المؤلفون تقر دعما ماليا من منحة ZonMW-فيشي 918.11.635 (هولندا). فإن الكتاب أود أن أشكر متجر أداة من جامعة فريجي في أمستردام لاقتراحات عملية ولتصنيع مكونات برنامج الإعداد ويارنو Voortman من كارل زايس هولندا للحصول على المشورة المفيدة حول المجهري. كان ماريولين Blaauboer دعما كبيرا في تعليقه حاسم على عدة مسودات للمخطوطة.

وقد جرت كافة الإجراءات التجريبية وفقا للتجارب هولندا على قانون الحيوانات. ملاحظة: يتم تعديل فلتر طريقة رقة شطيرة المغمورة من 1. 1. المغمورة تصفية إعداد ساندويتش ورقة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pannett كومبتون (PC) -saline 27،28 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحلول الأسهم ألف (1 لتر من عالى النقاء H 2 O، و 121 غرام من كلوريد الصوديوم، و 15.5 غرام من بوكل، 10.42 غرام من CaCl 2 · H 2 O، و 12.7 غرام من MgCl 2 · 6H 2 O) و (ب) (1 لتر من عالى النقاء H 2 O، 2.365 غرام من نا 2 هبو 4 · 2H 2 O، و0.188 غرام من ناه 2 ص 4 · 2H 2 O) في عبوات 1-L نظيفة. تخزينها في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 1 لتر من PC-المالحة عن طريق خلط 900 مل من عالى النقاء H 2 O مع 40 مل من محلول المخزون A و 60 مل من محلول المخزون ب (في هذا النظام لتجنب الأمطار). إعداد-PC المالحة الاب طازجةام الحلول الأسهم A و B كل أسبوع. ويمكن تخزين الحلول المالية عند 4 درجة مئوية لعدة أشهر: ملاحظة. التعقيم و / أو إضافة المضادات الحيوية أو antimycotics ليست ضرورية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حضانة بيض الدجاج الملقحة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حاضنة ترطيب، تضع البيض على جانبهم واحتضان لهم في 37.5 درجة مئوية حتى بلوغهم سن المرجوة. ملاحظة: مخزن البيض لم يعد من اسبوعين (ويفضل في 12-15 درجة مئوية) قبل التجربة، كما أن نسبة الفقس سوف تنخفض بشكل كبير </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ناقلات ورقة الترشيح (مقتبس من 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان متوفرا، استخدام آلة القطع بالليزر لقطع حاملات ورق الترشيح على شكل الساعة الرملية من ورقة الترشيح سميكة (28 ملم × 22 ملم). تفتق عرض في منتصف الفترة من 22 ملم إلى 10.4 ملم. قطع فتحة بيضاوية المركزية (10.6 مم × 5.5 مم)، مع محور أطول من القطع الناقص الموجه بالتوازي مع الجانب الأكبر من الناقل ورق الترشيح (الشكل 1-M). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختياريا، وإعداد الاستنسل من الورق المقوى مع الأبعاد الصحيحة ونقل المخطط لها والتي من الفتحة المركزية على ورقة الترشيح سميكة باستخدام قلم رصاص. قطع الناقل ورق الترشيح باستخدام مقص غرامة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع حاملتي ورق الترشيح متطابقة عن كل جنين إلى أن explanted. إعداد إضافية حاملات ورق الترشيح كما احتياطية في حالة يضيع جنين خلال explanting. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التحكم في درجة حرارته حمام الزيت (في يوم التجربة) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الكأس التي تسيطر عليها درجة الحرارة في وسط بمحركات XY-مرحلة من مراحل المجهر التكبير تستقيم وربط الكأس للتحكم في درجة الحرارة فيها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أربع حلقات كبيرة الفولاذ المقاوم للصدأ (القطر الخارجي 30 ملم، 4 ملم في الطول و 1.5 ملم سمك الجدار) إلى 6 سم طبق بتري ليكون بمثابة الأوزان ووضع الطبق في منتصف الكأس التحكم في درجة حرارته. ملاحظة: هذا الطبق بيتري يخدم فقط كعنصر نائب لضبط LEVE النفطل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء كوب التحكم في درجة حرارته مع 130 مل من الزيوت المعدنية الخفيفة. ضبط مستوى الزيت إذا لزم الأمر بحيث ينتهي حوالي 3 مم أسفل الحافة العلوية للطبق بيتري 6 سم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة 6 سم طبق بيتري من الكأس التي تسيطر عليها درجة الحرارة وضبط درجة الحرارة إلى 40 درجة مئوية. </li></ol></li></ol> 2. المغمورة تصفية الإنتاج ساندويتش ورقة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مستنبت (في يوم التجربة) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب 30 مل من PC-المالحة (كما أعد الخطوات 1.1.1 إلى 1.1.2) في أنبوب الطرد المركزي 50 مل. إعداد أنبوب واحد 50 مل الطرد المركزي مليئة 30 مل من PC-المالحة لكل اثنين من الأجنة إلى أن explanted. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعناية الكراك البيض غير المحتضنة في 10 سم طبق بتري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد زلال رقيقة عن طريق تحريك نقل ماصة بلاستيكية على طول الجدران من طبق بيتري ومص في زلال رقيقة. جمع 30 مل زلال رقيقة في أنبوب الطرد المركزي 50 مل لكل اثنين من الأجنة إلى أن explanted. تأكد من الحصول سوى رهين زلال. ملاحظة: عادة 3-4 البيض تسمح حصاد حوالي 30 مل من زلال رقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب 20 مل من زلال رقيقة في كل جهاز كمبيوتر المالحة شغل 50 مل أنبوب الطرد المركزي (كما أعدت في الخطوة 2.1.1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلط PC-المالحة مع زلال رقيقة من قلب بلطف الأنابيب عدة مرات. السماح لها تسوية لعدة دقائق، ومعرفة ما اذا كان الخليط، ودعا مستنبت من هنا فصاعدا، هو واضح. إذا مستنبت ليست واضحة، وإعداد الطازجة PC-المالحة من المحلول وحصاد زلال رقيقة جديدة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع حلقتين صغيرة الفولاذ المقاوم للصدأ (القطر الخارجي 20 ملم، 4 ملم في الطول و 1.5 ملم سمك الجدار، 6.5 الفجوة ملم في الحلبة) متباعدة مثل ممكن في العذبة 6 سم من البلاستيك طبق بتري وملء مع 22 مل من ثقافة متوسطة (كما أعد الخطوات 1.4.1 إلى 1.4.4) باستخدام ماصة بلاستيكية 25 مل (الشكل 1-H). تأكد من أن الحطام المتراكم على أعلى من المتوسط ​​يبقى في أنبوب الطرد المركزي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة أي س الحطامص فقاعات من المتوسطة باستخدام ماصة نقل البلاستيكية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء 10 سم طبق بتري مع 75 مل من PC-المالحة (لاستخدامها في الخطوة 2.15). