ونود أن نشكر بول بوارييه، ومنتج وسائل الإعلام، في جبل جامعة سانت فنسنت لعمله في تصوير وتحرير جزء الفيديو من هذه المخطوطة. ونحن نعترف العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا للحصول على التمويل.

ملاحظة: يتم سرد كافة الإمدادات في الجدول 1. 1. تخزين الأجنة الدجاج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان بيض الدجاج من سلالة جالوس جالوس أفقيا عند 37 درجة مئوية مع ما يقرب من 40٪ الرطوبة وتحويل البيض مرة أو مرتين يوميا. تحول البيض المهم لمنع الجنين من الانضمام إلى قشر البيض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لا لتحويل البيض في ساعة 24 قبل إنشاء ثقافة وإلا سوف يكون موجودا الجنين بطني إلى كتلة صفار البيض وسوف يكون معطوبا على فتح البيض في الخطوة 3. وبالإضافة إلى ذلك، والحفاظ على البيض عند 4 درجة مئوية درجة لمدة لا تزيد على أسبوع قبل الحضانة في التنمية &quot;وقف&quot; ولكن هذه ليست مثالية. </li></ol> 2. التدريج الأجنة الدجاج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استضافة أجنة الدجاج باستخدام همبرغر وهاميلتون 12 الجدول التدريج. مرحلة مثالية لإقامة زراعة-البيضة السابقين هي HH مرحلة 19-20 (حوالي 3- يوما من الحضانة) تيروause هذا بعد فترة وجيزة يتحول الرأس في 53 HPF. ملاحظة: يتميز صاحب السمو مرحلة 19-20 من الصفات المورفولوجية التالية: يتم تمديد somites في الغالبية العظمى من الذيل، ولكن النهاية من الذيل يبقى unsegmented، وكرة لولبية من المهد ذيل، والسقاء صغير والأوعية الدموية محدودة، المحطة براعم هي أكبر من الجناح البراعم والعيون unpigmented أو لديها هوى رمادي. </li></ol> 3. إزالة الأجنة من شل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل إزالة الجنين من قذيفة، رش قذيفة مع الايثانول 70٪ واتركه حتى يجف. لا تتحول البيضة بسرعة حيث سيؤدي ذلك إلى تلف الجنين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> والحرص على عدم تغيير اتجاه البيض، والكراك بعناية البيض على الجانب السفلي (أي الجانب الذي كان بطني أثناء الحضانة) والافراج عن الجنين في عقيمة تزن قارب (88 س 88 × 23 ملم). مسح أسفل تزن القوارب مع 70٪ من الإيثانول. تفقد الجنين للتأكد من أن الكيس المحي غير تالف. إذا صفار حكما مكسورة، وتجاهل الجنين، كما انها لن البقاء على قيد الحياة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مراقبة الجنين للتأكد من أنها غير قابلة للتطبيق. كان القلب ينبض، يظهر الأوعية الدموية العادية، ولا تشوهات واضحة موجودة. تأكد من أن حواف تزن قارب جافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة، وانخفاض 40 ميكرولتر من البنسلين / الستربتومايسين (5،000 وحدة البنسلين، 5 ملغ الستربتومايسين لكل مل) على أعلى من الألبومين للمساعدة في منع العدوى. </li></ol> 4. إعداد غرفة الرطوبة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع كومة صغيرة من كيم مناديل و / أو وسادة ماصة مصنوعة من القطن في الجزء السفلي من وعاء من البلاستيك معقمة (12 × 12 × 6 سم) تمحى مع 70٪ من الإيثانول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الماء المعقم، المقطر لترطيب كيم مناديل و / أو القطن (حوالي 150 مل من الماء). </li></ol> 5. تجميع البيضة السابقين الثقافة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع وزن القارب الذي يحتوي على الجنين في أعلى الحشو رطبة. ثم، ومكان النصف من مربع معقم بتري طبق (9.5 X 9.5 سم) على رأس ركان وزن القارب لتشكيل غطاء فضفاض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية حاوية بلاستيكية مع غطاء لها. اضغط لأسفل ركنين من الغطاء، وضمان وجود ختم الجزئي الذي لا يزال يسمح لتدفق الهواء جيدة داخل الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع بعناية الإعداد إلى C حاضنة 37 درجة حتى المرحلة المطلوبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع حاويات من المياه في الحاضنة للمساعدة في السيطرة على الرطوبة، وإذا حاضنة الرطوبة تسيطر عليها غير متوفرة. تعقيم جميع المياه في غرف الرطوبة والحاضنة وتجديد حسب الحاجة أثناء فترة الحضانة. 40٪ نسبة الرطوبة مثالية. </li></ol>

