يوضح هذا البروتوكول إجراءً جديدًا للفلورس المناعية المتتابعة والكيمياء المناعية على عمليات النقوش من مخروط الحمار الوحشي في المراحل المبكرة ، مما يتيح إجراء تحليلات دقيقة للتوطين المشترك في مجموعات خلايا محددة. الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هو انها المرونة. فهو يجمع بين الفلوروسين المناعي وتقنيات الكيمياء المناعية باستخدام عملية شعورية واحدة لتحقيق أقصى قدر من مورفولوجيا الأنسجة، والتعريب المشترك للتعبير وتوافق الأجسام المضادة.
ويمكن تطبيق هذا البروتوكول على أنواع الأسماك الأخرى أو البرمائية لأن هؤلاء الباحثين غالبا ما يواجهون مضاعفات مماثلة مع توافر الأجسام المضادة وغالبا ما يقومون بإجراء أنواع مماثلة من التجارب. يمكن أن يكون العمل مع عمليات االشراكات الجنينية في مرحلة مبكرة صعبًا نظرًا لأنها صغيرة ويمكن أن يكون التبكير تحديًا ، ولكن الإعداد المتقدم والممارسة سيساعدان في تخفيف أي صراعات في هذا الأسلوب. هناك خطوات متعددة في بروتوكول لدينا التي تتطلب معالجة خاصة والرعاية ويمكن أن يكون من الصعب السيطرة دون رؤية شخص ما تثبت التقنيات.
للبدء، نقل السابق ثابتة وأعد ثمانين ساعة بعد الإخصاب أجنة حمار وحشي من أنبوب مع 15 25 أكتوبر خليط إلى قالب من البلاستيك باستخدام ملقط التقليل من أي نقل للخليط. ملء القالب ما يقرب من نصف مع متوسطة OCT وخلط بلطف الأجنة في ذلك. إعداد قوالب بلاستيكية وصفت ونقل الأجنة المطلوب في قوالب بلاستيكية فارغة المسمى، والتقليل من حمل أوكت المتوسطة.
ثم ملء بلطف مع أوكت المتوسطة إلى الجزء العلوي من القوالب مع الأجنة. العمل تحت مجهر ستيريو ضوء للتصور، واستخدام الإبر لترتيب الأجنة في الاتجاه المطلوب. ثم ضع القوالب المعدة في حاوية معزولة مع منصة معدنية وتجميدها على الجليد الجاف.
ضع دلو الثلج بلطف فوق المنصة المعدنية لإنشاء غرفة باردة وتجميد لمدة 30 دقيقة تقريبًا. باستخدام مجموعة التبريد في ناقص 20 درجة مئوية، وقطع الأجنة جزءا لا يتجزأ في 10 إلى 12 ميكرومتر سميكة الاقطتين بينما التحقق من عمق القسم بشكل دوري على المجهر لرصد الموقع والأنسجة. ضع المقاطع على الشرائح الزجاجية المشحونة وتجفيف الهواء لهم في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها.
اغسل الشرائح ثلاث مرات لمدة خمس دقائق في برنامج تلفزيوني 1X في حاوية مناسبة. وضع الشرائح على سطح مستو في غرفة رطبة. استخدم قلماً للحواجز لتحديد المقاطع للاحتفاظ بالسائل على الشرائح.
Pipette 200 ميكرولترات من كتلة العازلة في القسم الواحد واحتضان في كتلة العازلة لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. إعداد التخفيف من الأجسام المضادة الأولية وكتلة العازلة ومزيج جيد عن طريق الأنابيب. قم بتبريح الشرائح بلطف لاستنزاف المخزن المؤقت والعودة إلى الغرفة الرطبة.
Pipette 200 ميكرولترات من محلول الأجسام المضادة الأولية لكل مقطع على الشرائح و 200 ميكرولترات من كتلة العازلة على أقسام مناسبة كتحكم. احتضان الشرائح عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها في غرفة رطبة مليئة بالماء غير المتأين مع التأكد من ختم حواف الغرفة للمساعدة في الحفاظ على الرطوبة. اغسل الشرائح ثلاث مرات لمدة خمس دقائق في برنامج تلفزيوني 1X وفي حاوية مناسبة.
إعداد تخفيف الأجسام المضادة الثانوية أثناء الغسيل وكتلة العازلة وخلط جيدا عن طريق الأنابيب. بعد وضع الشرائح على سطح مستو في غرفة رطبة، أضف 200 ميكرولترات من محلول الأجسام المضادة الثانوية لكل قسم. احتضان الشرائح في حل الأجسام المضادة الثانوية في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 30 دقيقة.
اغسل الشرائح ثلاث مرات لمدة خمس دقائق في برنامج تلفزيوني 1X في حاوية مناسبة. بعد وضع الشرائح على سطح مستو، أضف محلول التلطيخ النووي على كل قسم واحتضان مغطى لمدة 10 دقائق. بعد استنزاف قبالة حل تلطيخ النووية، تحميل الشرائح مع وسائل الإعلام الفلورسنت غير تصلب تصاعد وزلة غطاء زجاجي.
