخلايا في 20 ميكرون من تعليق خلية. التعليق جاهز الآن لأي تطبيق من المتلقين للمعلومات. ملاحظة: عند تحسين الإجراءات المتعلقة بالأنواع الأخرى مع حجم الجسم أكبر، استخدام أجزاء الخصية من نفس الوزن. استخدام الخصيتين من فرد واحد لجميع المجموعات التجريبية بغية تجنب تقلب الفردية في النتائج. في حالة الزرد، ونحن قد استفادت الحقيقة أن اليسار والخصية اليمنى ينبغي أن تحتوي على عدد متساو (أو مشابهة جداً) من الخلايا الجرثومية13 (انظر نتائج الممثل). أبقى في الخصية اليسرى كعنصر تحكم بينما الشركة إنتاج/ارتفعت درجة حرارة الخصية اليمنى. تم حساب النسبة المئوية لبقاء عدد الخلايا المعزولة من الخصية الشركة إنتاج/تحسنت مقارنة بعدد الخلايا المعزولة من الخصية الطازجة.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Mazur, P., Leibo, S. P., Seidel, G. R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+the+germplasm+of+animals+used+in+biological+and+medical+research:+Importance,+impact,+status,+and+future+directions.">Cryopreservation of the germplasm of animals used in biological and medical research: Importance, impact, status, and future directions.</a> Biol. Reprod. 78 (1), 2-12 (2008).</li><li>Carmichael, C., Westerfield, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+and+In+Vitro+Fertilization+at+the+Zebrafish+International+Resource+Center.">Cryopreservation and In Vitro Fertilization at the Zebrafish International Resource Center.</a> Methods Mol. Biol. 546, 45-65 (2009).</li><li>Yang, H., Carmichael, C., Varga, Z. M., Tiersch, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+simplified+and+standardized+protocol+with+potential+for+high-throughput+for+sperm+cryopreservation+in+zebrafish+Danio+rerio.">Development of a simplified and standardized protocol with potential for high-throughput for sperm cryopreservation in zebrafish Danio rerio.</a> Theriogenology. 68 (2), 128-136 (2007).</li><li>Morris, J. P., Berghmans, S., Zahrieh, D., Neuberg, D. S., Kanki, J. P., Look, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+sperm+cryopreservation+with+N,N-dimethylacetamide.">Zebrafish sperm cryopreservation with N,N-dimethylacetamide.</a> Biotechniques. 35 (5), 956-968 (2003).</li><li>Yoshizaki, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogonial+transplantation+in+fish:+A+novel+method+for+the+preservation+of+genetic+resources.">Spermatogonial transplantation in fish: A novel method for the preservation of genetic resources.</a> Comp. Biochem. Physiol. Part D: Genomics Proteomics. 6 (1), 55-61 (2011).</li><li>Gao, D., Critser, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+cryoinjury+in+living+cells.">Mechanisms of cryoinjury in living cells.</a> ILAR J. 41 (4), 187-196 (2000).</li><li>Asturiano, J. F., Cabrita, E., Horv&#225;th, &. #. 1. 9. 3. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress,+challenges+and+perspectives+on+fish+gamete+cryopreservation:+A+mini-review.">Progress, challenges and perspectives on fish gamete cryopreservation: A mini-review.</a> Gen. Comp. Endocrinol. 245, 69-76 (2017).</li><li>K&#225;sa, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+sperm+vitrification+protocols+for+freshwater+fish+(Eurasian+perch,+Perca+fluviatilis)+and+marine+fish+(European+eel,+Anguilla+anguilla).">Development of sperm vitrification protocols for freshwater fish (Eurasian perch, Perca fluviatilis) and marine fish (European eel, Anguilla anguilla).</a> Gen. Comp. Endocrinol. 245, 102-107 (2017).</li><li>Cuevas-Uribe, R., Leibo, S. P., Daly, J., Tiersch, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+channel+catfish+with+sperm+cryopreserved+by+rapid+non-equilibrium+cooling.">Production of channel catfish with sperm cryopreserved by rapid non-equilibrium cooling.</a> Cryobiology. 63 (3), 186-197 (2011).