<ol>
	<li>Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+procedure+for+the+long-term+cultivation+of+chicken+embryos.">A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos.</a> Dev. Biol. 41, 391-394 (1974).</li><li>Gennaro, L. D., Packard, D. S., Stach, R. W., Wagner, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+differentiation+of+chicken+embryos+in+simplified+shell-less+cultures+under+ordinary+conditions+of+incubation.">Growth and differentiation of chicken embryos in simplified shell-less cultures under ordinary conditions of incubation.</a> Growth. 44, 343-354 (1980).</li><li>Tufan, C. A., Akdogan, I., Adiguzel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shell-less+culture+of+the+chick+embryo+as+a+model+system+in+the+study+of+developmental+neurobiology.">Shell-less culture of the chick embryo as a model system in the study of developmental neurobiology.</a> Neuroanat. 3, 8-11 (2004).</li><li>Duench, K., Franz-Odendaal, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+and+Hedgehog+signaling+during+the+development+of+scleral+ossicles.">BMP and Hedgehog signaling during the development of scleral ossicles.</a> Dev. Biol. 365 (1), 251-258 (2012).</li><li>Datar, S., Bhonde, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shell-less+Chick+Embryo+Culture+as+an+Alternative+in+vitro+Model+to+Investigate+Glucose-Induced+Malformation+in+Mammalian+Embryos.">Shell-less Chick Embryo Culture as an Alternative in vitro Model to Investigate Glucose-Induced Malformation in Mammalian Embryos.</a> Rev Diabet Stud. 2 (4), 221-227 (2005).</li><li>Fisher, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+embryos+in+shell-less+culture.+Tested+studies+for+laboratory+teaching.">Chick embryos in shell-less culture. Tested studies for laboratory teaching.</a> , (1983).</li><li>Dunn, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technique+for+shell-less+culture+of+the+72-hour+avian+embryo).">Technique for shell-less culture of the 72-hour avian embryo).</a> Poultry Science. 53, 409-412 (1974).</li><li>Yalcin, H., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ex-ovo+chicken+embryo+culture+system+suitable+for+imaging+and+microsurgery+applications.">An ex-ovo chicken embryo culture system suitable for imaging and microsurgery applications.</a> J. Vis. Exp. (44), (2010).</li><li>Silver, P. H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Special+problems+of+experimenting+in+ovo+on+the+early+chick+embryo,+and+a+solution.">Special problems of experimenting in ovo on the early chick embryo, and a solution.</a> J Embryol Exp Morph. 8 (4), 369-375 (1960).</li><li>Spurlin, J., Lwigale, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+technique+to+increase+accessibility+to+late-stage+chick+embryos+for+in+ovo+manipulations.">A technique to increase accessibility to late-stage chick embryos for in ovo manipulations.</a> Dev. Dyn. 242 (2), 148-154 (2012).</li><li>Dorrell, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+ovo+model+for+directly+visualizing+chicken+embryo+development.">Ex ovo model for directly visualizing chicken embryo development.</a> American Biology Teacher. 74 (9), (2012).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> J. Morph. 88, 49-92 (1951).</li><li>Drossopoulou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+for+anteroposterior+patterning+of+the+vertebrate+limb+based+on+sequential+long-and+short-range+Shh+signaling+and+Bmp+signaling.">A model for anteroposterior patterning of the vertebrate limb based on sequential long-and short-range Shh signaling and Bmp signaling.</a> Development. , 127-1337 (2000).</li><li>Sys, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+ovo+CAM-assay+as+a+xenograft+model+for+sarcoma.">The in ovo CAM-assay as a xenograft model for sarcoma.</a> J. Vis. Exp. (77), e50522 (2013).</li><li>Franz-Odendaal, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+understanding+the+development+of+scleral+ossicles+in+chicken,+Gallus+gallus.">Towards understanding the development of scleral ossicles in chicken, Gallus gallus.</a> Dev. Dyn. 237, 3240-3251 (2008).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة في ما يخص المعلومات الواردة في هذه المخطوطة.

