Name: cryopreservation of zebrafish spermatogonia by whole testes needle immersed ultra-rapid cooling
Uploaded: 2018-03-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cryopreservation of Zebrafish Spermatogonia by Whole Testes Needle Immersed Ultra-Rapid Cooling at JoVE.com

Diese Studie wurde unterstützt durch die nationalen Forschung, Entwicklung und Innovation Office von Ungarn (Grant 116912, ÁH), COST-Büros (Lebensmittel und Landwirtschaft COST Action FA1205: AQUAGAMETE), das Stipendium Hungaricum Stipendienprogramm (Finanzhilfe für ZM) "und" die neu Ungarische nationale Excellence Predoctoral Fellowship (Stipendium, EK).

Alle hier beschriebene Methoden wurden von den ungarischen Tierschutzgesetz genehmigt.
(1) Reagenz Vorbereitung
<ol><li>Stammlösungen<ol>
<li>Bereiten Sie 1 M Trehalose durch Zugabe von 0,378 g Trehalose Dihydrat in 1 mL der dH2O. Mix gut, bis es vollständig auflöst.</li>
		<li>Bereiten Sie 1 M Saccharose durch Zugabe von 0,342 g Saccharose in 1 mL der dH2O. Mix gut, bis es vollständig auflöst.</li>
		<li>Bereiten Sie 1 M HEPES durch Zugabe von 0,238 g HEPES zu 1 mL von dH2O. Mix gut, bis es vollständig auflöst.</li>
		<li>Bereiten Sie 20 mg/mL Kollagenase (290 U/mg vor) durch Zugabe von 100 mg bis 5 mL PBS. Mischen Sie gründlich, bis es sich auflöst. Sterilfilter durch 0,2 µm-Filter. Aliquoten 50 µL in 0,2 mL PCR-Röhren und frieren bei - 20 ° C.</li>
		<li>Vorbereiten von 15 mg/mL Trypsin (~ 10000 U/mg) durch Zugabe von 75 mg auf 5 mL PBS. Mischen Sie gründlich, bis es sich auflöst. Sterilfilter durch 0,2 µm-Filter. Aliquoten 50 µL in 0,2 mL PCR-Röhren und frieren bei - 20 ° C.</li>
		<li>Bereiten Sie 1 mg/mL DNase ich (~ 3000 U/mg) durch Zugabe von 5 mg bis 5 mL PBS. Mischen Sie gründlich, bis es sich auflöst. Sterilfilter durch 0,2 µm-Filter. Aliquoten 50 µL in 0,2 mL PCR-Röhren und frieren bei - 20 ° C.</li>
		<li>Bereiten Sie 0,4 % Trypan blau 10 mL PBS 40 mg Trypan Blau hinzu. Sterilfilter durch 0,2 µm-Filter. Aliquoten 1 mL in 1,5 mL Röhrchen.</li>
		<li>Vorbereiten von 200 mg/L MS-222 (Tricaine Methan Sulfonate) durch Zugabe von 200 mg von MS-222 in 1 L dH2O. Mix gut, bis es vollständig auflöst. Darüber hinaus die MS-222 Pufferlösung mit Natriumbicarbonat zu einem neutralen pH-Wert von 7,0.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lösungen für Verglasung<ol>
<li>Bereiten Sie Gleichgewichtherstellung Lösung (ES): bereiten Sie 2 mL ES durch Mischen 121,5 µL von Methanol (MeOH; 1,5 M), 220 µL von Propylenglykol (PG, 1,5 M), 200 µL des FBS (10 %), 200 µL Trehalose-Stammlösung (0,1 M), 50 µL der Stammlösung HEPES (25 mM) und 1208.5 µL des L-15 in ein 2 mL-Tube.</li>
		<li>Bereiten Vitrification Lösung (VS): 2 mL VS durch das Mischen von 439 µL PG (3 M), 426 µL Dimethyl Sulfoxid vorbereiten (mir2SO; 3 M), 200 µL des FBS (10 %), 200 µL der Stammlösung Trehalose (0,1 M), 50 µL HEPES Lager-Lösung (25 mM) und 685 µL des L-15 in eine 2 mL-Tube.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lösungen für die Erwärmung<ol>
<li>Bereiten Sie wärmende Lösung 1 (WS1): bereiten Sie 1,5 mL WS1 in einer 2 mL-Tube durch Mischen 150 µL des FBS (10 %), 450 µL der Stammlösung Saccharose (3 M) und 900 µL des L-15.</li>
		<li>Bereiten Sie wärmende Lösung 2 (WS2): bereiten Sie 1,5 mL WS2 in einer 2 mL-Tube durch Mischen 150 µL des FBS (10 %), 150 µL der Stammlösung Saccharose (1 M) und 1200 µL des L-15.</li>
		<li>Bereiten Sie wärmende Lösung 3 (WS3): bereiten Sie 1,5 mL WS2 in einer 2 mL-Tube durch Mischen 150 µL EB (10 %) und 1350 µL des L-15.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aufschlusslösung vorzubereiten: für jede Probe vorbereitet 500 µL der Verdauung-Lösung durch das Mischen von 50 µL der Stammlösung Kollagenase (2 mg/mL), 50 µL der Stammlösung Trypsin (1,5 mg/mL), 10 µL der DNase I (20 µg/mL) und 390 µL des L-15 in einer 2 mL tube.</li>
	<li>Dissektion Werkzeuge erhalten: Schere, Microscissors, Pinzetten, gebogenen Pinzette und Akupunkturnadeln.</li>
</ol>2. Hoden Sammlung
<ol><li>Die Fische einzuschläfern, indem man es in eine Schale mit 200 mg/L MS-222 (pH = 7). Stellen Sie bevor Sie fortfahren mit der Dissektion sicher, dass die Kiemen haben aufgehört sich zu bewegen und, dass mindestens 10 min vergangen seit diesem Moment Tod durch Hypoxie zu gewährleisten.</li>
	<li>Trocknen Sie die Fische durch klopfen sie auf einem Papiertuch und legen Sie es auf der dorsalen Seite auf einen sezierenden Mat.<ol>
<li>Erstens die Becken- und Brust Flossen für einfacher Dissektion abgeschnitten.</li>
		<li>Horizontal schnippeln Sie die Haut auf dem Bauch des Fisches zwischen den Brustflossen und schneiden Sie die Haut und die darunter liegenden Muskeln entlang der Bauch bis die Afterflosse.</li>
		<li>Öffnen Sie die Körperhöhle des Fisches und Heften Sie den linken und rechten Körperwand auf die Dissektion Matte mit Nadeln. Hinweis: Hoden befinden sich über den Magen-Darm-Organe auf beiden Seiten der Schwimmblase (Abbildung 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Um Verunreinigungen zu vermeiden, nicht nehmen die Magen-Darm-Organe, aber sanft zur Seite schieben und Entfernen des Hodens von der gegnerischen Seite. Hoden mit der Körperwand verbunden sind so sorgfältig zu entfernen und das verbindende Peritoneum durch Microscissors geschnitten.</li>
	<li>Zusätzlich, um Verunreinigungen zu vermeiden, erstens sterilisieren die Hoden, indem man sie in 70 % igem Ethanol für 2 s, und legen Sie dann Sie in L-15 auf einer 96-Well-Platte auf dem Eis. Hinweis: Wenn es notwendig ist, Blutgefäße saubere Hoden von Fettgewebe und große genau unter dem Stereomikroskop</li>
</ol>(3) Ultra-schnelle Abkühlung des Testikular-Gewebes
<ol><li>Mark Nadeln mit entsprechenden Etiketten je nach Probe geben und bereiten die Gleichgewichtherstellung (ES) und Verglasung Lösungen (VS).</li>
	<li>Übertragen Sie die Hoden auf eine größere well-Platte oder Schüssel und Stift zwei bis drei Hoden (oder mehr je nach Größe der Nadel) auf eine sterile Akupunkturnadel.<ol>
<li>Positionieren Sie zunächst den Hoden auf gebogenen Pinzette. Legen Sie die Spitze der Nadel in der Mitte der Hoden und ziehen Sie vorsichtig die Hoden nach oben mit der Pinzette.</li>
		<li>Ziehen Sie nach der Punktion des Hodens es vorsichtig nach oben in Richtung der Spitze der Nadel. Stellen Sie sicher die Hoden voneinander getrennt sind und dass sie nicht herunterfallen oder Abrutschen.</li>
		<li>Ort der Nadeln mit angehefteten Hoden in einem 2 mL Röhrchen gefüllt mit L-15 bis Verglasung (bei 25 ° c; Lagerzeit sollte nicht mehr als 1 h). Hinweis: Fixieren die Hoden auf der Nadel sollte erfolgen schnell, um den Hoden Austrocknen verhindert wird.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Übertragen Sie die Nadel mit Hoden in die Gleichgewichtherstellung Lösung und 5 min bei 25˚C inkubieren.</li>