</li><li>Wang, Y., Xiao, Z., Li, L., Fan, W., Li, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+needle+immersed+vitrification:+A+practical+and+convenient+method+with+potential+advantages+in+mouse+and+human+ovarian+tissue+cryopreservation.">Novel needle immersed vitrification: A practical and convenient method with potential advantages in mouse and human ovarian tissue cryopreservation.</a> Hum. Reprod. 23 (10), 2256-2265 (2008).</li><li>Liu, J., Cheng, K. M., Silversides, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Live+Offspring+from+Testicular+Tissue+Cryopreserved+by+Vitrification+Procedures+in+Japanese+Quail+(Coturnix+japonica).">Production of Live Offspring from Testicular Tissue Cryopreserved by Vitrification Procedures in Japanese Quail (Coturnix japonica).</a> Biol. Reprod. 88 (5), 124 (2013).</li><li>Liu, J., Cheng, K. M., Silversides, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+needle-in-straw+vitrification+can+effectively+preserve+the+follicle+morphology,+viability,+and+vascularization+of+ovarian+tissue+in+Japanese+quail+(Coturnix+japonica).">Novel needle-in-straw vitrification can effectively preserve the follicle morphology, viability, and vascularization of ovarian tissue in Japanese quail (Coturnix japonica).</a> Anim. Reprod. Sci. 134 (3-4), 197-202 (2012).</li><li>Lee, S., Yoshizaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+cryopreservation+of+spermatogonia+in+critically+endangered+Manchurian+trout+(Brachymystax+lenok).">Successful cryopreservation of spermatogonia in critically endangered Manchurian trout (Brachymystax lenok).</a> Cryobiology. 72 (2), 165-168 (2016).</li><li>Marques, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viability+of+zebrafish+(Danio+rerio)+ovarian+follicles+after+vitrification+in+a+metal+container.">Viability of zebrafish (Danio rerio) ovarian follicles after vitrification in a metal container.</a> Cryobiology. 71 (3), 367-373 (2015).</li><li>Luji&#263;, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+successful+vitrification+of+salmonid+ovarian+tissue.">First successful vitrification of salmonid ovarian tissue.</a> Cryobiology. 76, 154-157 (2017).</li><li>Bono-Mestre, C., Cardona-Costa, J., Garc&#237;a-Xim&#233;nez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+on+cell+viability+of+three+zebrafish+testicular+cell+or+tissue+cryopreservation+methods.">Effects on cell viability of three zebrafish testicular cell or tissue cryopreservation methods.</a> CryoLetters. 30 (2), 148-152 (2009).</li><li>Marinovi&#263;, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryosurvival+of+isolated+testicular+cells+and+testicular+tissue+of+tench+Tinca+tinca+and+goldfish+Carassius+auratus+following+slow-rate+freezing.">Cryosurvival of isolated testicular cells and testicular tissue of tench Tinca tinca and goldfish Carassius auratus following slow-rate freezing.</a> Gen. Comp. Endocrinol. 245, 77-83 (2017).</li><li>P&#353;eni&#269;ka, M., Saito, T., Rodina, M., Dzyuba, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+early+stage+Siberian+sturgeon+Acipenser+baerii+germ+cells,+comparison+of+whole+tissue+and+dissociated+cells.">Cryopreservation of early stage Siberian sturgeon Acipenser baerii germ cells, comparison of whole tissue and dissociated cells.</a> Cryobiology. 72, 119-122 (2016).</li><li>Lee, S., Iwasaki, Y., Shikina, S., Yoshizaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+eggs+and+sperm+from+cryopreserved+whole+testes.">Generation of functional eggs and sperm from cryopreserved whole testes.</a> Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 110 (5), 1640-1645 (2013).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