البيضة السابقين زراعة ووضع النوافذ على حد سواء لها مزايا وتحديات. نحن هنا مقارنة المزايا والتحديات من الكأس السابق الستايروفوم البيضة طريقة وأسلوب النوافذ لدينا سابقا الأمثل البيضة الطريقة هو موضح هنا. لدينا وسيلة تمكن التلاعب والمراقبة سهلة للجنين الفرخ في المراحل المتأخرة من التطوير والتحسينات جهدنا لالسابقين التقليدي البيضة طريقة 1، 2، 3 جعلها بالإضافة إلى ذلك من السهل جدا للاستخدام في الفصول مختبر التدريس الجامعية. على الرغم من أن العديد من الباحثين يفضلون أسلوب النوافذ لدراسة تطوير الدجاج لأنها بسيطة لأداء ولها البقاء ممتازا لمراحل متأخرة للتنمية (HH 41-42)، له حدود. أكبرها هي قدرة محدودة لعرض الجنين بأكمله بعد HH المرحلة 30. وبعد مرحلة HH 30، يحتاج نافذة في قشر البيض إلى أن تكون كبيرة للغاية من أجل عرض المتنامية، والانتقال الجنين. هذه نافذة كبيرة هو فرقicult لختم تماما (مما يؤدي إلى مشاكل مع العقم والبقاء على قيد الحياة)، والحصول على إضاءة جيدة داخل البويضة يمكن أن يكون تحديا. وبالإضافة إلى ذلك، الأجنة مرحلة متقدمة كبيرة ويصعب الوصول إليها (أو التلاعب) من خلال النافذة. والبيضة السابقين الطريقة الموصوفة هنا يوفر وصولا غير مطروقة الكامل للجنين. مرة واحدة يتم وضع تزن قارب في غرفة الرطوبة، كامل مجموعة المتابعة هو مستقر للغاية. يمكن وضعها في غرفة الرطوبة كلها تحت المجهر تشريح وتضخم عالية يمكن استخدامها لمراقبة الجنين بأكمله. وبالمقارنة، فإن الطريقة كوب الستايروفوم لديه غرفة الرطوبة هو طويل القامة (الطول كوب) وهذا يجعل من الصعب جدا لوضع إطار الأهداف المجهر. تصميم الكأس هي أيضا أقل استقرارا بكثير من شقة وزن القارب ويمكن بسهولة أن طرقت هذه الكؤوس من جديد. لدينا تحسينات على البيضة السابقين طريقة تجعل هذه الطريقة واضحة لاستخدامها في إعداد الفصول الدراسية أو المختبرات وتمكن الحاديudent لديك حق الوصول الكامل إلى الأجنة من مرحلة HH 19 من خلال لسمو 40؛ مراحل عندما توالد كبير يحدث. وأكبر عيب من السابق لدينا البيضة الأسلوب هو العقم. من أجل منع العدوى، ويشمل أسلوبنا إضافة المضادات الحيوية. يمكن إعطاء جرعة أخرى من المضادات الحيوية للجنين في مراحل لاحقة. كما لا يظهر المضادات الحيوية تدار خلال ثقافة انشاء أن تؤثر على تطور الجنين. تعقيم الحاويات مع الايثانول 70٪ قبل استخدامها يمكن أن تزيد بشكل كبير البقاء على قيد الحياة. وعموما، فإن البيضة السابقين الطريقة مثالية للعرض والتلاعب الأجنة دون قيود على وصول أو مرحلة من مراحل التنمية. وقد أظهرت الأبحاث السابقة أن زراعة الأجنة البيضة السابقين لا يؤثر سلبا الزخرفة 4،15. على سبيل المثال، نحن لا نرى أي تغييرات في الزخرفة أو تحريض الهيكل العظمي على الرغم من عدم وجود قشر البيض. لدينا تحسين طريقة يحل متعددة جhallenges موجودة مع السابقين التقليدي الحالي البيضة طريقة 1،2، 3.

Ex ovo culturing has played an important role in the study of development of the chicken1, 2. This culturing method has been used to study neurological diseases, limb development, craniofacial development, and as a model to investigate malformations associated with diabetes 3, 4, 5.
There are many variations to the ex ovo technique. The most common approach is to use a Styrofoam cup6,7,8 or a glass bowl5. In these methods, the cup or bowl is lined with plastic wrap to cradle the embryo, a lid is placed on the cup, and the embryo is then placed in an incubator with appropriate humidity6. This set up however, can be technically challenging. The first challenge is the plastic wrap that is used to cradle the embryo. This wrap is difficult to work with and often does not adhere to the cup very well. To solve this problem, an elastic band is placed around the cup to hold the wrap in place. Despite this, the wrap can still slip, which is fatal to the embryo. The plastic wrap has the potential to tear or get punctured by forceps or needles that may be used during embryo manipulations and observations. Finally, this set-up is not very stable and students can easily knock the cups over. The height of the cups also makes it very difficult to place the embryo under a stereomicroscope, which has a limited objective to stage height. These challenges make it difficult for undergraduate students to work with live chick embryos in teaching labs, such as advanced developmental biology courses. 
The above challenges in the ex ovo method has meant that researchers turn to the windowing method 9,10 to view embryonic chick development. In this technique, a hole or &#8220;window&#8221; is made in the eggshell overlying the embryo. The hole can be re-sealed with tape or wax9 to allow for further embryonic development. Although the windowing method has some advantages, such as the ability to view embryonic development and easy maintenance, this method also has several limitations. The first is that the window needs to be fairly large in order to view the entire embryo (especially at late stages). Secondly, large windows are difficult to seal; an improper seal will lead to sterility and survivability problems. Using molten wax as a sealant adds another inconvenient and messy step to the protocol. Therefore, although the windowing method may be ideal for chick embryos at young stages (HH 11 &#8211; HH 27), viewing the entire embryo at late stages is not easily accomplished. 
Here, we describe an improved and simple ex ovo culturing technique11 that avoids the need for high tech equipment, is easy to handle under a stereomicroscope, gives the embryo enough support to perform microscopic manipulations, and enables researchers to view the growth of the embryo in its entirety well into the later stages of development (up to HH 40-41). With these advances in the ex ovo technique, individuals gain access to a more complete understanding of embryonic development. For instance, growth into later stages allows individuals to observe developmental processes that do not occur until this time point, such as ossification, feather development, and advanced limb and eye development. The entire embryo and extraembryonic membranes and vasculature are clearly visible. More advanced research can also be performed, such as, embryonic manipulations (i.e., implanting beadssoaked in inhibitors or inserting barriers between tissue layers), and researchers are then able to observe the effect of the manipulations in later stage embryos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="658">
	<tbody>
		<tr height="78">
			<td height="78" style="height:79px;width:177px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:136px;">Sigma</td>
			<td style="width:152px;">P4458</td>
			<td style="width:192px;">Make small aliquots to avoid freeze/thaw events</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="61" rowspan="3" style="height:61px;width:177px;">Square Petri Dish</td>
			<td rowspan="3" style="width:136px;">N/A</td>
			<td rowspan="3" style="width:152px;">N/A</td>
			<td rowspan="3" style="width:192px;">9.5 cm x 9.5 cm</td>
		</tr>
		<tr height="19">
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:177px;">Weigh Boat</td>
			<td style="width:136px;">Fischer Scientific</td>
			<td align="right" style="width:152px;">8732113</td>
			<td style="width:192px;">88 x 88 x 23 mm</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:177px;">Ziplock container</td>
			<td style="width:136px;">Ziplock</td>
			<td style="width:152px;">N/A</td>
			<td style="width:192px;">12 cm x 12 cm x 6 cm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimized ex-ovo culturing of chick embryos to advanced stages of development