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة البيض من الحاضنة والسماح لها بقية على مقاعد البدلاء على جانبها لمدة 1 دقيقة للسماح للجنين يأتي إلى الجزء العلوي من صفار البيض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعناية كسر البيض في طبق بتري (الشكل 1-A). نقع حافة قطعة من المناديل الورقية الجميلة في زلال سميكة وتوسيط الأريمة عن طريق سحب، إذا لزم الأمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة أكثر من زلال رقيقة وسميكة من طبق بيتري باستخدام ماصة نقل البلاستيك (مع طرف قطع لتسهيل امتصاص زلال سميكة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء إطار في زلال سميكة حول الجنين عن طريق محو بلطف بعيدا زلال سميكة مع قطعة من المناديل الورقية، والابتعاد عن المركز (الشكل 1-B). منع المناديل الورقية من الالتصاق على الغشاء المحي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الملقط، وضع بعناية ورقة مرشح الناقل على VITEغشاء lline حول الجنين، مع محور أطول خط العرض فتحة بيضاوي الشكل على المحور الأمامي الخلفي للجنين (الشكل 1-C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قرصة طرف واحد من مقص الأظافر من خلال الغشاء المحي على مقربة من حاملة ورق الترشيح وقطع بسرعة حول ورقة الترشيح كله الناقل (الشكل 1-D). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الملقط، ورفع الناقل ورق الترشيح بعيدا عن صفار البيض في اتجاه مواز المائل إلى المحور الأمامي الخلفي للجنين (الشكل 1-E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل الورق الناقل مرشح في جميع أنحاء لديك الجانب البطني للجنين على رأس ويغرق في PC-المالحة. تزج الناقل ورق الترشيح على طول المحور الأمامي الخلفي للجنين في اتجاه منحرف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التخلص من كل صفار البيض لا تزال تعلق الغشاء المحي والأريمة عن طريق تنظيف برفق مع PC-المالحة من ماصة نقل البلاستيك. حافظ على مجمل الناقل ورق الترشيح المغمورة فيمرات ليرة لبنانية (الشكل 1-F). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الناقل ورق الترشيح من PC-المالحة على طول المحور الأمامي الخلفي للجنين في اتجاه منحرف وتخلص من السائل الزائد عن طريق اللمس حافة ورقة الناقل مرشح على ورقة الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عقد ورقة الترشيح أفقيا، مع الجانب البطني للجنين مواجهة، ووضع ورقة الناقل مرشح آخر على رأس أول واحد، وذلك باستخدام الزوج الثاني من الملقط. يجب أن يتطابق مع فتحات بهم بالضبط، وبالتالي يقحم الجنين بين طبقتين من ورق الترشيح (الشكل 1-G). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على الفور غمر شطيرة الناقل ورق الترشيح في مستنبت في اتجاه منحرف طول الأمامي الخلفي محور الجنين. وضعه في منطقة تمتد المسافة بين حلقات الفولاذ المقاوم للاثنين (الشكل 1-H). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح ورقة الترشيح شطيرة من خلال وضع اثنين من حلقات الفولاذ المقاوم للمزيد من على رأس اثنين آخرين، والتأكد من أن فتحة مع البريديبقى mbryo كشفت تماما (الشكل 1-I). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التحقق من مستوى المتوسط ​​وتأكد من أن الفاصل العلوي مغمورة فقط في المتوسط. إذا لزم الأمر، إضافة أو إزالة كميات صغيرة من المتوسط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع بعناية طبق بيتري في وسط حمام الزيت التحكم في درجة حرارته وتحقيق الاستقرار في طبق أفقيا عن طريق وضع ثلاث حلقات الفولاذ المقاوم للصدأ كبيرة (قطر 30 مم الخارجي، 4 مم في الطول و 1.5 ملم سمك الجدار) بجانب طبق في مجال النفط . تأكد من أن حلقات الصلب تلمس جوانب الطبق (الشكل 1-J). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ببطء ماصة ما يقرب من 6 مل من الزيوت المعدنية الخفيفة على رأس المتوسطة مع ماصة نقل البلاستيك، بحيث يتم تغطية متوسطة مع طبقة مستمرة من الزيوت المعدنية (الشكل 1-K). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد اكتساب الوقت الفاصل. ملاحظة: التصوير الأجنة كما صور بانورامية أفقية من خمسة تداخل الصور الفرعية (البلاط) تتيح التصوير مفصل (الهدف 5X)، مع overvi العامةمصريات من التشكل 29-30. فترات التصوير ما بين 3 و 10 دقيقة تسمح لتتبع مفصل لالصرفية يغير 31، واكتساب صغيرة ض مداخن (5-7 طائرات مختلفة مع مسافة 30 ميكرون) تعوض عن الكثير من سماكة وتحول الجنين 30 . Z-الطائرات وفقا لأعلى النقيض من ذلك يمكن تحديد مزيد من المعالجة قبل 32 من الأطر واحد في الوقت الفاصل بين الأفلام (انظر القسم ممثل النتائج للحصول على معلومات مفصلة عن الحصول على الصور). </li></ol><img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/54636/54636fig1.jpg" /> الشكل 1: إعداد المغمورة ساندويتش مرشح ورقة. مشققة (A) بيضة في طبق بيتري. (ب) يتم إزالة معظم زلال سميكة ورقيقة من طبق بيتري مع ماصة نقل البلاستيك (لا يظهر). ثم، يتم إنشاء نافذة في زلال سميكةجولة الجنين عن طريق محو بلطف بعيدا زلال سميكة مع المناديل الورقية. يتم وضع (ج) ورقة الترشيح الناقل في جميع أنحاء الأريمة على الجزء العلوي من صفار البيض. يتم قطع (D) ورقة الناقل مرشح فضفاض من المحيط الغشاء المحي و (E) إزالتها من الجزء العلوي من صفار البيض. يتم غسلها (F) وصفار البيض المتبقية بعناية بعيدا في حمام-PC المالحة. وتقع (G) الجنين مع متطابقة الناقل ورق الترشيح الثاني. غارق (H) ورقة شطيرة مرشح على المديين المتوسط وضعه على حلقات الفولاذ المقاوم للصدأ اثنين من المعادن (جنين التي تواجه الظهرية أو الجانب البطني). (I) حلقتين استقرار شطيرة من أعلى. (J) وطبق بتري تحتوي على الجنين يتم نقلها إلى حمام الزيت التحكم في درجة حرارته. حلقات الفولاذ المقاوم للصدأ استقرار طبق بيتري أفقيا. وتغطي (K) ومستنبت مع طبقة من الزيوت المعدنية.(L) تخطيطي لشطيرة مرشح المغمورة. (M) أبعاد الناقلات ورق الترشيح المستخدمة في ورقة الترشيح شطيرة المغمورة. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54636/54636fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