	<li>Übertragen Sie die Nadel in die Verglasung-Lösung und inkubieren Sie für 30 s bei 25˚C.</li>
	<li>Entfernen Sie die Nadel aus der Vitrifikation Lösung, nehmen Sie schnell und schonend die restliche Lösung aus dem Gewebe von einem sterilen Papiertuch auf. Seien Sie vorsichtig, um den Hoden festhalten an das Papiertuch oder Herunterfallen zu vermeiden.</li>
	<li>Legen Sie die Nadel schnell in flüssigen Stickstoff in einer Styropor-Box gelegt. Hinweis: Führen Sie diesen Schritt schnell zu des Gewebes um die Flüssigstickstoff-Dampf zu vermeiden. Verwenden Sie geringe Mengen an flüssigem Stickstoff, um Cross-Kontamination der Proben zu vermeiden.</li>
	<li>Halten Sie die Nadel in flüssigem Stickstoff in eine geschlossene Styropor-Box für 5-10 min.</li>
	<li>PreCool, eine geöffnete 4,5 mL Cryotube und seine Mütze in der gleichen Box.</li>
	<li>Übertragen Sie nach ca. 5-10 min jede Nadel in eine separate Cryotube unter der Oberfläche des flüssigen Stickstoffes und schließen Sie die Cryotube. Achtung: Verwenden Sie immer Schutzkleidung (z. B. isolierte Handschuhe) beim Arbeiten mit flüssigem Stickstoff Exposition kann zu schweren Erfrierungen führen.</li>
	<li>Legen Sie die Cryotube auf dem Metall Rohrstock und legen Sie sie so schnell wie möglich in der Kryobank Kanister. Speichern Sie die Proben in einem Kanister Speicher Dewar bis zur weiteren Verwendung.</li>
</ol>4. Erwärmung Verfahren
<ol><li>Jede Nadel separat zu wärmen. Alle Erwärmung Lösungen sollte bei 25 ° C.</li>
	<li>Lösen Sie die Cryotube aus dem Metall Rohrstock und Tauchen Sie es in flüssigen Stickstoff in einer Styropor-Box gespeichert.</li>
	<li>Öffnen Sie die Cryotube im flüssigen Stickstoff Dampf (mit Pinzette) und lassen Sie die Nadel in den flüssigen Stickstoff.</li>
	<li>Übertragen Sie die Nadel sehr schnell in die erste wärmende Lösung und inkubieren Sie für 1 min (bei 25 ° C). Achten Sie darauf, die Nadel schnell, um zu verhindern, dass die Erwärmung in der Luft während der Übertragung zu übertragen.</li>
	<li>Übertragen Sie die Nadel in die zweite Erwärmung Lösung und inkubieren Sie für 3 min (bei 25 ° C).</li>
	<li>Übertragen Sie die Nadel in die dritte wärmende Lösung und inkubieren Sie für 5 Minuten (bei 25 ° C).</li>
	<li>Lassen Sie die Hoden von der Nadel, indem Sie sie nach unten mit gebogenen Pinzette. Ort jeder erwärmte Hoden einzeln in einen separaten Brunnen (96-Well-Platte) mit 250 µL L-15 ergänzt mit 10 gefüllt % FBS. Stellen Sie sicher, dass der Brunnen nach der Probe beschriftet sind. Halten Sie die well-Platte auf Eis, bis alle Proben erwärmt werden und bis zum weiteren arbeiten.</li>
</ol>(5) Gewebe Verdauung
<ol><li>Bereiten Sie 500 µL der Dissoziation-Lösung für jede Probe in separaten 2-mL-Tuben. Beschriften Sie die Rohre nach dem Code der Probe. Inkubieren Sie die vorbereiteten Dissoziation Lösung für 5 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Fügen Sie das erwärmte Gewebe in der Aufschlusslösung und durch mindestens 30 Bewegungen der kleinen Schere in kleine Stücke schneiden.</li>
	<li>Inkubieren Sie die geschnittenen Gewebe auf einem schütteln Teller für 90 min bei 25 ° c.</li>
	<li>Beenden Sie den Verdauungsprozess durch Zugabe von 400 µL L-15 und 100 µL der FBS (10 % FBS V/V). Kurz schütteln Sie die Lösung und 1 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Filtern Sie die erhaltene Lösung durch 50 µm Filter in einem 1,5 mL-Tube. Beschriften Sie die Rohre entsprechend.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die gefilterte Lösung bei 200 × g für 10 min bei 25 ° c.</li>
	<li>Nehmen Sie den Überstand vorsichtig und Aufschwemmen der Pellets in 20 µL L15 ergänzt mit 10 % FBS. Manuell schütteln Sie das Rohr, bis die Tablette vollständig aufgelöst ist. Halten Sie die Zellsuspension auf Eis oder bei 4 ° c bis zur weiteren Verwendung.</li>
</ol>6. Wirtschaftlichkeit Bewertung und Zellzählung
<ol><li>Mix 5 µL Zellsuspension und 5 µL 0,4 % Trypan blau-Lösung in einem entsprechend gekennzeichneten 0,2 mL PCR-Rohr. Wenn unterschiedliche Volumina verwendet werden, stellen Sie sicher, dass das Verdünnungsverhältnis von 1:1 bleibt.</li>
	<li>Inkubieren Sie diese Aussetzung für 1 bis 3 min bei Raumtemperatur (25 ° C).</li>
	<li>Überprüfen Sie die Lebensfähigkeit jeder Probe in einem Hemocytometer unter die Lupe genommen.</li>
	<li>Die Anzahl der lebenden Zellen (unbefleckt von Trypan blau) in 15 Feldern. Berechnen Sie die Gesamtzahl der Zellen in der Zellsuspension 20 µm. Die Suspension ist jetzt für alle nachgelagerten Anwendungen bereit. Hinweis: Verwenden Sie bei der Optimierung von Verfahren für andere Arten mit größeren Körpergröße Hoden Fragmente von gleichem Gewicht. Verwenden Sie Hoden von einem Individuum für alle experimentellen Gruppen um individuelle Variabilität in den Ergebnissen zu vermeiden. Im Falle der Zebrafisch, wir nutzten die Tatsache, dass links und rechts Hoden sollte eine gleiche (oder ähnliche) Anzahl von Keimzellen13 enthalten (siehe die Vertreter-Ergebnisse). Der linke Hoden wurde als Kontrolle gehalten, während der Rechte Hoden verglast/erwärmt wurde. Lebensfähigkeit Prozentsatz wurde berechnet die Anzahl der Zellen isoliert im Vergleich zu der Anzahl der Zellen isoliert von den frischen Hoden Hoden verglast/erwärmt.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Mazur, P., Leibo, S. P., Seidel, G. R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+the+germplasm+of+animals+used+in+biological+and+medical+research:+Importance,+impact,+status,+and+future+directions.">Cryopreservation of the germplasm of animals used in biological and medical research: Importance, impact, status, and future directions.</a> Biol. Reprod. 78 (1), 2-12 (2008).</li><li>Carmichael, C., Westerfield, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+and+In+Vitro+Fertilization+at+the+Zebrafish+International+Resource+Center.">Cryopreservation and In Vitro Fertilization at the Zebrafish International Resource Center.</a> Methods Mol. Biol. 546, 45-65 (2009).</li><li>Yang, H., Carmichael, C., Varga, Z. M., Tiersch, T. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viability+of+zebrafish+(Danio+rerio)+ovarian+follicles+after+vitrification+in+a+metal+container.">Viability of zebrafish (Danio rerio) ovarian follicles after vitrification in a metal container.</a> Cryobiology. 71 (3), 367-373 (2015).</li><li>Luji&#263;, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+successful+vitrification+of+salmonid+ovarian+tissue.">First successful vitrification of salmonid ovarian tissue.</a> Cryobiology. 76, 154-157 (2017).