وكان الغرض الرئيسي من هذه الدراسة التكيف مع الإبرة مغمورة الداخلي تبريد فائقة السرعة لأنواع الطيور والثدييات10،11،12 إلى تجميد الأسماك الخصية (الزرد كنموذج الكائن الحي). معظم الدراسات السابقة فيما يتعلق بتجميد الموارد الوراثية الزرد كانت تركز أساسا على تجميد الزرد الحيوانات المنوية2،،من34. ومع ذلك، لم توضع البروتوكولات لتجميد بويضات ناضجة والأجنة بعد، على الرغم من أن بعض الدراسات الأخيرة تثبت أن نعد من بويضات في مرحلة مبكرة هو معقول14،15. وفي هذه الدراسة أثبتنا نعد ناجحة من spermatogonia الزرد التي توفر إمكانيات جديدة لتخزين قيمة الموارد الوراثية، خصوصا بعد زرع الأعضاء أنهم يمكن أن تنضج في الأمشاج الذكور والإناث على حد سواء5 .
على حد علمنا، هذا هو أول دراسة تتناول تبريد فائقة السرعة للأنسجة الزرد بواسطة الأسلوب يقول:. دراسات مماثلة شملت التزجيج الخصيتين الزرد في 0.25 مل قش البلاستيك16 والتزجيج المبايض الزرد في حاويات معدنية مغلقة14. والميزة الرئيسية ليقول: مقارنة بحاويتين المذكورة هو تعرض الخصيتين المباشر للنتروجين السائل بكميات ضئيلة من المنتجة يجري المرفقة بها، وبالتالي تحقيق أقصى معدل التبريد10. الزيادة في معدل التبريد يقلل من التركيز المطلوب للمنتجة، مما يقلل من سميتها. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تتعرض جميع الأنسجة القطع المنتجة والنتروجين السائل في شكل متزامن. ومع ذلك، قد يكون التعرض المباشر للنتروجين السائل عيب واحد فيما يتعلق بالتلوث عبر. فمن الممكن أن البكتريا أو الفيروسات موجودة في النتروجين السائل، وأن التعرض المباشر الأنسجة قد يؤدي إلى التلوث. ولذلك، نود أن نقترح على الامتناع عن إعادة استخدام النتروجين السائل عند إجراء يقول: وتجاهل النتروجين السائل المستخدمة بعد التبريد. مزايا العرض حاويات معدنية واقترح في هذا الصدد14، مهما كانت مخصصة وغير قابلة للوصول بسهولة إلى جميع المختبرات.
عند مقارنة تبريد فائقة السرعة بمعدل بطيء تجميد، ميزة حاسمة واحدة لتبريد فائقة السرعة هو عدم وجود المني بعد الهضم. أثبتت أساليب تجميد معدل بطيء في بعض أنواع الأسماك الكارب أن بروتوكولات مماثلة تعطي صلاحية قابلة للمقارنة للخلايا الجرثومية في مرحلة مبكرة والمنى17 أدى إلى أرقام عالية المني بعد الهضم cryopreserved الأنسجة. نتائجنا في الزرد (هذه الدراسة)، الكارب وذهبية (نتائج غير منشورة) تشير إلى أن هناك عدد قليل جداً من المني بعد هضم الأنسجة دافئة، وعدم البقاء على قيد الحياة هذا الإجراء والحصول على هضم الذي يبسط المصب التطبيقات حيث هناك حاجة إلى لا إجراءات إضافية تخصيب اليورانيوم.
وهناك العديد من الخطوات الحاسمة ضمن هذا البروتوكول. الأول لمنع أي تلوث أثناء عملية عزلة نظراً لأنه قد يؤدي إلى انخفاض في عدد الخلايا التي تم الحصول عليها، وقد تعوق أي تطبيقات المتلقين للمعلومات. واحدة من الخطوات الحاسمة هو استئصال الخصيتين حيث التلوث البكتيري قد يحدث من أضرار الشجاعة (ولذلك من الأفضل عدم تجرح أو إزالة الأمعاء) أو من الجلد في حالة استخدام نفس الأداة تشريح لقطع الجلد وإزالة الخصيتين. وثانيا، رعاية عندما تعلق الخصيتين بإبرة الوخز بالإبر منذ فمن الممكن أن الخصيتين تسقط أو الانزلاق. حاليا، نحن باختبار أساليب مختلفة للحيلولة دون انزلاق أثناء إجراء عمليات التزجيج (درجات حرارة النتروجين السائل) الخصيتين. ثالثا، الاهتمام بفترة التعرض للمنتجة. تعرض الخصيتين (وهكذا الخلايا) إلى ارتفاع تركيزات كريوبروتيكتانت (لا سيما في الحل التزجيج) لفترة طويلة جداً قد يؤدي إلى موت الخلية بسبب التسمم كريوبروتيكتانت. العناية أيضا، عندما تسقط الإبر في النتروجين السائل؛ تمحو الفائض في مقابل نظراً لأنه قد يؤثر على عملية التبريد ويغرق الإبر بسرعة لتفادي التعرض لبخار النتروجين السائل. وأخيراً، نقل الخصيتين من النتروجين السائل في وسائط الإعلام الاحترار بسرعة تفاديا للاحترار سابق لأوانه في الهواء أثناء نقل.
في هذه الورقة نقدم الإجراء لنعد الخصيتين من خمس سلالات الزرد باستخدام ميوه والتعبئة ولي2حتى تتخلل المنتجة. الأسلوب غلة نتائج موثوقة لجميع سلالات الزرد اختبارها مع بقاء خلية أعلى من 50%. فمن الممكن لاستخدام هذا الأسلوب مع بعض التعديلات للأنواع الأخرى، وكذلك. أولاً، هو بروتوكول نعد كل الأنواع المحددة، والمنتجة مختلفة تسفر عن كفاءات مختلفة في أنواع مختلفة (أي الإثيلين غليكول أسفرت عن جدوى أعلى في أسيبينسيريدس18 بينما لي2حتى أسفرت عن جدوى أعلى في السلمون19 والكارب17). علاوة على ذلك ينبغي إيلاء الاهتمام للتركيزات المستخدمة، وكذلك. هذه الدراسة، والدراسة التي أجريت على براون التراوت Salmo trutta المبايض15 تبين أنه يتم الحصول على أفضل النتائج باستخدام نفس تركيز المنتجة اثنين، ولكن هذا قد تختلف في الأنواع الأخرى. وأخيراً، الخصيتين الزرد صغيرة جداً، وأنه من الممكن حتى لدبوس الخصيتين عدة في إبرة واحدة. حجم الخصية القطع التي يتم استخدامها عند العمل مع الأنواع مع أكبر قوتين نوويتين، عامل مهم جداً. ونقترح زيادة مرات التعرض لقطع الأنسجة أكبر آخذا في الاعتبار السمية كريوبروتيكتانت والكفاءة.