<ol>
	<li>Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+method+for+chick+whole-embryo+culture+using+a+filter+paper+carrier.">Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier.</a> Dev. Dyn. 220 (3), 284-289 (2001).</li><li>Rozbicki, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin-II-mediated+cell+shape+changes+and+cell+intercalation+contribute+to+primitive+streak+formation.">Myosin-II-mediated cell shape changes and cell intercalation contribute to primitive streak formation.</a> Nat. Cell Biol. 17 (4), 397-408 (2015).</li><li>Smith, J. L., Schoenwolf, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurulation:+Coming+to+closure.">Neurulation: Coming to closure.</a> Trends Neurosci. 20 (97), 510-517 (1997).</li><li>Schoenwolf, G. C., Sheard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaping+and+bending+of+the+avian+neural+plate+as+analysed+with+a+fluorescent-histochemical+marker.">Shaping and bending of the avian neural plate as analysed with a fluorescent-histochemical marker.</a> Development. 105 (1), 17-25 (1989).</li><li>Colas, J. F., Schoenwolf, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+cellular+and+molecular+understanding+of+neurulation.">Towards a cellular and molecular understanding of neurulation.</a> Dev. Dyn. 221 (2), 117-145 (2001).</li><li>Pourqui&#233;, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chick+embryo:+a+leading+model+in+somitogenesis+studies.">The chick embryo: a leading model in somitogenesis studies.</a> Mech. Dev. 121 (9), 1069-1079 (2004).</li><li>Maenner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+looping+in+the+chick+embryo:+A+morphological+review+with+special+reference+to+terminological+and+biomechanical+aspects+of+the+looping+process.">Cardiac looping in the chick embryo: A morphological review with special reference to terminological and biomechanical aspects of the looping process.</a> Anat. Rec. 259 (3), 248-262 (2000).</li><li>Wittig, J. G., M&#252;nsterberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Early+Stages+of+Heart+Development+Insights+from+Chicken+Embryos.">The Early Stages of Heart Development Insights from Chicken Embryos.</a> J. Cardiovasc. Dev. Dis. 3 (2), (2016).</li><li>Layer, P. G., Alber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+of+chick+brain+vesicles+as+revealed+by+peanut+agglutinin+and+cholinesterases.">Patterning of chick brain vesicles as revealed by peanut agglutinin and cholinesterases.</a> Development. 109 (3), 613-624 (1990).</li><li>Nakamura, H., Nakano, K. E., Igawa, H. H., Takagi, S., Fujisawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+and+rigidity+of+differentiation+of+brain+vesicles+studied+in+quail-chick+chimeras.">Plasticity and rigidity of differentiation of brain vesicles studied in quail-chick chimeras.</a> Cell Differ. 19 (3), 187-193 (1986).</li><li>Garcia-Lopez, R., Pombero, A., Martinez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+map+of+the+chick+embryo+neural+tube.">Fate map of the chick embryo neural tube.</a> Dev. Growth Differ. 51 (3), 145-165 (2009).</li><li>Andermatt, I., Stoeckli, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi-based+gene+silencing+in+chicken+brain+development.">RNAi-based gene silencing in chicken brain development.</a> Methods Mol. Biol. 1082, 253-266 (2014).</li><li>Tufan, A. C., Akdogan, I., Adiguzel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shell-less+culture+of+the+chick+embryo+as+a+model+system+in+the+study+of+developmental+neurobiology.">Shell-less culture of the chick embryo as a model system in the study of developmental neurobiology.</a> Neuroanatomy. 3 (1), 8-11 (2004).</li><li>Endo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+embryo+culture+and+electroporation.">Chick embryo culture and electroporation.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. , Unit 19.15 (2012).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> J. Morphol. 88 (1), 49-92 (1951).</li><li>Kulesa, P. M., Bailey, C. M., Cooper, C., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Ovo+Live+Imaging+of+Avian+Embryos.">In Ovo Live Imaging of Avian Embryos.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 2010 (6), (2010).</li><li>Borwompinyo, S., Brake, J., Mozdziak, P. E., Petitte, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+chicken+embryos+in+surrogate+eggshells.">Culture of chicken embryos in surrogate eggshells.</a> Poult Sci. 84 (9), 1477-1482 (2005).</li><li>Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ex-ovo+Chicken+Embryo+Culture+System+Suitable+for+Imaging+and+Microsurgery+Applications.">An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications.</a> J. Vis. Exp. (44), e2154 (2010).</li><li>Auerbach, R., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+procedure+for+the+long-term+cultivation+of+chicken+embryos.">A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos.</a> Dev. Biol. 41 (2), 391-394 (1974).</li><li>New, D. A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Technique+for+the+Cultivation+of+the+Chick+Embryo+in+vitro.">A New Technique for the Cultivation of the Chick Embryo in vitro.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 3 (4), 320-331 (1955).</li><li>Stern, C. D., Bachvarova, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+chick+embryos+in+vitro.">Early chick embryos in vitro.</a> Int. J. Dev. Biol. 41 (2), 379-387 (1997).</li><li>Nagai, H., Lin, M. C., Sheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+cornish+pasty+method+for+ex+ovo+culture+of+the+chick+embryo.">A modified cornish pasty method for ex ovo culture of the chick embryo.</a> Genesis. 49 (1), 46-52 (2011).</li><li>Connolly, D., McNaugbton, L. A., Krumlauf, R., Cooke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+in+vitro+development+of+the+chick+embryo+using+roller-tube+culture.">Improved in vitro development of the chick embryo using roller-tube culture.</a> Trends Genet. 11 (7), 259-260 (1995).</li><li>Rupp, P. A., Rongish, B. J., Czirok, A., Little, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+of+avian+embryos+for+time-lapse+imaging.">Culturing of avian embryos for time-lapse imaging.</a> Biotechniques. 34 (2), 274-278 (2003).</li><li>Martins, G. G., Rifes, P., Ama&#226;ndio, R., Rodrigues, G., Palmeirim, I., Thorsteinsd&#243;ttir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+3D+cell+rearrangements+guided+by+a+fibronectin+matrix+underlie+somitogenesis.">Dynamic 3D cell rearrangements guided by a fibronectin matrix underlie somitogenesis.</a> PLoS One. 4 (10), e7429 (2009).</li><li>Nagai, H., Sezaki, M., Nakamura, H., Sheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extending+the+limits+of+avian+embryo+culture+with+the+modified+Cornish+pasty+and+whole-embryo+transplantation+methods.">Extending the limits of avian embryo culture with the modified Cornish pasty and whole-embryo transplantation methods.</a> Methods. 66 (3), 441-446 (2014).</li><li>Pannett, C., Compton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cultivation+of+Tissues+in+Saline+Embryonic+Juice.">The Cultivation of Tissues in Saline Embryonic Juice.</a> Lancet. 203 (5243), 381-384 (1924).</li><li>Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+and+temporally+controlled+electroporation+of+early+chick+embryos.">Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos.</a> Nat. Protoc. 3 (3), 419-426 (2008).</li><li>. GmbH ZEN 2 - (blue edition) - Software Guide Available from: <a target="_blank" href="https://www.unige.ch/medecine/bioimaging/files/3914/3765/2064/ZEN_2_blue_edition_-_Software_Guide.pdf">https://www.unige.ch/medecine/bioimaging/files/3914/3765/2064/ZEN_2_blue_edition_-_Software_Guide.pdf</a> (2014)</li><li>Darnell, D. K., Schoenwolf, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+Avian+Embryos.">Culture of Avian Embryos.</a> Dev. Biol. Protoc. Vol. I. 135, 31-38 (2000).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