</li><li>Bono-Mestre, C., Cardona-Costa, J., Garc&#237;a-Xim&#233;nez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+on+cell+viability+of+three+zebrafish+testicular+cell+or+tissue+cryopreservation+methods.">Effects on cell viability of three zebrafish testicular cell or tissue cryopreservation methods.</a> CryoLetters. 30 (2), 148-152 (2009).</li><li>Marinovi&#263;, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryosurvival+of+isolated+testicular+cells+and+testicular+tissue+of+tench+Tinca+tinca+and+goldfish+Carassius+auratus+following+slow-rate+freezing.">Cryosurvival of isolated testicular cells and testicular tissue of tench Tinca tinca and goldfish Carassius auratus following slow-rate freezing.</a> Gen. 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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Das Hauptziel dieser Studie war Anpassung die Nadel ultra-schnelles Kühlungs Verfahren entwickelt für Vögel und Säugetiere Arten10,11,12 , die Kryokonservierung von Fisch Hoden (Zebrafisch als Modell eingetaucht Organismus). Die meisten der bisherigen Studien zur Kryokonservierung von Zebrafisch genetischer Ressourcen konzentrierten sich in erster Linie auf Kryokonservierung von Zebrafisch Sperma2,3,4. Protokolle für die Kryokonservierung von reifen Eizellen und Embryonen wurden nicht entwickelt jedoch, obwohl einige neuen Studien, dass Kryokonservierung von Eizellen Frühstadium zeigen ist plausibel14,15. In dieser Studie haben wir erfolgreiche Kryokonservierung von Zebrafisch Spermatogonien bietet neue Möglichkeiten für die Lagerung von wertvollen genetischen Ressourcen, vor allem, da sie nach der Transplantation in männlichen und weiblichen Gameten5 Reifen können bewiesen. .
Nach bestem Wissen und gewissen ist dies die erste Studie Umgang mit der ultra-schnelle Kühlung von Zebrafisch-Gewebe durch die NIV-Methode. Ähnliche Studien inklusive Verglasung der Zebrafisch Hoden in 0,25 mL Kunststoff Strohhalme16 und Verglasung der Zebrafisch Eierstöcke in geschlossenen Metallbehälter14. Der Hauptvorteil der NIV im Vergleich zu den beiden genannten Behältern ist die direkte Exposition der Hoden zu flüssigem Stickstoff mit minimalen Mengen an Kryoprotektanten angefügt wird, also die Maximierung der abkühlenden Rate10. Die Zunahme der Abkühlgeschwindigkeit verringert die benötigte Konzentration der Kryoprotektanten, wodurch sich ihre Toxizität. Darüber hinaus können alle Gewebe Stücke Kryoprotektanten und flüssigem Stickstoff synchron ausgesetzt werden. Direkten Kontakt mit flüssigem Stickstoff haben jedoch einen Nachteil im Hinblick auf Cross-Kontamination. Es ist möglich, dass Bakterien oder Viren in flüssigem Stickstoff vorhanden sind und, dass direkte Gewebe Exposition kann zu Verunreinigungen führen. Wir empfehlen daher, zu unterlassen, Wiederverwendung von flüssigem Stickstoff, bei der Durchführung von NIV und den verwendeten flüssigen Stickstoff nach dem Abkühlen zu verwerfen. Metall-Container bieten Vorteile in diesem Zusammenhang vorgeschlagen14, jedoch waren sie benutzerdefinierte gemacht und sind nicht leicht zugänglich für alle Laboratorien.
Beim Vergleich von Ultra-schnelle Abkühlung zu verlangsamen-Rate Einfrieren ist ein entscheidender Vorteil der ultra-schnelle Abkühlung das Fehlen von Spermien nach der Verdauung. Langsam-Rate einfrierende Methoden bewiesen in einige Weißfische Fischarten, dass ähnliche Protokolle vergleichbar Lebensfähigkeit der Frühphasen-Keimzellen und Spermien17 was zu hohen Spermien Zahlen nach der Verdauung von der kryokonservierten Ausbeute Gewebe. Unsere Ergebnisse im Zebrafisch (Untersuchung), Karpfen und Goldfische (unveröffentlichte Ergebnisse) zufolge gibt es sehr wenige Spermien nach der Verdauung der erwärmten Gewebe und, dass sie nicht diese Prozedur überleben und verdaut die flussabwärts vereinfacht Anwendungen, da keine zusätzliche Bereicherung Verfahren benötigt werden.
Es gibt mehrere wichtige Schritte innerhalb dieses Protokolls. Die erste ist um jegliche Kontamination bei der Isolierung verhindern, da es zu einem Rückgang der Anzahl der Zellen gewonnen führen und alle nachgelagerten Anwendungen behindern kann. Einer der entscheidenden Schritte ist Exzision der Hoden wo bakterielle Kontamination Auftreten von Eingeweide beschädigt (daher ist es am besten nicht zu verletzen oder den Darm vollständig zu entfernen) oder von der Haut, wenn die gleichen Dissektion Werkzeug zum Schneiden der Haut und entfernen die Hoden. Zweitens, Vorsicht beim Hoden, die Akupunkturnadel fixieren, da es möglich ist, dass die Hoden fallen oder rutschen. Derzeit testen wir verschiedene Methoden, um verhindern, dass die Hoden gleiten während des Verfahrens der Verglasung (flüssiger Stickstoff Temperaturen). Drittens: Achten Sie auf die Dauer der Exposition gegenüber den Kryoprotektanten. Exposition der Hoden (und damit Zellen) zu hohen Kryoprotektivum (vor allem in der Verglasung-Lösung) für kann zu lange zum Zelltod durch Kryoprotektivum Toxizität führen. Auch kümmern Sie, wenn die Nadeln in flüssigem Stickstoff zu stürzen; Wischen Sie den Überschuss an VS da kann es des Kühlprozesses beeinflussen und die Nadeln schnell zu stürzen, um Kontakt mit flüssigem Stickstoff Dampf zu vermeiden. Zu guter Letzt übertragen Sie die Hoden von flüssigem Stickstoff in die wärmenden Medien schnell zur Vermeidung vorzeitiger Erwärmung in der Luft während der Übertragung.
In der vorliegenden Arbeit präsentieren wir das Verfahren der Kryokonservierung von Hoden aus fünf Zebrafisch-Stämme mit MeOH, PG und mir2SO als Kryoprotektanten durchdringt. Die Methode liefert zuverlässige Ergebnisse für alle getesteten Zebrafisch-Stämme mit einer Zellenentwicklungsfähigkeit von über 50 %. Es ist möglich, diese Methode mit Modifikationen für andere Arten sowie zu verwenden. Erstens, jedes Kryokonservierung Protokoll ist bestimmte Arten und verschiedene Kryoprotektanten ergeben unterschiedliche Wirkungsgrade bei verschiedenen Tierarten (z.B. Ethylenglykol ergab die höchste Rentabilität in Acipenserids18 während mir2SO ergab die höchste Rentabilität Salmoniden19 und Cypriniden17). Des weiteren sollten die Konzentrationen verwendet sowie Aufmerksamkeit gewidmet werden. Die vorliegende Studie und die Studie auf Bachforellen Salmo Trutta Eierstöcke15 zeigen, dass die besten Ergebnisse erzielt werden mithilfe der gleichen Konzentration von zwei Kryoprotektanten, aber dies in anderen Arten variieren. Zu guter Letzt Zebrafisch Hoden sind sehr klein, und es ist sogar möglich, mehrere Hoden auf eine Nadel pin. Beim Arbeiten mit Arten mit größeren Hoden ist die Größe der Hoden Stücke, die verwendet werden, ein sehr wichtiger Faktor. Wir empfehlen, die um Belichtungszeiten für größere Gewebe Stücke unter Konto Kryoprotektivum Toxizität und Effizienz zu erhöhen.