الاتجاهات الجديدة في مجال العلم والتكنولوجيا الحيوية أدت إلى خلق آلاف خطوط جديدة متحولة من الفئران و المورفولوجية، الزرد وغيرها من الأنواع التي تستخدم كنموذج الكائنات الحية في الطب الحيوي و العلوم الأخرى1. وعلاوة على ذلك، كما يتم تطوير التكنولوجيات الجديدة وتصبح متاحة، أرقام الأسطر متحولة اطراد زيادة2. وهذا يؤدي إلى ضرورة لتخزين آمنة للموارد الجينية خارج الممارسات المشتركة للحفاظ على تكاثر المستعمرات. للواسمات كأسلوب التي يمكن تخزينها في مكان أمن للموارد الجينية لفترة غير محددة من الوقت، يوفر مزايا عديدة مثل تمديد الموسم الإنجابية، تلتف الحاجة إلى صيانة مستمرة للأمهات، وهو أكثر تكلفة--و 2من كفاءة العمل.
بروتوكولات لتجميد الحيوانات المنوية خلال مدى عدة سنوات2،3،4 فرصة لنجاح تخزين المواد الوراثية الذكور الزرد. ومع ذلك، نعد من البيض أو الأجنة في الأسماك لم يتم ممكناً بفضل بنيتها المعقدة وكميات كبيرة من مادة الصفار. في الآونة الأخيرة، يقدم ممارسة زرع الخلايا الجرثومية الأساسية (بجكس) أو الخلايا الجذعية سبيرماتوجونيال (SSCs) تجاوز لهذا الحاجز بتطوير وظيفي الحيوانات المنوية والبيض بعد زرع5. ولذلك، يقدم للواسمات SSCs أفقاً جديداً في حفظ الموارد الوراثية النادرة والقيمة.
على الرغم من أن نعد يوفر العديد من المزايا، بمعدل بطيء عملية تجميد يولد العديد من الشروط التي قد تؤدي إلى تلف الخلية2. وهذه تشمل تشكيل الجليد داخل الخلية وخارج الخلية، والجفاف، وسمية كريوبروتيكتانت وغيرها. أضرار الجليد داخل الخلية الخلايا، والجليد خارج الخلية قد يؤدي إلى سحق الميكانيكية للخلايا، في حين نشر المياه من الخلايا خلال معدل بطيء التجميد قد يؤدي إلى الجفاف6. في الآونة الأخيرة، تم تطبيق التزجيج كأسلوب الذي يمنع الآثار السلبية لتشكيل الجليد في تجميد الأسماك الأمشاج7،،من89. وهو يقدم أسلوب تبريد سريع جداً من خلالها تتحول وسائل الإعلام الداخلية والخارجية لدولة غير متبلور/زجاجي دون كريستاليزينج في الجليد7،10. وقد تجلى التزجيج ناجحة من أنسجة الخصية والمبيض في أنواع الطيور والثدييات10،11،12، مما فتح إمكانيات لتطبيقه في الأسماك، وكذلك.
في هذه الدراسة، نقدم الإجراء التزجيج (يقول:) إبرة مغمورة لنعد الخصيتين الزرد كله. علينا أن نظهر طريقة موثوقة لعزل الخلايا الجرثومية في مرحلة مبكرة الزرد دون التلوث وعملية تجميد أن ينتج كميات عالية نسبيا من الخلايا الجرثومية في مرحلة مبكرة مع وجود انخفاض للخلايا الأخرى، لا سيما من المني. على حد علمنا، هذا هو أول دراسة لإثبات بروتوكول تصور مفصل للتبريد السريع جداً للأسماك جوندال الأنسجة والخلايا germline الزرد. بالإضافة إلى ذلك، يظهر التكرار للأسلوب في خمس سلالات مختلفة الزرد: AB البرية نوع، كاسبر (روي--/--؛ الصدف-/-،) ليوبارد (ليوt1/t1) وفأسا [تيراغرام (vas::eGFP)] و Wilms الورم [تيراغرام (wt1b::eGFP 1)] خط المحورة وراثيا.