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos model organisms, such as the chicken, are often used. The chicken is an excellent model organism due to its low cost and minimal maintenance, however they present observational challenges because they are enclosed in an opaque eggshell. In order to properly view the embryo as it develops, the shell must be windowed or removed. Both windowing and ex ovo techniques have been developed to assist researchers in the study of embryonic development. However, each of the methods has limitations and challenges. Here, we present a simple, optimized ex ovo culture technique for chicken embryos that enables the observation of embryonic development from stage HH 19 into late stages of development (HH 40), when many organs have developed. This technique is easy to adopt in both undergraduate classes and more advanced research laboratories where embryo manipulations are conducted.

هذه البيضة السابقين الأسلوب يسمح لمراقبة الأجنة من المراحل الأولى من التنمية (HH 19/20) إلى المراحل المتأخرة للتنمية (HH 40-41) (الشكل 1A و 1B). وضع الثقافة في HH 19-20 يزيد بقاء الأجنة في الثقافة. وقبل رأسه تحول (قبل 53 HPF) البقاء على قيد الحياة ضئيلة جدا في الثقافة وبعد المرحلة 21، والجنين يميل إلى التمسك أكثر إلى قذيفة على إزالة حتى يتم الحصول على عدد أقل من الأجنة سليمة. بشكل عام، البقاء على قيد الحياة للجنين في البيضة السابقين الثقافة مرتفع يصل إلى سمو 35-36 (90-100٪)، ولكنها قطرة في مراحل أكثر تقدما للتنمية (حوالي 40٪ البقاء على قيد الحياة لسمو 40-41). بالإضافة إلى ذلك، على الرغم من أنه قد ثبت أن التنمية يبدو وضعها الطبيعي في هذه المراحل المتأخرة والزخرفة الهيكل العظمي لا يتأثر 4،15، لاحظنا أن الأطراف يعكفون في هذه المراحل المتأخرة مما يشير إلى أن درجة أو توقيت التحجر قد تتأثر. هذا هوليس من المستغرب النظر في الحاجة إلى الكالسيوم من قذيفة لالتحجر. هي مقارنة مفصلة لتطور الجنين مقارنة مع الضوابط جارية وهي خارج نطاق هذه الورقة الأساليب. الحصول على إمكانية الوصول إلى الجنين طوال تنمية المهم لسببين رئيسيين. أولا والباحثين قادرين على عرض تنمية على أساس يومي دون الحاجة إلى فضها وختم نافذة. على سبيل المثال، والأفراد قادرين على مراقبة أطرافهم والتنمية العين في مراحل متعددة (الشكل 1C و1D). ثانيا، البيضة السابقين زراعة يتيح إمكانية أكبر للوصول (غير مقيد) إلى الجنين، وبالتالي تمكين التلاعب أسهل أو العمليات الجراحية. التلاعب الجنينية في معظم الأحيان، والحاجة إلى أن يقوم باستخدام stereomicroscope. باستخدام البيضة السابقين طريقة زراعة الموصوفة هنا بدلا من الستايروفوم طريقة / الاغطية البلاستيكية 6،7،8 الجنين يتم وضعها انشاء بسهولة اوندإيه المجهر، هو أقل عمقا ولن تنقلب. وهذا يتيح للباحث لوضع غرفة الرطوبة بدقة حسب الحاجة وتناوب عليها لتحسين الوصول إلى الجنين، حيث لا توجد حواجز (قشرة البيضة) التعتيم على الجنين ومنذ غرفة مستقرة جدا. وعموما، فإن الدعم الذي يتلقاه الجنين من وزن القارب يسمح ضغط لطيف ليتم تطبيقها على الجنين خلال التلاعب دون الإعداد السقوط. ويمكن إجراء عدة طرق البيولوجيا التنموية على الأجنة في هذا النظام الثقافة. وتشمل هذه الملاحظات التفصيلية لجهاز (على سبيل المثال، والعين، وغيرها الدماغ) أو تطوير الأنسجة (على سبيل المثال، نمو الأوعية الدموية) أو تطبيق وكلاء ماسخة. وتشمل التلاعب تطعيم