كما متغير جديد من الثقافة الأوروبية راسخة 1، والمغمورة ورقة مرشح شطيرة يسهل الاستيلاء على المدى الطويل brightfield والساحة المظلمة الوقت الفاصل بين الأفلام من أوائل السابقين كتكوت الجنين البيضة بجعل و للحرارة الرطوبة التي تسيطر عليها حاضنة حول المجهر الاستغناء عنها. بدلا من أن تكون تربيتها على شبه صلبة أسفل أجار زلال، يتم الاحتفاظ المغمورة الأجنة تماما في مستنبت بسيطة تتكون من PC-المالحة وزلال رقيقة. يتم الحد من التبخر وفقدان الحرارة عن طريق طبقة من الزيوت المعدنية تطفو على أعلى من المتوسط ​​الثقافة. الأجنة يمكن تربيتها بسهولة، إما الظهرية أو بطني حتى الجانب، دون اختلافات واضحة في الجودة. كما هو موضح هنا والأجنة في ورق الترشيح شطيرة المغمورة متاحة للتدخلات المجهرية، مثل تطبيق حبات غارقة محدثة التخلق. وتشمل التطبيقات المستقبلية مضان يعيش التصوير، إبر دقيقة جدا و electroporation، والجينات إسكات إلى manipulate ودراسة مجموعة واسعة من الأحداث تخلقية خلال بطني تنمية (على سبيل المثال، والقلب في وقت مبكر وتكون الجسيدات) والظهرية (على سبيل المثال، في وقت متأخر تكون المعيدة، وإغلاق الأنبوب العصبي، والدماغ المبكر). علاج المخدرات تعتمد على الوقت مجدية إذا تم استبدال طبق بتري تحتوي على ورقة الترشيح شطيرة مع غرفة التروية، والسماح للتبادل مستنبت تحت طبقة الزيوت المعدنية. سوف المغمورة ورقة فلتر شطيرة تطوير إمكاناتها التصوير الكاملة في تركيبة مع التصوير القائم على الليزر (بما في ذلك الفحص المجهري ورقة ضوء) والأهداف الغمر. وسيتم تناول بعض الصعوبات مع إعداد ورقة فلتر شطيرة غارقة في الفقرات التالية. على الرغم من أنه لا يتطلب سوى كمية معتدلة من التدريب لنقل الجنين من صفار البيض في ورقة ساندويتش التصفية، يمكن أن العديد من الخطوات لا تزال تؤثر بشكل كبير على نوعية الجنين في الثقافة. قبل الناقل ورقة المرشح هووضعت على صفار البيض، والغشاء المحي حول الجنين يجب الافراج عن أي زلال سميكة. عندها فقط سوف اتصال بين ورقة الترشيح والغشاء المحي تكون قوية بما يكفي لتحمل الغسيل في PC-المالحة. ورقة الترشيح التي تحمل الجنين يجب عبور اجهة / الهواء السائل أقل قدر ممكن للحد من التوتر على الأغشية. مرة واحدة جلبت إلى PC-المالحة للغسيل، مرشح كله رقة الناقل يجب أن تبقى مغمورة تماما في جميع الأوقات. الوقت في الحمام-PC المالحة يجب أن يقتصر على حوالي 30 - 60 ثانية، والغشاء المحي وسوف تبدأ الإفراج عن من ورقة الترشيح. ومع ذلك، فإن تنظيف الجنين يجب أن يتم تنفيذها بدقة جدا، وبقايا صفار وفي وقت لاحق تحجب ضوء الجنين. أثناء الغسل، لم توجه تيار من ماصة نقل مباشرة على الجنين، ولكن دائما شعاعيا بعيدا عن ذلك. بعد إزالة الجنين من PC-المالحة، تأكد من مسك ورقة الترشيح أفقيا للحد منالتوتر على الأغشية الجنينية. ثم، وتثبيت الجنين مع ثاني حاملة ورق الترشيح. مرة واحدة يتم وضع الثاني الناقل رقة الترشيح، وتجنب خلق أي توتر الجانبي، والتي يمكن أن تحول شركات الطيران ورق الترشيح بالنسبة لبعضها البعض وتمزق الأغشية الجنينية. عندما يتم جلب شطيرة ورق الترشيح في مستنبت، فإنه ينبغي أيضا عبر واجهة الهواء / السائل مرة واحدة فقط للحد من التوتر على الأغشية. يجب وضع الزوج الثاني من حلقات الفولاذ المقاوم للصدأ المستخدمة لتحقيق الاستقرار في شطيرة ورق الترشيح من أعلى ببطء شديد ودون أي ضغط لتقليل ضغط من الأغشية الجنينية. تمزقات صغيرة من المعتمة مجال الجنين عادة ما تلتئم خلال الساعة الأولى من الثقافة، ولكن يمكن ويجب أن يتم استبدال الجنين بأضرار دائما عينة جديدة قبل pipetted طبقة الزيت على أعلى مستنبت. لصورة الجنين بأكمله أو عينات متعددة عالية الدقة الوقت الفاصل بين الأفلام، وهيئة التصنيع العسكرييجب أن تكون مجهزة roscope مع س ص-مرحلة الآلية، التي تسيطر عليها البرنامج المجهر. ومن الأهمية الحاسمة لهذه الخطوة س ص المرحلة مع سرعة الحد الأدنى لتجنب الأضرار التي لحقت الأجنة والاضطرابات في مستنبت والنفط، والتي سوف تقلل من جودة الصورة. لاكتساب الوقت الفاصل بين الأفلام المعروضة هنا، انتقلت س ص-مرحلة الآلية مع سرعة ما يقرب من 1.75 ملم / ثانية. في المستقبل، والتصوير يمكن زيادة تحسين طريق نقل أول مرحلة إلى الموضع المطلوب والحصول على صورة بعد فترة راحة قصيرة للسماح الاهتزازات والاضطرابات تتلاشى. الحصر، يجب أن يكون المستخدمين المحتملين على بينة من مسافة طويلة نسبيا العمل (حوالي 1 سم) اللازمة لهذا الأسلوب الثقافة إذا تم استخدام المجهر تستقيم بدون أهداف الغمر. هذا العمل لمسافات النتائج من الطبقة المتوسطة ومن الزيوت المعدنية على رأس الجنين. في 6 سم طبق بتري، وطبقة النفط لديها thicknesوغمرت المياه 1.5 ملم، والجنين حوالي 4 مم عميقة في مستنبت - الصورة من حوالي 1. اعتمادا على قطر الهدف، الحافة العلوية للطبق بيتري 6 سم ويمكن أيضا أن يحد من الوصول إلى الجنين. يمكن التحايل عليها هذه باستخدام طبق أكبر. المسافة العمل من أعلى يمكن أن تخفض قليلا عن طريق التقليل من سمك الطبقات السائلة. وبالإضافة إلى ذلك، وبعد العمل من دون أن يكون الحد الأدنى من خلال جلب الجنين نزولا إلى أسفل طبق بتري وتقليل سمك زجاج النافذة من الكأس ساخنة. بينما الأمثل بروتوكول للعمل مع العمل لمسافات طويلة التكبير المجهر تستقيم، يمكن تركيبها على مجهر مقلوب أيضا. يجب على المستخدمين في المستقبل أن نضع في اعتبارنا أن تغمر الجنين عميقا جدا في مستنبت قد يؤدي إلى O 2 -diffusion مشاكل، على الرغم من أن التجارب الأولية تشير إلى أن انتشار محدود لا يبدو أن هناك مشكلهليم، طالما وتحيط الجنين عن طريق خزان بما فيه الكفاية واسع من الثقافة والمتوسطة ورقة الترشيح ورطة غير الضغط على الجزء السفلي من طبق بيتري. الحد الآخر هو التحكم في درجة الحرارة. عن طريق ضبط درجة الحرارة وحدة تحكم عن الكأس تسخينها إلى 40 درجة مئوية، ودرجة الحرارة في المتوسط ​​equilibrates إلى 37.5 درجة مئوية في جميع أنحاء الأجنة عندما يتم تغطية متوسطة مع الزيوت المعدنية. هذا يدل على أن بعض الطاقة المفقودة بين الجزء السفلي من الكأس، حيث توجد عناصر التدفئة واستشعار درجة الحرارة، وموقع الأجنة. يمكن أن يكون الأمثل التحكم في درجة الحرارة عن طريق نقل وأجهزة الاستشعار وإعادة توزيع عناصر التدفئة.