<table><tbody><tr><td>Leibovitz media (L-15)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1518</td><td>Supplemented with L-glutamine</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine methanesulfonate (MS-222)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Acros Organics</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>Trehalose</td><td>Acros Organics</td><td>99-20-7</td><td>Dihydrate</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Reanal</td><td>20740-0-08-65</td><td></td></tr><tr><td>Propylene glycol</td><td>Reanal</td><td>08860-1-08-65</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Reanal</td><td>00190-1-01-65</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Gibco</td><td>9001-12-1</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8003</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Panreac AppliChem</td><td>A3778</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6146</td><td></td></tr><tr><td>Phospate buffered saline (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td>Tablets for preparation of 200 ml PBS solution</td></tr></tbody></table>

cryopreservation of zebrafish spermatogonia by whole testes needle immersed ultra-rapid cooling

الاتجاهات الحالية في مجال العلم والتكنولوجيا الحيوية يؤدي إلى خلق الآلاف من خطوط جديدة في نموذج الكائنات الحية مما يؤدي إلى ضرورة اتباع أساليب جديدة للتخزين الأمن للموارد الجينية خارج الممارسات المشتركة للحفاظ على تكاثر المستعمرات. وكان الغرض الرئيسي من هذه الدراسة التكيف مع الإبرة مغمورة الداخلي التزجيج (يقول:) كريوبريسيرفي الخصيتين الزرد كله. تجميد الخلايا الجرثومية في مرحلة مبكرة من الخصيتين كله يقول: يوفر إمكانيات لتخزين الزرد الموارد الجينية، وخصوصا بعد زرع الأعضاء أنهم يمكن أن تنضج في الأمشاج الذكور والإناث على حد سواء. وقد اقتطعت الخصيتين، معلقة على إبرة الوخز بالإبر، اكويليبراتيد في اثنين من وسائط الإعلام كريوبروتيكتيفي (الحل الموازنة التي تحتوي على الميثانول 1.5 متر و 1.5 متر البروبيلين غليكول؛ والحل التزجيج المحتوية على م 3 ثنائي ميثيل سلفوكسيد و 3 م البروبيلين غليكول) وانخفضت إلى النيتروجين السائل. وقد استعد عينات في سلسلة من ثلاثة حلول الاحترار ما يترتب عليها. المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي (1) عدم وجود المني بعد الهضم من حرارة الخصيتين مما يسهل التلاعب المتلقين للمعلومات؛ (2) فائقة السرعة التبريد تمكين الأمثل تعرض الأنسجة للنتروجين السائل ولتعظيم التبريد وخفض تركيز المطلوبة المنتجة، مما يقلل من سميتها؛ (3) متزامن تعرض الخصيتين عدة للمنتجة والنتروجين السائل؛ والتكرار (4) يتبين من الحصول على صلاحية فوق 50 في المائة في خمس سلالات مختلفة الزرد.

في المتوسط، وعدد الخلايا الجرثومية في مرحلة مبكرة معزولة عن الخصية الزرد طازجة واحدة تراوحت بين الخلايا 40,000 و 200 ألف حسب حجم الأسماك. عند هضم الخصيتين الزرد الطازجة في جميع سلالات 5، الخلايا الجرثومية المبكر لم تكن الخلايا فقط موجودة في تعليق خلية (الشكل 2). بجوار الخلايا الجرثومية في مرحلة مبكرة، والمنى عديدة عثر كذلك. من ناحية أخرى، كان هناك أقل بكثير المني بعد هضم cryopreserved الخصيتين. وأشار هذا إلى أن المني لا ينجون من هذا البروتوكول تبريد فائقة السرعة، وأنها على الأرجح القضاء أثناء عملية الهضم، التي تعطي تعليق أنظف للخلايا الجرثومية في مرحلة مبكرة.
كانت هناك لا اختلافات كبيرة في عدد الخلايا الجرثومية في مرحلة مبكرة بين الخصيتين اليمنى واليسرى (1 ± 0.5 × 105 مقابل 1.1 ± 0.7 × 105) فرد واحد تظاهر بهضم الخصيتين الطازجة ثلاثة من الذكور الزرد AB (ANOVA أحادي الاتجاه ; و (1، 4) = 0.04، p = 0.85). في جميع خطوط الزرد المستخدمة في هذه الدراسة، البروتوكول تبريد فائقة السرعة الحالية أسفرت عن بقاء متوسط معدلات أعلى من 50 في المائة (الجدول 1).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>نوع البرية AB</td>
			<td>كاسبر</td>
			<td>ليوبارد</td>
			<td>فاسا المحورة وراثيا</td>
			<td>ورم Wilms المعدلة وراثيا</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">عدد الخلايا الحية (× 104)</td>
			<td>الخصية الطازجة</td>
			<td>14.5 ± 3.9</td>
			<td>9.5 ± 2.3</td>
			<td>12.7 ± 2.4</td>
			<td>14.5 ± 5.6</td>
			<td>4.8 ± 1.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>الخصية المزججة</td>
			<td>8.7 ± 2.8</td>
			<td>7.2 ± 3.0</td>
			<td>8.8 ± 1.7</td>
			<td>7.6 ± 3.7</td>
			<td>2.4 ± 0.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>صلاحية (%)</td>
			<td></td>
			<td>58 ± 9</td>
			<td>72 ± 13</td>
			<td>69 ± 1</td>
			<td>50 ± 6</td>
			<td>53 ± 13</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1- عدد الخلايا الحية ونسب البقاء (يعني ± التنمية المستدامة) التي تم الحصول عليها من الزرد طازجة أو الشركة إنتاج/ارتفعت درجة حرارة الخصية. وترد نتائج لخمسة أسطر الزرد اختبار: AB البرية نوع، كاسبر (روي--/--؛ الصدف-/-،) ليوبارد (ليوt1/t1) وفأسا [تيراغرام (vas::eGFP)] و Wilms الورم [تيراغرام (wt1b::eGFP 1)] خط المحورة وراثيا.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56118/56118fig1.jpg"> الشكل 1. تشريح الزرد الكبار مما يدل على موقف مختلف الهياكل التشريحية. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56118/56118fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56118/56118fig2.jpg"> الرقم 2. خلايا المعلقات المعدة من الزرد الطازجة والشركة إنتاج/ارتفعت درجة حرارة أنسجة الخصية من خمسة أسطر الزرد المختبرة (نوع البرية AB، كاسبر (روي-/-؛ الصدف-/-،) ليوبارد (ليوt1/t1) وفأسا [تيراغرام (vas::eGFP)] و Wilms الورم [تيراغرام (wt1b::eGFP 1)] خط المعدلة وراثيا) تصويرها مع التباين مرحلة الفحص المجهري. شريط الحجم: 40 ميكرومتر. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56118/56118fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about Cryopreservation of Zebrafish Spermatogonia by Whole Testes Needle Immersed Ultra-Rapid Cooling at JoVE.com