Neue Trends in Wissenschaft und Biotechnologie führten zur Schaffung von Tausenden von mutierten Neuanlagen von Mäusen, Drosophila, Zebrafisch und andere Arten als Modellorganismen im Biomedizin und anderen Wissenschaften1verwendet. Darüber, wie neue Technologien entwickelt und zur Verfügung stehen, die Nummern der mutierten Linien ständig steigen2. Dies führt zu der Notwendigkeit für eine sichere Lagerung der genetischen Ressourcen über die gemeinsame Praktiken Brutkolonien zu halten. Als eine Methode, die sichere Lagerung von genetischen Ressourcen für eine unbestimmte Zeit ermöglicht, Kryokonservierung bietet viele Vorteile, wie Erweiterung der Paarungszeit, umgeht die Notwendigkeit für die kontinuierliche Wartung der Brutbeständen, und es mehr Kosten ist - und Arbeit-effiziente2.
Protokolle für die Kryokonservierung von Spermien entwickelte sich während der letzten mehrere Jahre2,3,4 bieten die Möglichkeit für erfolgreiche Speicherung von Zebrafisch männliche Erbgut. Kryokonservierung von Eizellen oder Embryonen in den Fischen ist jedoch noch nicht möglich aufgrund ihrer komplexen Struktur und große Mengen von Eigelb Material. Vor kurzem, die Praxis der Transplantation von primordialen Keimzellen (PGCs) oder spermatogonial Stammzellen (SSCs) bietet einen Bypass um diese Barriere durch die Entwicklung in funktionale Spermien und Eizellen nach Transplantation5. Kryokonservierung von SSCs bietet daher eine neue Grenze in der Erhaltung der seltenen und wertvollen genetischen Ressourcen.
Obwohl Kryokonservierung viele Vorteile bietet, erzeugt die langsame Geschwindigkeit Gefrierprozess mehrere Bedingungen, die zu Zelle Schaden2führen können. Dazu gehören intrazelluläre und extrazelluläre Eisbildung, Dehydrierung und Kryoprotektivum Toxizität. Intrazelluläre Eis schädigt die Zellen, extrazelluläre Eis führen zu mechanischen Zerkleinerung von Zellen, während die Diffusion von Wasser aus den Zellen während langsamen Rate Einfrieren zu Dehydrierung6führen kann. Vor kurzem wurde Verglasung als eine Technik, die verhindert, die negativen Auswirkungen der Eisbildung dass in der Konservierung von Fisch Gameten7,8,9angewendet. Es stellt einen ultra-schnellen Kühltechnik, durch die die internen und externen Medien in eine amorphe/Glaszustand verwandeln, ohne kristallisieren in Eis7,10. Erfolgreiche Verglasung der Hoden und Eierstöcke Gewebe hat Vogelgrippe und Säugetier Arten10,11,12, in Fisch, sowie Möglichkeiten für seine Anwendung womit belegt.
In dieser Studie stellen wir die Nadel eingetaucht Verglasung (NIV) Verfahren für die Kryokonservierung der gesamten Zebrafisch Hoden. Wir zeigen eine zuverlässige Methode für die Isolierung von Zebrafisch Frühphasen-Keimzellen ohne Verunreinigungen und eine Kryokonservierung Prozess, der relativ hohe Mengen an Frühphasen-Keimzellen mit einer geringen Präsenz von anderen Zellen, vor allem Spermien ergibt. Nach bestem Wissen und gewissen ist dies die erste Studie, die ein detailliertes visualisiertes Protokoll für ultra-schnelle Kühlung von Fisch Gonaden Gewebe und Zebrafisch Keimbahnzellen zu demonstrieren. Reproduzierbarkeit der Methode zeigt sich darüber hinaus in fünf verschiedenen Zebrafisch-Stämme: AB Wildtyp, Casper (Roy- / -; Perlmutt- / -), Leopard (Leot1/t1), Wasa [Tg (vas::eGFP)] und Wilms Tumor [Tg (wt1b::eGFP 1)] transgene Linie.