الأنسجة على الأغشية سقائية مشيمائية لدراسة تأثير الجمع بين طبقات الأنسجة المختلفة أو دراسة نمو الورم والانبثاث 14. آخر التلاعب شعبية يؤديها خلال التنمية هو BEAد أو حاجز زرع. زرع حبة يسمح الباحث لامتصاص المانع أو عامل على حبة ثم زرع حبة محليا لمنع أو حث الجينات محليا في مجال الاهتمام. وغالبا ما يتم ذلك باستخدام affigel أو الهيبارين الخرز (الشكل 2A). على سبيل المثال، العظام البروتينات التخلق (أفضل الممارسات الإدارية) يمكن تثبيط محليا خلال تحريض قمة العصبية المشتقة العظام 4، 15، أو في براعم الأطراف النامية 13. بعد زرع حبة، ويمكن إرجاع الجنين إلى الحاضنة، وسوف تستمر في التطور. هذا يسمح للباحثين لعرض الآثار المصب من تثبيط جينات معينة (في هذه الحالة BMP)، مثل تثبيط تشكيل عظيمات الصلبة في الحلقة المتصلبة (الشكل 2B و2C) 15. وبالمثل، والحواجز ويمكن بسهولة أن يدرج بين طبقات الأنسجة من أجل دراسة الأنسجة إلى أنسجة الإشارات ويمكن ايضا بسهولة ان أجرى Microinjection من الأصباغ. </p&gt; <img alt="الشكل (1)" src="/files/ftp_upload/52129/52129fig1.jpg" /> الشكل 1. الاطلاع على البيانات الشخصية والبيضة جنين السابق. (A) مرحلة HH 20 فرخ جنين بعد إزالة من قذيفة، ونقاط السهم إلى الجنين مع الأغشية الجنينية أوعية دموية. (ب) HH المرحلة 40 الجنين في غرفة الرطوبة المفتوحة. (C) سمو مرحلة 35 الجنين تظهر براعم الأطراف في وقت مبكر (السهم). (D) المرحلة HH 41 الجنين تظهر تطور مرحلة لاحقة من هياكل مثل العين (السهم). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52129/52129fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/52129/52129fig2.jpg" /> الشكل 2. مثال على رأس غارقة حبة زرع Experimوالأنف والحنجرة (4). (A) الأجنة سمو مرحلة 35 كشفت من خلال ثقب صغير مزقتها في الأغشية المغطي من أجل الوصول إلى العين الأساسية للحبة زرع. ويظهر تضخم عالية من حبة affigel المجاورة لحليمة الملتحمة في أقحم. شريط النطاق في C هو 75 ميكرون. (ب) الفوسفاتيز القلوية ملطخة العين اليمنى بعد زرع رأس حبة (السهم) تظهر فجوة في حلقة العظيمات، HH 38 (C) AP الملون العين اليسرى ولم تظهر أي اختلال في حلقة من العظيمات (مراقبة )، وتقدم سمو 38. تفاصيل هذه التجربة في Duench وفرانز Odendaal 4. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52129/52129fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development at JoVE.com

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Viewing and accessing the chicken embryo during development can be challenging. We have developed an ex ovo method that is simple, cost effective, and can easily be used in a classroom or research setting. This method provides access to the embryo into late stages of embryonic development (HH 40).

الأمثل<em&gt; السابقين البيضة</em&gt; التثقيف من الفرخ الأجنة إلى مراحل متقدمة من التطوير

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

optimized-ex-ovo-culturing-chick-embryos-to-advanced-stages

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

13.5K Views.  Mount Saint Vincent University. Viewing and accessing the chicken embryo during development can be challenging. We have developed an ex ovo method that is simple, cost effective, and can easily be used in a classroom or research setting. This method provides access to the embryo into late stages of embryonic development (HH 40). 