التأكد من إبقائها في الظلام عند أربع درجات مئوية حتى التصوير. ضع الشرائح في حاويات فردية مع PBS 1X واخزن شقة عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها ، في حين تهيج بلطف لتخفيف زلات الغطاء بما فيه الكفاية حتى يخرجوا عندما يهتاج. تأكد من عدم الضغط لأسفل على زلة الغطاء أو محاولة إزالة زلة الغطاء يدويًا ولكن انتظر حتى تأتي مع الحد الأدنى من الحركة القسرية.
بعد إزالة قسائم الغطاء، قم بنقل الشرائح بلطف إلى حاوية تحتوي على PBS 1X جديد. إزالة 1X PBS واحتضان الشرائح في 1X تريس المخزنة المالحة مع 0.1٪ من السطح غير الأيونية ثلاث مرات لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. احتضان الشرائح في 3٪ محلول بيروكسيد الهيدروجين في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
ثم وضع الشريحة مسطحة وإضافة كتلة العازلة إسقاط الحكمة إلى السطح. قم بتلميح الشرائح بلطف لتفريغ المخزن المؤقت للكتلة. جفف المنطقة المحيطة بالقسم ووضع الشرائح مسطحة في غرفة رطبة.
أضف 200 ميكرولترات من محلول الأجسام المضادة الأولية لكل قسم على الشرائح وحضن في غرفة رطبة عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. قم بثني الشرائح بلطف لاستنزاف محلول الأجسام المضادة الأساسي وغسلها مرتين لمدة خمس دقائق في 1X TBST. ثم تطبيق على استعداد لاستخدام الخلفية الحد من منع انخفاض كاشف الحكمة إلى كل قسم، واحتضان في غرفة رطبة في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
قم بتلميح الشرائح بلطف لتفريغ المخزن المؤقت للكتلة. جفف المنطقة المحيطة بالقسم بعناية ووضع الشرائح مسطحة في غرفة رطبة. تطبيق جاهز لاستخدام حل الأجسام المضادة الثانوية لكل قسم إسقاط الحكمة واحتضان في غرفة رطبة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
قم بثني الشرائح بلطف لاستنزاف محلول الأجسام المضادة الثانوية وغسلها مرتين لمدة خمس دقائق في 1X TBST. بعد تجفيف المنطقة المحيطة بالقسم، ضع الشرائح على سطح مستو وأضف 200 ميكرولترات من الركيزة الكروموموجينية للHRP إلى كل قسم. بدء مؤقت عندما تم تطبيق الركيزة على الشريحة الأولى واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث دقائق.
استنزاف قبالة الحل الركيزة. شطف الشرائح لفترة وجيزة في وعاء مناسب مع 1X PBS وغسلها في الماء الأيونية مرتين لمدة خمس دقائق مع التحريض لطيف. قم بوضع الشرائح في وضعها في محلول تلطيخ الهما أوكسلين لمدة تصل إلى 30 ثانية وتغسل ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منها في الماء الأيون.
احتضان الشرائح في حاوية تحتوي على سكوت Tapwater لمدة دقيقة واحدة ثم يغسل مرة أخرى ثلاث مرات لمدة خمس دقائق في الماء الأيونية. يجفف الشرائح من خلال سلسلة من درجات الإيثانول المخففة في الماء الأيون والزيلين في غطاء محرك السيارة الكيميائي. بعد إزالة الشرائح من الزيلين على الفور إضافة toluene القائمة على تصاعد المتوسطة ووضع زلة الغطاء.
لضمان النجاح أثناء الانزلاق في الغطاء ، من المهم العمل من جانب واحد من الشريحة إلى الأخرى مع خفض زلة الغطاء ببطء لمنع الفقاعات التي من شأنها أن تحجب الأنسجة. وأخيرا، تصور وصور الشرائح باستخدام المجهر ضوء مركب وكاميرا رقمية في التكبير 100X. الأجسام المضادة المحددة المستخدمة هنا للكشف في وقت واحد عن الخلايا المتكاثرة والخلايا المانحة التي تم تحديدها والخلايا المتبرعة التي يتم تحديدها كمياً والتي تنتشر بشكل نشط.
بعد كل من المناعة وhistochemistry المناعة من الضروري توليد صور ذات جودة عالية من أجل تحديد الخلايا الفردية بدقة. تم استخدام برنامج تحليل الصور لتنفيذ تراكب الصورة. عند محاولة هذا الإجراء من المهم للغاية أن تلطخ بشكل كاف ومضادة للشرائح البقع خلال الكيمياء المناعية.
بعد هذا الإجراء يمكن تنفيذ أساليب إضافية كتعديلات على البروتوكول الأصلي، مثل استخدام تركيبات الأجسام المضادة المختلفة، وأنواع الأنسجة، أو الأنواع. ويمكن أيضا تحليل الصور بطرق متنوعة للحصول على البيانات ذات الصلة. سمحت لنا هذه التقنية بالنظر إلى التعريب المشترك والخلفيات الوراثية المتعددة كوسيلة للتحقيق في تفاعلات الخلايا ويمكن تطبيقها على نحو مماثل لتقنيات أخرى تتطلب تحليلًا مفصلًا للتعريب المشترك.
العديد من الكواشف في الكيمياء المناعية خطرة وينبغي أن تعامل وفقا لذلك. وينبغي أن يتم العمل مع الإيثانول، والزيلين، وتصاعد قاسية في غطاء محرك السيارة. وينبغي التخلص من نفايات الداب كما ينبغي تبييض النفايات الخطرة وغسلات ما بعد الداب.