<table><tbody><tr><td>Leibovitz media (L-15)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1518</td><td>Supplemented with L-glutamine</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine methanesulfonate (MS-222)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Acros Organics</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>Trehalose</td><td>Acros Organics</td><td>99-20-7</td><td>Dihydrate</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Reanal</td><td>20740-0-08-65</td><td></td></tr><tr><td>Propylene glycol</td><td>Reanal</td><td>08860-1-08-65</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Reanal</td><td>00190-1-01-65</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Gibco</td><td>9001-12-1</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8003</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Panreac AppliChem</td><td>A3778</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6146</td><td></td></tr><tr><td>Phospate buffered saline (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td>Tablets for preparation of 200 ml PBS solution</td></tr></tbody></table>

cryopreservation of zebrafish spermatogonia by whole testes needle immersed ultra-rapid cooling

Aktuelle Trends in Wissenschaft und Biotechnologie führen zur Schaffung von Tausenden von Neubaustrecken in Modellorganismen, wodurch die Notwendigkeit für neue Methoden zur sicheren Aufbewahrung von genetischen Ressourcen über die gemeinsame Praktiken Brutkolonien zu halten. Das Hauptziel dieser Studie war die Nadel anpassen Verglasung (NIV) Verfahren um ganze Zebrafisch Hoden Ovarialgewebe eingetaucht. Kryokonservierung von Frühphasen-Keimzellen von ganzen Hoden NIV bietet Möglichkeiten für die Lagerung von Zebrafisch genetische Ressourcen, vor allem, da sie nach der Transplantation zu männlichen und weiblichen Gameten heranreifen können. Hoden wurden herausgeschnitten, fixiert auf einer Akupunktur-Nadel, in zwei Cryoprotective Medien (Gleichgewichtherstellung Lösung mit 1,5 M Methanol und Propylen-Glykol 1,5 M; und Verglasung Lösung mit 3 M Dimethyl Sulfoxid und 3 M Propylenglykol) equilibriert, und stürzte sich in flüssigem Stickstoff. Proben wurden in einer Reihe von drei konsequente Erwärmung Lösungen erwärmt. Die wichtigsten Vorteile dieser Technik sind (1) das Fehlen von Spermien nach der Verdauung der erwärmte Hoden und erleichtert so die nachgelagerte Manipulationen; (2) Ultra-schnelle Kühlung ermöglicht die optimale Belichtung der Gewebe zu flüssigem Stickstoff, also die Maximierung der Kühlung und reduziert die benötigte Konzentration der Kryoprotektanten, wodurch sich ihre Toxizität; (3) synchron Exposition von mehreren Hoden Kryoprotektanten und flüssigem Stickstoff; und (4) Wiederholbarkeit durch den Erhalt der Lebensfähigkeit von über 50 % in fünf verschiedenen Zebrafisch-Stämme nachgewiesen.