وقد فتنت مرحلة التطور الجنيني الإنسان منذ بداية التاريخ. كيف بنية ومورفولوجية للجنين وضع بطريقة الزمانية والمكانية واضحة المعالم؟ أصبح الجنين الفرخ واحدة من النماذج الحيوانية الفقارية الكلاسيكية للمرحلة التطور الجنيني لعدة أسباب: وهي متاحة بسهولة، وغير مكلفة وشفافة في مراحلها المبكرة، ويمكن الوصول إليها عن التلاعب التجريبية، لأنها تتطور خارج الأم. وعلاوة على ذلك، ولديه هندسة مسطحة تقريبا خلال أحداث التخلق في وقت مبكر، مثل القلب وتشكيل الدماغ، تكون المعيدة، تكون العصيبة، وتكون الجسيدات 15. يمكن فهم عمليات التخلق أفضل إذا تم دراستها بشكل حيوي، مثل من خلال الاستحواذ على الوقت الفاصل بين الصور. الجنين الفرخ يمكن تصور في البيضة 16 ولكن يصعب الوصول إليها عن التلاعب التجريبية والرؤية المحدودة للتصوير ضوء انتقال المجهر. ولذلك، قطعوقد اقترحت أساليب القاعدة لأجنة ثقافة كتكوت البيضة السابقين، سواء في النظم الثقافة صفار كلها 13،17 - 19 أو الثقافات يزدرع 1،20 - 23. في النظم الثقافة صفار البيض كله، يبقى الجنين على رأس صفار سليمة، ويتم نقل المحتوى كله من البيض إلى حاوية أخرى للحضانة. هذه الحاوية يمكن أن تكون بديلة قشرة البيضة 17، طبق بيتري 19، أو أرجوحة مصنوعة من البلاستيك تتشبث التفاف 13،18. الأجنة في الثقافات الصفار كلها يمكن أن يكون مثاليا مثقف حتى الفقس ويمكن الوصول إليها لmicromanipulations. هذه التقنيات هي مفيدة بشكل خاص لدراسة تطور الأجنة بعد الشروع في الدورة الدموية (مما يزيد من النقيض)، في حين لا تزال الأجنة الشابة الصعب تصور. هذه الأجنة المبكرة يمكن تصوير أفضل إذا تم رفعه هم من صفار البيض ومثقف كما هو الحال في المختبر إإكسبلنتس. وإإكسبلنتس يمكن الوصول إليها بسهولة عن تجربةتتطلب آل التلاعب ومساحة أقل للزراعة. لسنوات عديدة، كانت تقنية دينيس الجديد رائدة في عام 1955 وتبايناتها المعايير الذهبية وسائل الثقافة يزدرع لافراخ الدجاج، مما يجعل الجنين الوصول للفحص المجهري الوقت الفاصل بين والتدخلات المجهرية 20،21. وعلى الرغم من نجاحها الكبير، تقنية الجديدة هي شاقة وتستغرق وقتا طويلا نسبيا. غالبا ما يفصل الأريمة عندما الغشاء المحي، تحمل الأريمة، وامتدت حول حلقة الزجاج لتحقيق توتر مناسبة 1. وعلاوة على ذلك، فإن الجنين لا يمكن إلا أن يكون المثقف مع لبطني حتى الجانب. ثقافة EC (في وقت مبكر الفرخ)، وهي تقنية أكثر حداثة وضعتها تشابمان وCOLLIGNON 1، تلتف تمتد من الغشاء المحي باستخدام ورقة الناقل مرشح مع فتحة المركزية. وتعلق ورقة الترشيح إلى الغشاء المحي، وبالتالي الحفاظ على التوتر الطبيعي، ويحيط الجنين مثل إطار الصورة 1.الأجنة ثم تربيتها على أسفل أجار زلال، وعادة مع من بطني حتى الجانب. زراعة الظهري حتى الجانب يبدو ممكنا إلا للأجنة في HH8 15 وكبار السن. وقد تكيفت العديد من المجموعات ورقة الناقل مرشح لاحتياجاتهم، مثل استبدال أسفل أجار زلال مع دعم المصنوعة من الألياف خياطة الجراحية 24 أو الكولاجين المغلفة غشاء 25. في كثير من الأحيان، تتعرض الأجنة مثقف مع تقنية الجديدة أو مع الثقافة الأوروبية، مع الظهرية أو السطح البطني في الهواء لتسهيل انتشار الأوكسجين 1،20. هذه الثقافات يزدرع لها أن تبقى في جو مرطب لتجنب التبخر من المتوسط ​​ولمنع الجنين من الجفاف. ويتحقق ذلك عن طريق احتضان الطبق مع ثقافة يزدرع في طبق بتري أكبر تحتوي على المناديل الورقية مبلل 1. اكتساب الوقت الفاصل بين الصور من هذه الأجنة يتطلب إما استخدام حاضنة المناخ التي تسيطر عليها في جميع أنحاء المجهر كله أو المزاجature التي تسيطر عليها حاوية مع غطاء ساخنة لمنع التكثيف في مسار الضوء (14). ومع ذلك، يمكن افراخ الدجاج أيضا تطوير البيضة السابقين مغمورة تماما في مستنبت كما الثقافات ورق الترشيح 25، تقع بين طبقة من الزيت المعدني الثقيل وزلال في تكييفها مع الأوضاع تقنية الجديدة 2،21، أو كما إإكسبلنتس الأريمة مطوية في &quot;كورنيش فطيرة اللحم الثقافة &quot;23،26، من دون اتصال مباشر مع الهواء. والمغمورة ورقة مرشح شطيرة هو البديل الجديد من تقنية فلتر ورقة الناقل. من خلال الجمع بين المعرفة السابقة على زراعة الأجنة الفرخ البيضة السابقين، فإنه يجعل الحاضنة التي تسيطر عليها المناخ والغطاء ساخنة الاستغناء عنها. محصورة الجنين بين اثنين متطابقة فلتر (ليزر لقطع) ناقلات ورقة 24 ومثقف مغمورة تماما في مستنبت بسيطة (Pannett كومبتون المالحة 27،28 وزلال رقيقة في نسبة 3: 2) في درجة الحرارة للرقابة احتواءإيه. وهناك طبقة من الزيوت المعدنية الخفيفة تطفو على أعلى من المتوسط يمنع تبخر 2،21 ويقلل من فقدان الحرارة للبيئة. الجزء السفلي من وعاء يحتوي على زجاج النافذة، ويتم تنفيذ الإعداد كله على العمل لمسافات طويلة التكبير المجهر تستقيم. هذا الإعداد يسمح اكتساب عالية الدقة brightfield والساحة المظلمة الوقت الفاصل بين الأفلام حوالي 30 ساعة من التطور الجنيني، بدءا من أوائل مرحلة الشريط البدائي إلى مرحلة 28 الجسيدة (أي ما يعادل همبرغر هاملتون مراحل 5-16، HH5-16 ) 15. الأجنة يمكن تربيتها جيد على قدم المساواة مع من بطني أو ظهري حتى الجانب. لذلك، الأجنة يمكن الوصول إليها للمراقبة والتلاعب في بطني (على سبيل المثال، في وقت مبكر القلب 7،8 وتكون الجسيدات 6) والظهرية (على سبيل المثال، في وقت متأخر تكون المعيدة 2، العصبية أنبوب الإغلاق 3-5، والدماغ في وقت مبكر 9-13) التنمية. مرشح المغمورة ورقة شطيرة صrovides بيئة بسيطة ومستقرة لجراحة، زرع حبة، حقن مكروي، إسكات الجينات، والدراسات Electroporation لل. إمكانات التصوير ويمكن لها أن تكون دفعت أبعد من ذلك بكثير باستخدام التصوير القائم على الليزر (بما في ذلك الفحص المجهري للضوء ورقة) والأهداف الغمر.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Milli-Q&#160;Reference Water Purification System</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Z00QSV0WW&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duran&#160;laboratory bottles, with caps, 1L</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Duran</td>
			<td>Z305200-10EA&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution A</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1064041000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1049361000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 H2O</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1023821000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2.6H2O</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>13152-1KG-D&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution B</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4.2H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1065801000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4.2H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1063420250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman&#160;qualitative filter paper, Grade 595</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10311611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser cutting machine MLS-90120-C130, CO2-laser, 130W, wavelength 10.6 &#181;m</td>
			<td>Micro Lasersystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tork Extra Soft Facial Tissues</td>
			<td>Tork</td>
			<td>140280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Latex gloves</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z645613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>EMDAMED</td>
			<td>EMDA 300.131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z350613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>VWR</td>
			<td>WITG5.480.003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>accu-jet pro Pipette Controller</td>
			<td>BrandTech Scientific</td>
			<td>26332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological plastic pipettes, 25mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS4251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic document sleeves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg incubator - Incubator mod. Cip Cip 40</td>
			<td>Fiem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fertilized chicken eggs (Gallus gallus)</td>
			<td>Drost BV (Loosdrecht, NL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Tissue culture dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>664160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 cm Petri dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml Centrifuge tubes , Greiner centrifuge tubes&#160; or Cellstar tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>greiner bio-one</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel rings, custom-made</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large rings, 30 mm outer diameter, 4 mm in height, 1.5 mm wall thickness</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small rings, 20 mm outer diameter, 4 mm in height, 1.5 mm wall thickness, 6.5 mm gap in the ring</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, Dumont #5, Inox</td>
			<td>Fine Science Tools , F.S.T.</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine, really sharp scissors for cutting filter paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M3516&#160;Sigma-Aldrich Mineral Oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CAS Number&#160;8042-47-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar bottoms for EC culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539&#160;SIGMA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653&#160;SIGMA-ALDRICH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbead implantation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybead Sampler Kit III (45 &#181;m beads were used)</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>16905-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accupuncture needles: type J, No.02, 0.12x30mm</td>
			<td>SEIRIN</td>
			<td>&#160;type J, No.02, 0.12x30mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controlled beaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTD Temperature Sensor with M4 Threaded Housing RTD-850M</td>
			<td>Omega</td>
			<td>RTD-850M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hermetically Sealed RTD Sensors HSRTD-3-100-A-3M</td>
			<td>Omega</td>
			<td>HSRTD-3-100-A-1M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermistor and RTD Extension Wire EXTT-3CU-26S-50</td>
			<td>Omega</td>
			<td>EXTT-3CU-26S-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Pin Mini Connectors for Thermocouples, 3-Wire RTD&#39;s and Thermistors MTP-U-M</td>
			<td>Omega</td>
			<td>MTP-U-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapton (Polyimide Film) Insulated Flexible Heaters KHLV-103/(10)-P</td>
			<td>Omega</td>
			<td>KHLV-103/(10)-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature/Process Controller CNi16D24-C4EIT-DC</td>
			<td>Omega</td>
			<td>CNi16D24-C4EIT-DC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom-made aluminium beaker, isolated with polyacetal (drawings see sheet 2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope setup</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Zoom.V16 with ApoTome.2 ZEN</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>495010-0009-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective PlanNeoFluar Z 1.0x/0.25 FWD 56mm</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>435281-9100-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Rotary Control MARC</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>435604-0000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transillumination top 450 mot</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>435500-9000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized measuring stage S 150x100 mot; CAN (D)</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>435465-9020-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insert plate S, glass 237x157x3mm (D)</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>435465-9053-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Controller EMS 3</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>435610-9010-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>System Control Panel SYCOP 3</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>435611-9010-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamamatsu ORCA Flash 4.0 camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C11440-22CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy High-End Workstation Xeon Quad-Core mulitlingual</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>490004-0025-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Language Package Windows 7 x64 Ultimate English US</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>410373-0200-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LCD TFT Monitor HP ZR2440w 24&#34;</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>410350-2403-000</td>
			<td>not available anymore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN pro 2012 Hardware License key</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>410135-1002-120</td>
			<td>not available anymore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Software Driver Hamamatsu Cameras Hardware License Key</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>410136-1045-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN module Z Stack</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>410136-0030-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Module Tiles/ Positions</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>410136-1025-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Module Time Lapse</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>410136-1031-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Module Experiment Designer</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>410136-1022-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Desk 2012 Hardware License Key</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>410135-1004-120</td>
			<td>not available anymore</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a submerged filter paper sandwich for long-term ex ovo time-lapse imaging of early chick embryos