Video: Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying the biology of retinal neurons, particularly photoreceptors. The applications of this system go beyond basic research, as they can easily be adapted to high throughput technologies for drug development. However, genetic manipulation of retinal photoreceptors in these cultures has proven to be very challenging, posing an important limitation to the usefulness of the system. We have recently developed and validated an ex&#160;ovo plasmid electroporation technique that increases the rate of transfection of retinal cells in these cultures by five-fold compared to other currently available protocols1. In this method embryonic chick eyes are enucleated at stage 27, the RPE is removed, and the retinal cup is placed in a plasmid-containing solution and electroporated using easily constructed custom-made electrodes. The retinas are then dissociated and cultured using standard procedures. This technique can be applied to overexpression studies as well as to the downregulation of gene expression, for example via the use of plasmid-driven RNAi technology, commonly achieving transgene expression in 25% of the photoreceptor population. The video format of the present publication will make this technology easily accessible to researchers in the field, enabling the study of gene function in primary retinal cultures. We have also included detailed explanations of the critical steps of this procedure for a successful outcome and reproducibility.

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Embryonic chick retinal cell cultures constitute valuable tools for the study of photoreceptor biology. We have developed an efficient gene transfer technique based on ex&#160;ovo plasmid electroporation of the retinas prior to culture. This technique considerably increases transfection efficiencies over currently available protocols, making genetic manipulation feasible for this system.

كفاءة نقل الجينات في شبكية العين الفرخ عن الخلية الأولية دراسات الثقافة: ل<em&gt; السابقين البيضة</em&gt; Electroporation للمنهج

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice &#8212; A High-throughput Screen in ES Cells

Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely limits its potential. We describe here the use of mouse embryonic stem (ES) cells as surrogate cells to screen for a phenotype of interest and subsequently introduce these cells into a host embryo to develop into a living mouse carrying the phenotype. This method provides (1) a cost effective, high-throughput platform for genetic screen in mammalian cells; (2) a rapid way to identify the mutated genes and verify causality; and (3) a short-cut to develop mouse mutants directly from these selected ES cells for whole animal studies. We demonstrated the use of paraquat (PQ) to select resistant mutants and identify mutations that confer oxidative stress resistance. Other stressors or cytotoxic compounds may also be used to screen for resistant mutants to uncover novel genetic determinants of a variety of cellular stress resistance.

Stress resistance is one of the hallmarks for longevity and is known to be genetically governed. Here, we developed an unbiased high-throughput method to screen for mutations that confer stress resistance in ES cells with which to develop mouse models for longevity studies.

المنهج الوراثي إلى الأمام للكشف عن الإجهاد الجينات المقاومة في الفئران - شاشة عالية الإنتاجية في خلايا ES

Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely ...

A Novel Ex Ovo Banding Technique to Alter Intracardiac Hemodynamics in an Embryonic Chicken System

The new model presented here can be used to understand the influence of hemodynamics on specific cardiac developmental processes, at the cellular and molecular level. To alter intracardiac hemodynamics, fertilized chicken eggs are incubated in a humidified chamber to obtain embryos of the desired stage (HH17). Once this developmental stage is achieved, the embryo is maintained ex ovo and hemodynamics in the embryonic heart are altered by partially constricting the outflow tract (OFT) with a surgical suture at the junction of the OFT and ventricle (OVJ). Control embryos are also cultured ex ovo but are not subjected to the surgical intervention. Banded and control embryos are then incubated in a humidified incubator for the desired period of time, after which 2D ultrasound is employed to analyze the change in blood flow velocity at the OVJ as a result of OFT banding. Once embryos are maintained ex ovo, it is important to ensure adequate hydration in the incubation chamber so as to prevent drying and eventually embryo death. Using this new banded model, it is now possible to perform analyses of changes in the expression of key players involved in valve development and to understand the role of hemodynamics on cellular responses in vivo, which could not be achieved previously.

A Novel Ex Ovo Banding Technique to Alter Intracardiac Hemodynamics in an Embryonic Chicken System

For the first time we present here a reproducible banding procedure to alter hemodynamics in the developing heart ex ovo. This is achieved by partially constricting the outflow tract (OFT).

رواية<em&gt; البيضة السابقين</em&gt; التطويق وتقنيات لتغيير داخل القلب ديناميكا الدم في نظام الجنينية الدجاج

The new model presented here can be used to understand the influence of hemodynamics on specific cardiac developmental processes, at the cellular and ...