Im Durchschnitt der Zahl der Frühphasen-Keimzellen isoliert von einem einzigen frischen Zebrafisch Hoden variiert zwischen 40.000 und 200.000 Zellen abhängig von der Größe des Fisches. Als frische Zebrafisch Hoden in allen 5 Stämme zu verdauen, waren frühen Keimzellen nicht die einzigen Zellen in der Zellsuspensionen (Abbildung 2). Neben dem Frühstadium Keimzellen fanden sich zahlreiche Spermien sowie. Auf der anderen Seite gab es weit weniger Spermien nach der Verdauung von kryokonservierten Hoden. Darauf hingewiesen, dass Spermien dieses ultra-schnelle kühle Protokoll nicht überleben, und, dass sie am ehesten während der Verdauung, was eine viel sauberere Aussetzung der Frühphasen-Keimzellen ergibt beseitigt.
Es gab keine signifikanten Unterschiede in der Anzahl der Frühphasen-Keimzellen zwischen linken und rechten Hoden (1 ± 0,5 × 105 Vs 1.1 ± 0,7 × 105) eines einzelnen nachgewiesen durch frische Hoden von drei AB Zebrafisch Männchen (One-Way ANOVA zu verdauen ; F (1,4) = 0,04, p = 0,85). In allen Zebrafisch-Linien in dieser Studie verwendeten ergab die aktuelle Ultra-schnelle kühle Protokoll durchschnittliche Rentabilität Preise höher als 50 % (Tabelle 1).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>AB Wildtyp</td>
			<td>Casper</td>
			<td>Leopard</td>
			<td>Vasa transgenen</td>
			<td>Wilms-Tumor transgenen</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Anzahl von lebenden Zellen (10 ×4)</td>
			<td>Frische Hoden</td>
			<td>14.5 ± 3,9</td>
			<td>9,5 ± 2,3</td>
			<td>12,7 ± 2.4</td>
			<td>14.5 ± 5,6</td>
			<td>4,8 ± 1,8</td>
		</tr>
<tr>
<td>Verglaste Hoden</td>
			<td>8.7 ± 2,8</td>
			<td>7.2 ± 3.0</td>
			<td>8.8 ± 1,7</td>
			<td>7.6 ± 3,7</td>
			<td>2.4 ± 0,7</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tragfähigkeit (%)</td>
			<td></td>
			<td>58 ± 9</td>
			<td>72 ± 13</td>
			<td>69 ± 1</td>
			<td>50 ± 6</td>
			<td>53 ± 13</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1. Anzahl der lebenden Zellen und Lebensfähigkeit Prozentsätze (Mittelwert ± SD) frisch oder verglaste/erwärmt Zebrafisch Hoden entnommen. Ergebnisse werden für die fünf getesteten Zebrafisch-Linien: AB Wildtyp, Casper (Roy- / -; Perlmutt- / -), Leopard (Leot1/t1), Wasa [Tg (vas::eGFP)] und Wilms Tumor [Tg (wt1b::eGFP 1)] transgene Linie.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56118/56118fig1.jpg"> Abbildung 1. Seziert Erwachsenen Zebrafisch zeigt die Position der verschiedenen anatomischen Strukturen. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56118/56118fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56118/56118fig2.jpg"> Abbildung 2. Zellen sperren, zubereitet aus frischen und verglaste/erwärmt Zebrafisch Hodengewebe aus fünf getesteten Zebrafisch-Linien (AB Wildtyp, Casper (Roy- / -; Perlmutt- / -), Leopard (Leot1/t1), Wasa [Tg (vas::eGFP)] und Wilms Tumor [Tg (wt1b::eGFP 1)] transgene Linie) mit Phasenkontrast-Mikroskopie abgebildet. Maßstabsleiste: 40 µm. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56118/56118fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Cryopreservation of Zebrafish Spermatogonia by Whole Testes Needle Immersed Ultra-Rapid Cooling

Kryokonservierung von Zebrafisch-Spermatogonien durch ganze Hoden Nadel eingetaucht, ultra-schnelle Abkühlung

Das Hauptziel dieser Studie war die Nadel anpassen Verglasung (NIV) Verfahren um ganze Zebrafisch Hoden Ovarialgewebe eingetaucht. Darüber hinaus wurde die Reproduzierbarkeit der Methode in fünf verschiedenen Zebrafisch-Sorten getestet.

Current trends in science and biotechnology lead to creation of thousands of new lines in model organisms thereby leading to the necessity for new methods ...

cryopreservation-zebrafish-spermatogonia-whole-testes-needle-immersed

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

8.3K Aufrufe.  Szent István University. Das Hauptziel dieser Studie war die Nadel anpassen Verglasung (NIV) Verfahren um ganze Zebrafisch Hoden Ovarialgewebe eingetaucht. Darüber hinaus wurde die Reproduzierbarkeit der Methode in fünf verschiedenen Zebrafisch-Sorten getestet.

Serie: Cryopreservation of Zebrafish Spermatogonia by Whole Testes Needle Immersed Ultra-Rapid Cooling

Ploidy Manipulation of Zebrafish Embryos with Heat Shock 2 Treatment

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, specifically the generation of homozygous gynogenetic diploids is useful in genetic analysis because it allows the direct production of homozygotes from a single heterozygous mother. This article describes a modified protocol for ploidy duplication based on a heat pulse during the first cell cycle, Heat Shock 2 (HS2). Through inhibition of centriole duplication, this method results in a precise cell division stall during the second cell cycle. The precise one-cycle division stall, coupled to unaffected DNA duplication, results in whole genome duplication. Protocols associated with this method include egg and sperm collection, UV treatment of sperm, in vitro fertilization and heat pulse to cause a one-cell cycle division delay and ploidy duplication. A modified version of this protocol could be applied to induce ploidy changes in other animal species.