نظرا لتوافرها، منخفضة التكلفة، والهندسة المسطحة، والشفافية، وأصبحت البيضة السابقين الجنين الفرخ نموذج حيواني الفقاريات الرئيسي للدراسة الأحداث التخلق، مثل تكون المعيدة 2، تكون العصيبة 3-5، تكون الجسيدات 6، القلب الانحناء 7، 8، والدماغ تشكيل 9-13، خلال مرحلة التطور الجنيني المبكر. المفتاح لفهم عمليات التخلق هو لمتابعتها بشكل حيوي بواسطة الوقت الفاصل بين التصوير. وقد تم الحصول على الوقت الفاصل بين الأفلام من فرخ مرحلة التطور الجنيني البيضة السابقين إما تقتصر على نوافذ زمنية قصيرة أو للحاجة إلى حاضنة للسيطرة على درجة الحرارة والرطوبة حول الجنين 14. هنا، نقدم تقنية جديدة لفرخ ثقافة أجنة البيضة السابقين عالية الدقة الوقت الفاصل بين التصوير باستخدام تنتقل عن طريق المجهر الضوئي. والمغمورة ورقة مرشح شطيرة هو البديل للمرشح ميتاليك رقة الناقل راسخةIQUE (EC-الثقافة) (1) ويسمح للزراعة من افراخ الدجاج من دون الحاجة إلى وجود غرفة المناخ. محصورة الجنين بين حاملتي ورق الترشيح متطابقة ويتم الاحتفاظ مغمورة تماما في والمتوسطة التحكم في درجة حرارته بسيط طبقة من الزيوت المعدنية خفيفة مغطاة. بدءا من المرحلة البدائية متتالية (همبرغر هاملتون المرحلة 5، HH5) 15 تصل إلى ما لا يقل عن المرحلة 28 الجسيدة (HH16) 15، يمكن أن الأجنة يكون مثقف إما على بطني أو ظهري حتى الجانب. وهذا يسمح للشراء الوقت الفاصل بين الأفلام التي تغطي نحو 30 ساعة من التطور الجنيني. وتظهر الممثلة إطارات الوقت الفاصل بين والأفلام. تتم مقارنة الأجنة شكليا إلى الجنين مثقف في القياسية EC-الثقافة. يوفر المغمورة ورقة مرشح شطيرة بيئة مستقرة لدراسة ظهري المبكر وعمليات التخلق البطنية. كما أنه يسمح للتصوير مضان الحية وmicromanipulations، مثل جراحة، عفريت حبةlantation، حقن مكروي، إسكات الجينات، و electroporation، ولديها امكانات قوية لتكون جنبا إلى جنب مع أهداف الغمر للتصوير باستخدام الليزر (بما في ذلك الفحص المجهري ورقة ضوء).