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of morphogenetic events, such as gastrulation2, neurulation3-5, somitogenesis6, heart bending7,8, and brain formation9-13, during early embryogenesis. Key to understanding morphogenetic processes is to follow them dynamically by time-lapse imaging. The acquisition of time-lapse movies of chick embryogenesis ex ovo has been limited either to short time windows or to the need for an incubator to control temperature and humidity around the embryo14. Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for high-resolution time-lapse imaging using transmitted light microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique (EC-culture)1 and allows for the culturing of chick embryos without the need for a climate chamber. The embryo is sandwiched between two identical filter paper carriers and is kept fully submerged in a simple, temperature-controlled medium covered by a layer of light mineral oil. Starting from the primitive streak stage (Hamburger-Hamilton stage 5, HH5)15 up to at least the 28-somite stage (HH16)15, embryos can be cultured with either their ventral or dorsal side up. This allows the acquisition of time-lapse movies covering about 30 hr of embryonic development. Representative time-lapse frames and movies are shown. Embryos are compared morphologically to an embryo cultured in the standard EC-culture.
The submerged filter paper sandwich provides a stable environment to study early dorsal and ventral morphogenetic processes. It also allows for live fluorescence imaging and micromanipulations, such as microsurgery, bead implantation, microinjection, gene silencing, and electroporation, and has a strong potential to be combined with immersion objectives for laser-based imaging (including light-sheet microscopy).

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for time-lapse imaging using transmitted light and fluorescence microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique1 that allows for the culturing of chick embryos fully-submerged in a liquid culture medium.

والمغمورة ساندويتش ورقة مرشح للالمدى الطويل<em&gt; البيضة السابقين</em&gt; الوقت الفاصل بين التصوير من وقت مبكر الفرخ الأجنة

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and zebrafish embryos. Our system comprises a chamber featuring a simple setup that is nevertheless robust to induce and maintain a specific oxygen concentration and temperature in any experimental solution of choice. The presented system is very cost-effective but highly functional, it allows induction and sustainment of hypoxia for direct experiments in vivo and for various time periods up to 48 h.
To monitor and study the effects of hypoxia, we have employed two methods - measurement of levels of hypoxia-inducible factor 1alpha (HIF-1&#945;) in whole embryos or specific tissues and determination of retinal stem cell proliferation by 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU) incorporation into the DNA. HIF-1&#945; levels can serve as a general hypoxia marker in the whole embryo or tissue of choice, here embryonic retina. EdU incorporation into the proliferating cells of embryonic retina is a specific output of hypoxia induction. Thus, we have shown that hypoxic embryonic retinal progenitors decrease proliferation within 1 h of incubation under 5% oxygen of both frog and zebrafish embryos.
Once mastered, our setup can be employed for use with small aquatic model organisms, for direct in vivo experiments, any given time period and under normal, hypoxic or hyperoxic oxygen concentration or under any other given gas mixture.

We introduce a novel hypoxic chamber system for use with aquatic organisms such as frog and zebrafish embryos. Our system is simple, robust, cost-effective and allows the induction and sustainment of hypoxia in vivo and for up to 48 h. We present 2 reproducible methods to monitor the effectiveness of hypoxia.

تحريض نقص الأكسجة في الضفدع الحي والأجنة الزرد

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to numerous cell types throughout the body. Understanding the biology of the neural crest has been limited, reflecting a lack of genetically tractable models that can be studied in vivo and in real-time. Zebrafish is a particularly important developmental model for studying migratory cell populations, such as the neural crest. To examine neural crest migration into the developing eye, a combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time videos of the developing eye in transgenic zebrafish embryos, namely Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP), as sox10 and foxd3 have been shown in numerous animal models to regulate early neural crest differentiation and likely represent markers for neural crest cells. Multi-photon time-lapse imaging was used to discern the behavior and migratory patterns of two neural crest cell populations contributing to early eye development. This protocol provides information for generating time-lapse videos during zebrafish neural crest migration, as an example, and can be further applied to visualize the early development of many structures in the zebrafish and other model organisms.

A combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time imaging of neural crest migration in Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP) zebrafish embryos.

تصوير مرور الوقت فوتون متعددة لتصور التنمية في الوقت الحقيقي: التصور لترحيل الخلايا العصبية كريست في الأجنة الزرد

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos

Hematopoiesis is an essential cellular process in which hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) differentiate into the multitude of different cell lineages that comprise mature blood. Isolation and identification of these HSPCs is difficult because they are defined ex post facto; they can only be defined after their differentiation into specific cell lineages. Over the past few decades, the zebrafish (Danio rerio) has become a model organism to study hematopoiesis. Zebrafish embryos develop ex utero, and by 48 h post-fertilization (hpf) have generated definitive HSPCs. Assays to assess HSPC differentiation and proliferation capabilities have been developed, utilizing transplantation and subsequent reconstitution of the hematopoietic system in addition to visualizing specialized transgenic lines with confocal microscopy. However, these assays are cost prohibitive, technically difficult, and time consuming for many laboratories. Development of an in vitro model to assess HSPCs would be cost effective, quicker, and present fewer difficulties compared to previously described methods, allowing laboratories to quickly assess mutagenesis and drug screens that affect HSPC biology. This novel in vitro assay to assess HSPCs is performed by plating dissociated whole zebrafish embryos and adding exogenous factors that promote only HSPC differentiation and proliferation. Embryos are dissociated into single cells and plated with HSPC-supportive colony stimulating factors that cause them to generate colony forming units (CFUs) that arise from a single progenitor cell. These assays should allow more careful examination of the molecular pathways responsible for HSPC proliferation, differentiation, and regulation, which will allow researchers to understand the underpinnings of vertebrate hematopoiesis and its dysregulation during disease.