Cryopreservation of Zebrafish Spermatogonia by Whole Testes Needle Immersed Ultra-Rapid Cooling

للواسمات Spermatogonia الزرد بأكملها الخصيتين إبرة مغمورة تبريد فائقة السرعة

وكان الغرض الرئيسي من هذه الدراسة التكيف مع الإبرة مغمورة الداخلي التزجيج (يقول:) كريوبريسيرفي الخصيتين الزرد كله. بالإضافة إلى ذلك، تم اختبار التكرار الأسلوب في خمس سلالات مختلفة الزرد.

Current trends in science and biotechnology lead to creation of thousands of new lines in model organisms thereby leading to the necessity for new methods ...

cryopreservation-zebrafish-spermatogonia-whole-testes-needle-immersed

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

8.2K Views.  Szent István University. وكان الغرض الرئيسي من هذه الدراسة التكيف مع الإبرة مغمورة الداخلي التزجيج (يقول:) كريوبريسيرفي الخصيتين الزرد كله. بالإضافة إلى ذلك، تم اختبار التكرار الأسلوب في خمس سلالات مختلفة الزرد.

Video: Cryopreservation of Zebrafish Spermatogonia by Whole Testes Needle Immersed Ultra-Rapid Cooling

Ploidy Manipulation of Zebrafish Embryos with Heat Shock 2 Treatment

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, specifically the generation of homozygous gynogenetic diploids is useful in genetic analysis because it allows the direct production of homozygotes from a single heterozygous mother. This article describes a modified protocol for ploidy duplication based on a heat pulse during the first cell cycle, Heat Shock 2 (HS2). Through inhibition of centriole duplication, this method results in a precise cell division stall during the second cell cycle. The precise one-cycle division stall, coupled to unaffected DNA duplication, results in whole genome duplication. Protocols associated with this method include egg and sperm collection, UV treatment of sperm, in vitro fertilization and heat pulse to cause a one-cell cycle division delay and ploidy duplication. A modified version of this protocol could be applied to induce ploidy changes in other animal species.

A modified protocol for ploidy manipulation uses a heat shock to induce a one-cycle stall in cytokinesis in the early embryo. This protocol is demonstrated in the zebrafish but may be applicable to other species.

التلاعب الصيغة الصبغية من الزرد الأجنة مع الحرارة صدمة 2 العلاج

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, ...

Developmental Biology

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding the chromosome events that take place during meiotic prophase, including the pairing, synapsis, and recombination events that ensure proper chromosome segregation. While the mouse has been an important model for understanding the molecular mechanisms underlying these processes, not all meiotic events in this system are analogous to human meiosis. We recently demonstrated the exciting potential of the zebrafish as a model of human spermatogenesis. Here we describe, in detail, our methods to visualize meiotic chromosomes and associated proteins in chromosome spread preparations. These preparations have the advantage of allowing high resolution analysis of chromosome structures. First, we describe the procedure for dissecting testes from adult zebrafish, followed by cell dissociation, lysis, and spreading of the chromosomes. Next, we describe the procedure for detecting the localization of meiotic chromosome proteins, by immunofluorescence detection, and nucleic acid sequences, by fluorescence in situ hybridization (FISH). These techniques comprise a useful set of tools for the cytological analysis of meiotic chromatin architecture in the zebrafish system. Researchers in the zebrafish community should be able to quickly master these techniques and incorporate them into their standard analyses of reproductive function.

Nuclear surface spreads are an indispensable tool for studying chromosome events during meiosis. Here we demonstrate a method to prepare and visualize meiotic chromosomes during prophase I from zebrafish spermatocytes.

إعداد ينتشر كروموسوم Meiotic من الحيوانات المنوية زيبرافيش

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding ...

Genetics

Screening Sperm for the Rapid Isolation of Germline Edits in Zebrafish

The advent of targeted CRISPR-Cas nuclease technologies has revolutionized the ability to perform precise genome editing in both established and emerging model systems. CRISPR-Cas genome editing systems use a synthetic guide RNA (sgRNA) to target a CRISPR-associated (Cas) endonuclease to specific genomic DNA loci, where the Cas endonuclease generates a double-strand break. The repair of double-strand breaks by intrinsic error-prone mechanisms leads to insertions and/or deletions, disrupting the locus. Alternatively, the inclusion of double-stranded DNA donors or single-stranded DNA oligonucleotides in this process can elicit the inclusion of precise genome edits ranging from single nucleotide polymorphisms to small immunological tags or even large fluorescent protein constructs. However, a major bottleneck in this procedure can be finding and isolating the desired edit in the germline. This protocol outlines a robust method for screening and isolating germline mutations at specific loci in Danio rerio (zebrafish); however, these principles may be adaptable in any model where in vivo sperm collection is possible.