Watch this Scientific Journal Video about A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos at JoVE.com

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for time-lapse imaging using transmitted light and fluorescence microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique1 that allows for the culturing of chick embryos fully-submerged in a liquid culture medium.

والمغمورة ساندويتش ورقة مرشح للالمدى الطويل<em&gt; البيضة السابقين</em&gt; الوقت الفاصل بين التصوير من وقت مبكر الفرخ الأجنة

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

a-submerged-filter-paper-sandwich-for-long-term-ex-ovo-time-lapse

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

22.1K Views.  MOVE Research Institute Amsterdam.   

Video: A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying the biology of retinal neurons, particularly photoreceptors. The applications of this system go beyond basic research, as they can easily be adapted to high throughput technologies for drug development. However, genetic manipulation of retinal photoreceptors in these cultures has proven to be very challenging, posing an important limitation to the usefulness of the system. We have recently developed and validated an ex&#160;ovo plasmid electroporation technique that increases the rate of transfection of retinal cells in these cultures by five-fold compared to other currently available protocols1. In this method embryonic chick eyes are enucleated at stage 27, the RPE is removed, and the retinal cup is placed in a plasmid-containing solution and electroporated using easily constructed custom-made electrodes. The retinas are then dissociated and cultured using standard procedures. This technique can be applied to overexpression studies as well as to the downregulation of gene expression, for example via the use of plasmid-driven RNAi technology, commonly achieving transgene expression in 25% of the photoreceptor population. The video format of the present publication will make this technology easily accessible to researchers in the field, enabling the study of gene function in primary retinal cultures. We have also included detailed explanations of the critical steps of this procedure for a successful outcome and reproducibility.

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Embryonic chick retinal cell cultures constitute valuable tools for the study of photoreceptor biology. We have developed an efficient gene transfer technique based on ex&#160;ovo plasmid electroporation of the retinas prior to culture. This technique considerably increases transfection efficiencies over currently available protocols, making genetic manipulation feasible for this system.

كفاءة نقل الجينات في شبكية العين الفرخ عن الخلية الأولية دراسات الثقافة: ل<em&gt; السابقين البيضة</em&gt; Electroporation للمنهج

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos model organisms, such as the chicken, are often used. The chicken is an excellent model organism due to its low cost and minimal maintenance, however they present observational challenges because they are enclosed in an opaque eggshell. In order to properly view the embryo as it develops, the shell must be windowed or removed. Both windowing and ex ovo techniques have been developed to assist researchers in the study of embryonic development. However, each of the methods has limitations and challenges. Here, we present a simple, optimized ex ovo culture technique for chicken embryos that enables the observation of embryonic development from stage HH 19 into late stages of development (HH 40), when many organs have developed. This technique is easy to adopt in both undergraduate classes and more advanced research laboratories where embryo manipulations are conducted.

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Viewing and accessing the chicken embryo during development can be challenging. We have developed an ex ovo method that is simple, cost effective, and can easily be used in a classroom or research setting. This method provides access to the embryo into late stages of embryonic development (HH 40).