A modified protocol for ploidy manipulation uses a heat shock to induce a one-cycle stall in cytokinesis in the early embryo. This protocol is demonstrated in the zebrafish but may be applicable to other species.

Ploidy Manipulation von Zebrafischembryonen mit Heat Shock 2 Behandlung

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding the chromosome events that take place during meiotic prophase, including the pairing, synapsis, and recombination events that ensure proper chromosome segregation. While the mouse has been an important model for understanding the molecular mechanisms underlying these processes, not all meiotic events in this system are analogous to human meiosis. We recently demonstrated the exciting potential of the zebrafish as a model of human spermatogenesis. Here we describe, in detail, our methods to visualize meiotic chromosomes and associated proteins in chromosome spread preparations. These preparations have the advantage of allowing high resolution analysis of chromosome structures. First, we describe the procedure for dissecting testes from adult zebrafish, followed by cell dissociation, lysis, and spreading of the chromosomes. Next, we describe the procedure for detecting the localization of meiotic chromosome proteins, by immunofluorescence detection, and nucleic acid sequences, by fluorescence in situ hybridization (FISH). These techniques comprise a useful set of tools for the cytological analysis of meiotic chromatin architecture in the zebrafish system. Researchers in the zebrafish community should be able to quickly master these techniques and incorporate them into their standard analyses of reproductive function.

Nuclear surface spreads are an indispensable tool for studying chromosome events during meiosis. Here we demonstrate a method to prepare and visualize meiotic chromosomes during prophase I from zebrafish spermatocytes.

Zubereitung von meiotischen Chromosomenaufstrichen aus Zebrafisch Spermatozyten

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding ...

Genetik

Screening Sperm for the Rapid Isolation of Germline Edits in Zebrafish

The advent of targeted CRISPR-Cas nuclease technologies has revolutionized the ability to perform precise genome editing in both established and emerging model systems. CRISPR-Cas genome editing systems use a synthetic guide RNA (sgRNA) to target a CRISPR-associated (Cas) endonuclease to specific genomic DNA loci, where the Cas endonuclease generates a double-strand break. The repair of double-strand breaks by intrinsic error-prone mechanisms leads to insertions and/or deletions, disrupting the locus. Alternatively, the inclusion of double-stranded DNA donors or single-stranded DNA oligonucleotides in this process can elicit the inclusion of precise genome edits ranging from single nucleotide polymorphisms to small immunological tags or even large fluorescent protein constructs. However, a major bottleneck in this procedure can be finding and isolating the desired edit in the germline. This protocol outlines a robust method for screening and isolating germline mutations at specific loci in Danio rerio (zebrafish); however, these principles may be adaptable in any model where in vivo sperm collection is possible.

CRISPR-Cas technologies have revolutionized the field of genome editing. However, finding and isolating the desired germline edit remains a major bottleneck. Therefore, this protocol describes a robust method for quickly screening F0 CRISPR-injected zebrafish sperm for germline edits using standard PCR, restriction digest, and gel electrophoresis techniques.

Screening von Spermien zur schnellen Isolierung von Keimbahnveränderungen im Zebrafisch

The advent of targeted CRISPR-Cas nuclease technologies has revolutionized the ability to perform precise genome editing in both established and emerging ...

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to the original protocol that both streamline the procedure and increase sample uniformity.  First, we normalize all sperm volumes using freezing media that does not contain the cryoprotectant. Second, cryopreserved sperm are stored in cryovials instead of capillary tubes.  The rates of sperm freezing and thawing (&delta;&deg;C/time) are probably the two most critical variables to control in this procedure.  For this reason, do not substitute different tubes for those specified.  Working in teams of 2 it is possible to freeze the sperm of 100 males per team in ~2 hrs.  Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility (measured as the number of viable embryos generated in an in vitro fertilization divided by the total number of eggs fertilized) and this percent fertility is stable over many years.

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a high-throughput sperm cryopreservation protocol for zebrafish. Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility in subsequent vitro fertilization and is stable over many years.

Ein High-Throughput-Methode für Zebrabärblinge Sperma Kryokonservierung und In Vitro Fertilisation

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

Biologie

Making Gynogenetic Diploid Zebrafish by Early Pressure

Heterozygosity in diploid eukaryotes often makes genetic studies cumbersome. Methods that produce viable homozygous diploid offspring directly from heterozygous females allow F1 mutagenized females to be screened directly for deleterious mutations in an accelerated forward genetic screen. Streisinger et al.1,2 described methods for making gynogenetic (homozygous) diploid zebrafish by activating zebrafish eggs with ultraviolet light-inactivated sperm and preventing either the second meiotic or the first zygotic cell division using physical treatments (heat or pressure) that deploymerize microtubules. The "early pressure" (EP) method blocks the meiosis II, which occurs shortly after fertilization. The EP method produces a high percentage of viable embryos that can develop to fertile adults of either sex. The method generates embryos that are homozygous at all loci except those that were separated from their centromere by recombination during meiosis I. Homozygous mutations are detected in EP clutches at between 50% for centromeric loci and less than 1% for telomeric loci. This method is reproduced verbatim from the Zebrafish Book3.

This is a method for generating gynogenetic diploid zebrafish embryos (embryos whose only genetic contribution comes from the mother) by blocking the second meiotic division immediately after fertilization with ultraviolet light-inactivated sperm. EP embryos are not fully homozygous due to recombination during the first meiotic division, however they are homozygous at all loci that have not been separated from their centromere by recombination.

Machen Gynogenetic Diploid Zebrafisch von Anfang Druck

Heterozygosity in diploid eukaryotes often makes genetic studies cumbersome. Methods that produce viable homozygous diploid offspring directly from ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. Although many immunohistochemistry protocols have been optimized for mammalian tissue and tissue sections, these protocols often require modification and optimization for non-mammalian model organisms. Zebrafish are increasingly used as a model system in basic, biomedical, and translational research to investigate the molecular, genetic, and cell biological mechanisms of developmental processes. Zebrafish offer many advantages as a model system but also require modified techniques for optimal protein detection. Here, we provide our protocol for whole-mount fluorescence immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. This protocol additionally describes several different mounting strategies that can be employed and an overview of the advantages and disadvantages each strategy provides. We also describe modifications to this protocol to allow detection of chromogenic substrates in whole mount tissue and fluorescence detection in sectioned larval tissue. This protocol is broadly applicable to the study of many developmental stages and embryonic structures.