CRISPR-Cas technologies have revolutionized the field of genome editing. However, finding and isolating the desired germline edit remains a major bottleneck. Therefore, this protocol describes a robust method for quickly screening F0 CRISPR-injected zebrafish sperm for germline edits using standard PCR, restriction digest, and gel electrophoresis techniques.

فحص الحيوانات المنوية للعزل السريع لتعديلات الخط الجرثومي في الزرد

The advent of targeted CRISPR-Cas nuclease technologies has revolutionized the ability to perform precise genome editing in both established and emerging ...

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to the original protocol that both streamline the procedure and increase sample uniformity.  First, we normalize all sperm volumes using freezing media that does not contain the cryoprotectant. Second, cryopreserved sperm are stored in cryovials instead of capillary tubes.  The rates of sperm freezing and thawing (&delta;&deg;C/time) are probably the two most critical variables to control in this procedure.  For this reason, do not substitute different tubes for those specified.  Working in teams of 2 it is possible to freeze the sperm of 100 males per team in ~2 hrs.  Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility (measured as the number of viable embryos generated in an in vitro fertilization divided by the total number of eggs fertilized) and this percent fertility is stable over many years.

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a high-throughput sperm cryopreservation protocol for zebrafish. Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility in subsequent vitro fertilization and is stable over many years.

أسلوب الإنتاجية العالية للحصول على الحيوانات المنوية الحفظ بالتبريد واسماك الزرد في المختبر التسميد

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

Making Gynogenetic Diploid Zebrafish by Early Pressure

Heterozygosity in diploid eukaryotes often makes genetic studies cumbersome. Methods that produce viable homozygous diploid offspring directly from heterozygous females allow F1 mutagenized females to be screened directly for deleterious mutations in an accelerated forward genetic screen. Streisinger et al.1,2 described methods for making gynogenetic (homozygous) diploid zebrafish by activating zebrafish eggs with ultraviolet light-inactivated sperm and preventing either the second meiotic or the first zygotic cell division using physical treatments (heat or pressure) that deploymerize microtubules. The "early pressure" (EP) method blocks the meiosis II, which occurs shortly after fertilization. The EP method produces a high percentage of viable embryos that can develop to fertile adults of either sex. The method generates embryos that are homozygous at all loci except those that were separated from their centromere by recombination during meiosis I. Homozygous mutations are detected in EP clutches at between 50% for centromeric loci and less than 1% for telomeric loci. This method is reproduced verbatim from the Zebrafish Book3.

This is a method for generating gynogenetic diploid zebrafish embryos (embryos whose only genetic contribution comes from the mother) by blocking the second meiotic division immediately after fertilization with ultraviolet light-inactivated sperm. EP embryos are not fully homozygous due to recombination during the first meiotic division, however they are homozygous at all loci that have not been separated from their centromere by recombination.

جعل Gynogenetic اسماك الزرد ضعفاني بواسطة الضغط المبكر

Heterozygosity in diploid eukaryotes often makes genetic studies cumbersome. Methods that produce viable homozygous diploid offspring directly from ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. Although many immunohistochemistry protocols have been optimized for mammalian tissue and tissue sections, these protocols often require modification and optimization for non-mammalian model organisms. Zebrafish are increasingly used as a model system in basic, biomedical, and translational research to investigate the molecular, genetic, and cell biological mechanisms of developmental processes. Zebrafish offer many advantages as a model system but also require modified techniques for optimal protein detection. Here, we provide our protocol for whole-mount fluorescence immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. This protocol additionally describes several different mounting strategies that can be employed and an overview of the advantages and disadvantages each strategy provides. We also describe modifications to this protocol to allow detection of chromogenic substrates in whole mount tissue and fluorescence detection in sectioned larval tissue. This protocol is broadly applicable to the study of many developmental stages and embryonic structures.

Here, we present a protocol for fluorescent antibody-mediated detection of proteins in whole preparations of zebrafish embryos and larvae.