الأمثل<em&gt; السابقين البيضة</em&gt; التثقيف من الفرخ الأجنة إلى مراحل متقدمة من التطوير

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

تحليل<em&gt; في فيفو</em&gt; الهجرة الخلية باستخدام الزرع خلية والتصوير الوقت الفاصل في الزرد الأجنة

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune cells, and the coordination with lymphatic vessels and nerves. The multi-cell, multi-system interactions necessitate the investigation of angiogenesis in a physiologically relevant environment. Thus, while the use of in vitro cell-culture models have provided mechanistic insights, a common critique is that they do not recapitulate the complexity associated with a microvascular network. The objective of this protocol is to demonstrate the ability to make time-lapse comparisons of intact microvascular networks before and after angiogenesis stimulation in cultured rat mesentery tissues. Cultured tissues contain microvascular networks that maintain their hierarchy. Immunohistochemical labeling confirms the presence of endothelial cells, smooth muscle cells, pericytes, blood vessels and lymphatic vessels. In addition, labeling tissues with BSI-lectin enables time-lapse comparison of local network regions before and after serum or growth factor stimulation characterized by increased capillary sprouting and vessel density. In comparison to common cell culture models, this method provides a tool for endothelial cell lineage studies and tissue specific angiogenic drug evaluation in physiologically relevant microvascular networks.

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

Angiogenesis involves multi-cell, multi-system interactions that need to be investigated in a physiologically relevant environment. The objective of this study is to demonstrate the ability of the rat mesentery culture model to make time-lapse comparisons of intact microvascular networks during angiogenesis.

ل<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; طريقة التصوير الوقت الفاصل بين الجرذ شبكات الاوعية الدموية الدقيقة مساريقي مثقف

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. In particular, posterior body elongation is an essential process in embryonic development by which multiple tissue deformations act together to direct the formation of a large part of the body axis. In order to observe this process by long-term time-lapse imaging it is necessary to utilize a mounting technique that allows sufficient support to maintain samples in the correct orientation during transfer to the microscope and acquisition. In addition, the mounting must also provide sufficient freedom of movement for the outgrowth of the posterior body region without affecting its normal development. Finally, there must be a certain degree in versatility of the mounting method to allow imaging on diverse imaging set-ups. Here, we present a mounting technique for imaging the development of posterior body elongation in the zebrafish D. rerio. This technique involves mounting embryos such that the head and yolk sac regions are almost entirely included in agarose, while leaving out the posterior body region to elongate and develop normally. We will show how this can be adapted for upright, inverted and vertical light-sheet microscopy set-ups. While this protocol focuses on mounting embryos for imaging for the posterior body, it could easily be adapted for the live imaging of multiple aspects of zebrafish development.

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

تنوعا تصاعد الطريقة على المدى الطويل التصوير التنمية الزرد

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and subcellular processes, high resolution time-lapse microscopy strategies that preserve physiological conditions are required. Plant tissues must have adequate nutrient and water supply with sustained gaseous exchange but, when submerged and immobilized under a coverslip, they are particularly susceptible to anoxia. One strategy that has been successfully employed is the use of a perfusion system to maintain a constant supply of oxygen and nutrients. However, such arrangements can be complicated, cumbersome, and require specialized equipment. Presented here is an alternative strategy for a simple imaging system using perfluorodecalin as an immersion medium. This system is easy to set up, requires minimal equipment, and is easily mounted on a microscope stage, allowing several imaging chambers to be set up and imaged in parallel. In this system, lateral root growth rates are indistinguishable from growth rates under standard conditions on agar plates for the first two days, and lateral root growth continues at reduced rates for at least another day. Plant tissues are supplied with nutrients via an agar slab that can be used also to administer a range of pharmacological compounds. The system was established to monitor lateral root development but is readily adaptable to image other plant organs such as hypocotyls and primary roots.

Presented here is a simple technique for high-resolution confocal time-lapse imaging of root and hypocotyl development for up to 3 days using high numerical-aperture objectives and perfluorodecalin as an immersion medium.

غرفة بسيطة للتصوير متحد البؤر على المدى الطويل من تطوير الجذر والهيبوكوتيل

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

طويلة الأجل تصوير لايف<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; القرص العين

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to numerous cell types throughout the body. Understanding the biology of the neural crest has been limited, reflecting a lack of genetically tractable models that can be studied in vivo and in real-time. Zebrafish is a particularly important developmental model for studying migratory cell populations, such as the neural crest. To examine neural crest migration into the developing eye, a combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time videos of the developing eye in transgenic zebrafish embryos, namely Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP), as sox10 and foxd3 have been shown in numerous animal models to regulate early neural crest differentiation and likely represent markers for neural crest cells. Multi-photon time-lapse imaging was used to discern the behavior and migratory patterns of two neural crest cell populations contributing to early eye development. This protocol provides information for generating time-lapse videos during zebrafish neural crest migration, as an example, and can be further applied to visualize the early development of many structures in the zebrafish and other model organisms.

A combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time imaging of neural crest migration in Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP) zebrafish embryos.

تصوير مرور الوقت فوتون متعددة لتصور التنمية في الوقت الحقيقي: التصور لترحيل الخلايا العصبية كريست في الأجنة الزرد

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues or cells. A difficulty with imaging whole embryo development is that zebrafish embryos grow substantially in length. When mounted as regularly done in 0.3-1% low melt agarose, the agarose imposes growth restriction, leading to distortions in the soft embryo body. Yet, to perform confocal time-lapse microscopy, the embryo must be immobilized. This article describes a layered mounting method for zebrafish embryos that restrict the motility of the embryos while allowing for the unrestricted growth. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations. To demonstrate the usability of this method, whole embryo vascular, neuronal and muscle development was imaged in transgenic fish for 55 consecutive hours. This mounting method can be used for easy, low-cost imaging of whole zebrafish embryos using inverted microscopes without requirements of molds or special equipment.

This article describes a method to mount fragile zebrafish embryos for extended time-lapse confocal microscopy. This low-cost method is easy to perform using regular glass-bottom microscopy dishes for imaging on any inverted microscope. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations.

طريقه تركيب طبقات لتمديد المجهر البؤري المجهري لأجنه الزبرافيش الكاملة بفواصل زمنيه طويلة

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in vivo imaging techniques can provide a clear window into these processes in the living organism. For example, dividing cells and their progeny can be followed in real time as the nervous system forms. In recent years, technical advances in multicolor techniques have expanded the types of questions that can be investigated. The multicolor Brainbow approach can be used to not only distinguish among like cells, but also to color-code multiple different clones of related cells that each derive from one progenitor cell. This allows for a multiplex lineage analysis of many different clones and their behaviors simultaneously during development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells over real time within the developing zebrafish nervous system. This is particularly useful for following cellular interactions among like cells, which are difficult to label differentially using traditional promoter-driven colors. Our approach can be used for tracking lineage relationships among multiple different clones simultaneously. The large datasets generated using this technique provide rich information that can be compared quantitatively across genetic or pharmacological manipulations. Ultimately the results generated can help to answer systematic questions about how the nervous system develops.

In vivo imaging is a powerful tool that can be used to investigate the cellular mechanisms underlying nervous system development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells in real time within the developing zebrafish nervous system.

تصور الدماغ النامية في سمك الحمار الوحشي المعيشة باستخدام Brainbow والوقت الفاصل Confocal التصوير

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...