Here, we present a protocol for fluorescent antibody-mediated detection of proteins in whole preparations of zebrafish embryos and larvae.

Ganzer Berg Immunhistochemie in Zebrafisch Embryonen und Larven

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for forward genetic analysis of developmental processes due to their external fertilization, embryonic size, rapid ontogeny, and optical clarity &#8211; a constellation of traits that enable the direct observation of events ranging from gastrulation to organogenesis with a basic stereomicroscope. Further, zebrafish embryos can survive for several days in the haploid state. The production of haploid embryos in vitro is a powerful tool for mutational analysis, as it enables the identification of recessive mutant alleles present in first generation (F1) female carriers following mutagenesis in the parental (P) generation. This approach eliminates the necessity to raise multiple generations (F2, F3, etc.) which involves breeding of mutant families, thus saving the researcher time along with reducing the needs for zebrafish colony space, labor, and the husbandry costs. Although zebrafish have been used to conduct forward screens for the past several decades, there has been a steady expansion of transgenic and genome editing tools. These tools now offer a plethora of ways to create nuanced assays for next generation screens that can be used to further dissect the gene regulatory networks that drive vertebrate ontogeny. Here, we describe how to prepare haploid zebrafish embryos. This protocol can be implemented for novel future haploid screens, such as in enhancer and suppressor screens, to address the mechanisms of development for a broad number of processes and tissues that form during early embryonic stages.

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish is a powerful model system for developmental biology and human disease research due to their genetic similarity with higher vertebrates. This protocol describes a methodology to create haploid zebrafish embryos that can be utilized for forward screen strategies to identify recessive mutations in genes essential for early embryogenesis.

Die Produktion von Haploid Zebrafischembryonen durch<em&gt; In-vitro-</em&gt; Düngung

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and purification of RNA, DNA, and proteins. All of these applications demand the rapid recovery of significant numbers of zebrafish hearts to avoid gene regulatory, metabolic, and other changes that begin after death. Adult zebrafish hearts are also required for studying heart structure for a variety of mutants and for studying heart regeneration. However, the traditional zebrafish heart dissection is slow and difficult and requires specialized tools, making large-scale dissection of adult zebrafish hearts tedious. Traditional methods also harbor the risk of damaging the heart during the dissection. Here, we describe a method for dissection of adult zebrafish hearts that is fast, reproducible, and preserves heart architecture. Furthermore, this method does not require specialized tools, is painless for the zebrafish, can be performed on fresh or fixed specimens, and can be performed on zebrafish as young as one month old. The approach described expands the use of adult zebrafish for cardiovascular research.

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

Rückgewinnung von Adult Zebrafisch-Herzen für Hochdurchsatz-Anwendungen

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

Repeated Blood Collection for Blood Tests in Adult Zebrafish

Repeated blood collection is one of the most common techniques performed on laboratory animals. However, a non-lethal protocol for blood collection from zebrafish has not been established. The previous methods for blood collection from zebrafish are lethal, such as lateral incision, decapitation and tail ablation. Thus we have developed a novel &#8220;repeated&#8221; blood collection method, and present here a detailed protocol outlining this procedure. This method is minimally invasive and results in a very low mortality rate (2.3%) for zebrafish, thus enabling repeated blood sampling from the same individual. The maximum volume of blood sampling is dependent on body weight of the fish. The volume for repeated blood sampling at intervals should be&#160;&#8804;0.4% of body weight every week or &#8804;1% every 2 weeks, which were evaluated by measurements of blood hemoglobin. Additionally, hemoglobin, fasting blood glucose, plasma triacylglycerol (TG) and total cholesterol levels in male and female adult zebrafish were measured. We also applied this method to investigate the dysregulation of glucose metabolism in diet-induced obesity. This blood collection method will allow many applications, including glucose and lipid metabolism and hematological studies, which will increase the use of zebrafish as a human disease model organism.

Repeated blood sampling is necessary and important in animal research. We developed a novel, non-lethal and reliable method for repeated blood collection from adult zebrafish, and applied this method to the study of blood biochemistry, including glucose metabolism.

Wiederholte Blutentnahme für Bluttests in Adult Zebrafisch

Repeated blood collection is one of the most common techniques performed on laboratory animals. However, a non-lethal protocol for blood collection from ...

Sequential Immunofluorescence and Immunohistochemistry on Cryosectioned Zebrafish Embryos

Investigation of intercellular interactions often requires discrete labeling of specific cell populations and precise protein localization. The zebrafish embryo is an excellent tool for examining such interactions with an in vivo model. Whole-mount immunohistochemical and immunofluorescence assays are frequently applied in zebrafish embryos to assess protein expression. However, it can be difficult to achieve accurate mapping of co-localized proteins in three-dimensional space. In addition, some studies may require the use of two antibodies that are not compatible with the same technique (e.g., antibody 1 is only suitable for immunohistochemistry and antibody 2 is only suitable for immunofluorescence). The purpose of the method described herein is to perform sequential immunofluorescence and/or immunohistochemistry on individual cryosections derived from early-stage zebrafish embryos. Here we describe the use of sequential rounds of immunofluorescence, imaging, immunohistochemistry, imaging for a single cryosection in order to achieve precise identification of protein expression at the single-cell level. This methodology is suitable for any study in early-stage zebrafish embryos that requires accurate identification of multiple protein targets in individual cells.

This protocol demonstrates sequential immunofluorescence and immunohistochemistry on cryosections from early-stage zebrafish embryos enabling precise colocalization analyses in specific cell populations.

Sequenzielle Immunfluoreszenz und Immunhistochemie an kryosektionierten Zebrafisch-Embryonen

Investigation of intercellular interactions often requires discrete labeling of specific cell populations and precise protein localization. The zebrafish ...