كامل جبل المناعة الكيمياء في الأجنة حمار وحشي واليرقات

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for forward genetic analysis of developmental processes due to their external fertilization, embryonic size, rapid ontogeny, and optical clarity &#8211; a constellation of traits that enable the direct observation of events ranging from gastrulation to organogenesis with a basic stereomicroscope. Further, zebrafish embryos can survive for several days in the haploid state. The production of haploid embryos in vitro is a powerful tool for mutational analysis, as it enables the identification of recessive mutant alleles present in first generation (F1) female carriers following mutagenesis in the parental (P) generation. This approach eliminates the necessity to raise multiple generations (F2, F3, etc.) which involves breeding of mutant families, thus saving the researcher time along with reducing the needs for zebrafish colony space, labor, and the husbandry costs. Although zebrafish have been used to conduct forward screens for the past several decades, there has been a steady expansion of transgenic and genome editing tools. These tools now offer a plethora of ways to create nuanced assays for next generation screens that can be used to further dissect the gene regulatory networks that drive vertebrate ontogeny. Here, we describe how to prepare haploid zebrafish embryos. This protocol can be implemented for novel future haploid screens, such as in enhancer and suppressor screens, to address the mechanisms of development for a broad number of processes and tissues that form during early embryonic stages.

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish is a powerful model system for developmental biology and human disease research due to their genetic similarity with higher vertebrates. This protocol describes a methodology to create haploid zebrafish embryos that can be utilized for forward screen strategies to identify recessive mutations in genes essential for early embryogenesis.

إنتاج فرداني الزرد الأجنة عن طريق<em&gt; في المختبر</em&gt; التسميد

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and purification of RNA, DNA, and proteins. All of these applications demand the rapid recovery of significant numbers of zebrafish hearts to avoid gene regulatory, metabolic, and other changes that begin after death. Adult zebrafish hearts are also required for studying heart structure for a variety of mutants and for studying heart regeneration. However, the traditional zebrafish heart dissection is slow and difficult and requires specialized tools, making large-scale dissection of adult zebrafish hearts tedious. Traditional methods also harbor the risk of damaging the heart during the dissection. Here, we describe a method for dissection of adult zebrafish hearts that is fast, reproducible, and preserves heart architecture. Furthermore, this method does not require specialized tools, is painless for the zebrafish, can be performed on fresh or fixed specimens, and can be performed on zebrafish as young as one month old. The approach described expands the use of adult zebrafish for cardiovascular research.

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

التعافي من اسماك الزرد الكبار قلوب للتطبيقات عالية الإنتاجية

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

Repeated Blood Collection for Blood Tests in Adult Zebrafish

Repeated blood collection is one of the most common techniques performed on laboratory animals. However, a non-lethal protocol for blood collection from zebrafish has not been established. The previous methods for blood collection from zebrafish are lethal, such as lateral incision, decapitation and tail ablation. Thus we have developed a novel &#8220;repeated&#8221; blood collection method, and present here a detailed protocol outlining this procedure. This method is minimally invasive and results in a very low mortality rate (2.3%) for zebrafish, thus enabling repeated blood sampling from the same individual. The maximum volume of blood sampling is dependent on body weight of the fish. The volume for repeated blood sampling at intervals should be&#160;&#8804;0.4% of body weight every week or &#8804;1% every 2 weeks, which were evaluated by measurements of blood hemoglobin. Additionally, hemoglobin, fasting blood glucose, plasma triacylglycerol (TG) and total cholesterol levels in male and female adult zebrafish were measured. We also applied this method to investigate the dysregulation of glucose metabolism in diet-induced obesity. This blood collection method will allow many applications, including glucose and lipid metabolism and hematological studies, which will increase the use of zebrafish as a human disease model organism.

Repeated blood sampling is necessary and important in animal research. We developed a novel, non-lethal and reliable method for repeated blood collection from adult zebrafish, and applied this method to the study of blood biochemistry, including glucose metabolism.

كرر جمع الدم لاختبارات الدم في اسماك الزرد الكبار

Repeated blood collection is one of the most common techniques performed on laboratory animals. However, a non-lethal protocol for blood collection from ...

Sequential Immunofluorescence and Immunohistochemistry on Cryosectioned Zebrafish Embryos

Investigation of intercellular interactions often requires discrete labeling of specific cell populations and precise protein localization. The zebrafish embryo is an excellent tool for examining such interactions with an in vivo model. Whole-mount immunohistochemical and immunofluorescence assays are frequently applied in zebrafish embryos to assess protein expression. However, it can be difficult to achieve accurate mapping of co-localized proteins in three-dimensional space. In addition, some studies may require the use of two antibodies that are not compatible with the same technique (e.g., antibody 1 is only suitable for immunohistochemistry and antibody 2 is only suitable for immunofluorescence). The purpose of the method described herein is to perform sequential immunofluorescence and/or immunohistochemistry on individual cryosections derived from early-stage zebrafish embryos. Here we describe the use of sequential rounds of immunofluorescence, imaging, immunohistochemistry, imaging for a single cryosection in order to achieve precise identification of protein expression at the single-cell level. This methodology is suitable for any study in early-stage zebrafish embryos that requires accurate identification of multiple protein targets in individual cells.

This protocol demonstrates sequential immunofluorescence and immunohistochemistry on cryosections from early-stage zebrafish embryos enabling precise colocalization analyses in specific cell populations.

الفلورة المناعية المتسلسلة والكيمياء المناعية على أجنة حمار وحشي مقطعة بالتبريد

Investigation of intercellular interactions often requires discrete labeling of specific cell populations and precise protein localization. The zebrafish ...