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells HSPCs in Developing Zebrafish Embryos

Here, we present a simple method to quantitate hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) in embryonic zebrafish. HSPCs from dissociated zebrafish are plated in methylcellulose with supportive factors, differentiating into mature blood. This allows the detection of blood defects and allows drug screening to be easily conducted.

تطوير التحليل في المختبر كوانتيتاتي الجذعية المكونة للدم والسلف الخلايا (هسبكس) في تطوير الأجنة الزرد

Hematopoiesis is an essential cellular process in which hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) differentiate into the multitude of different cell ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in zebrafish during different developmental stages. To investigate the role of endoglin(eng) in vessel formation during the development of hereditary hemorrhagic telangiectasia&#160;(HHT), morpholino-mediated targeted knockdown of eng in zebrafish are used to study its temporal expression and associated functions. Here, whole-mount in situ RNA hybridization (WISH) is employed for the analysis of eng and its downstream genes in zebrafish embryos. Also, tube formation assays are performed in HHT patient-derived induced pluripotent stem cell-differentiated&#160;endothelial cells (iPSC-ECs; with eng mutations). A specific signal amplifying system using the whole amount In Situ Hybridization &#8211; WISH provides higher resolution and lower background results compared to traditional methods. To obtain a better signal, the post-fixation time is adjusted to 30 min after probe hybridization. Because fluorescence staining is not sensitive in zebrafish embryos, it is replaced with diaminobezidine (DAB) staining here. In this protocol, HHT&#160;patient-derived iPSC lines containing an eng mutation are differentiated into endothelial cells. After coating a plate with basement membrane matrix for 30 min at 37 &#176;C, iPSC-ECs are seeded as a monolayer into wells and kept at 37 &#176;C for 3 h. Then, the tube length and number of branches are calculated using microscopic images. Thus, with this improved WISH protocol, it is shown that reduced eng expression affects endothelial progenitor formation in zebrafish embryos. This is further confirmed by tube formation assays using iPSC-ECs derived from a patient with HHT. These assays confirm the role for eng in early vascular development.

Presented here is a protocol for whole-mount in situ RNA hybridization analysis in zebrafish and tube formation assay in patient-derived induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells to study the role of endoglin in vascular formation.

التهجين الكامل في الموقع في أجنة حمار وحشي وأنبوب تشكيل اساي في iPSC-ECs لدراسة دور Endoglin في التنمية الوعائية

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs during early development are technically challenging due to the limiting cell number. Moreover, many approaches require a miRNA of interest to be defined in assays such as northern blotting, microarray, and qPCR. Therefore, the expression of many miRNAs and their isoforms have not been studied during early development. Here, we demonstrate a protocol for small RNA sequencing of sorted cells from early mouse embryos to enable relatively unbiased profiling of miRNAs in early populations of neural crest cells. We overcome the challenges of low cell input and size selection during library preparation using amplification and gel-based purification. We identify embryonic age as a variable accounting for variation between replicates and stage-matched mouse embryos must be used to accurately profile miRNAs in biological replicates. Our results suggest that this method can be broadly applied to profile the expression of miRNAs from other lineages of cells. In summary, this protocol can be used to study how miRNAs regulate developmental programs in different cell lineages of the early mouse embryo.

We describe a technique for profiling microRNAs in early mouse embryos. This protocol overcomes the challenge of low cell input and small RNA enrichment. This assay can be used to analyze changes in miRNA expression over time in different cell lineages of the early mouse embryo.

إعداد مكتبات RNA الصغيرة لتسلسل من أجنة الماوس المبكر

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...

A Simple and Effective Transplantation Device for Zebrafish Embryos

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex developmental processes. Zebrafish embryos are ideally suited for these manipulations since they are easily accessible, relatively large in size, and transparent. However, previously developed devices for cell removal and transplantation are cumbersome to use or expensive to purchase. In contrast, the transplantation device presented here is economical, easy to assemble, and simple to use. In this protocol, we first introduce the handling of the transplantation device as well as its assembly from commercially and widely available parts. We then present three applications for its use: generation of ectopic clones to study signal dispersal from localized sources, extirpation of cells to produce size-reduced embryos, and germline transplantation to generate maternal-zygotic mutants. Finally, we show that the tool can also be used for embryological manipulations in other species such as the Japanese rice fish medaka.

Embryological manipulations such as extirpation and transplantation of cells are important tools to study early development. This protocol describes a simple and effective transplantation device to perform these manipulations in zebrafish embryos.

جهاز زرع بسيط وفعال لأجنة حمار وحشي

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex ...