This study was supported by the Velux Stiftung (A.K.M.), NIH grant EY024207 (A.K.M.) and the Austrian Science Fund (FWF) project J3686 (B.P.).

<ol>
	<li>Ernst, O. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+and+animal+rhodopsins:+structures,+functions,+and+molecular+mechanisms.">Microbial and animal rhodopsins: structures, functions, and molecular mechanisms.</a> Chem. Rev. 114, 126-163 (2014).</li><li>Menon, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opsin+is+a+phospholipid+flippase.">Opsin is a phospholipid flippase.</a> Curr. Biol. CB. 21, 149-153 (2011).</li><li>Goren, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+phospholipid+scramblase+activity+of+a+G+protein-coupled+receptor.">Constitutive phospholipid scramblase activity of a G protein-coupled receptor.</a> Nat. Commun. 5, 5115 (2014).</li><li>Ernst, O. P., Menon, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+scrambling+by+rhodopsin.">Phospholipid scrambling by rhodopsin.</a> Photochem. Photobiol. Sci. Off. J. Eur. Photochem. Assoc. Eur. Soc. Photobiol. , (2015).</li><li>Sanyal, S., Menon, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flipping+lipids:+why+an'+what's+the+reason+for?.">Flipping lipids: why an' what's the reason for?.</a> ACS Chem. Biol. 4, 895-909 (2009).</li><li>Bevers, E. M., Williamson, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+scramblase:+an+update.">Phospholipid scramblase: an update.</a> FEBS Lett. 584, 2724-2730 (2010).</li><li>Leventis, P. A., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distribution+and+function+of+phosphatidylserine+in+cellular+membranes.">The distribution and function of phosphatidylserine in cellular membranes.</a> Annu. Rev. Biophys. 39, 407-427 (2010).</li><li>Quazi, F., Lenevich, S., Molday, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ABCA4+is+an+N-retinylidene-phosphatidylethanolamine+and+phosphatidylethanolamine+importer.">ABCA4 is an N-retinylidene-phosphatidylethanolamine and phosphatidylethanolamine importer.</a> Nat. Commun. 3, 925 (2012).</li><li>Quazi, F., Molday, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP-binding+cassette+transporter+ABCA4+and+chemical+isomerization+protect+photoreceptor+cells+from+the+toxic+accumulation+of+excess+11-cis-retinal.">ATP-binding cassette transporter ABCA4 and chemical isomerization protect photoreceptor cells from the toxic accumulation of excess 11-cis-retinal.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 5024-5029 (2014).</li><li>Ben-Shabat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+a+nonaoxirane+from+A2E,+a+lipofuscin+fluorophore+related+to+macular+degeneration,+and+evidence+of+singlet+oxygen+involvement.">Formation of a nonaoxirane from A2E, a lipofuscin fluorophore related to macular degeneration, and evidence of singlet oxygen involvement.</a> Angew. Chem. Int. Ed Engl. 41, 814-817 (2002).</li><li>Sparrow, J. R., Wu, Y., Kim, C. Y., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+meets+all-trans-retinal:+the+making+of+RPE+bisretinoids.">Phospholipid meets all-trans-retinal: the making of RPE bisretinoids.</a> J. Lipid Res. 51 (2010), 247-261 (2010).</li><li>Sch&#252;tt, F., Davies, S., Kopitz, J., Holz, F. G., Boulton, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodamage+to+human+RPE+cells+by+A2-E,+a+retinoid+component+of+lipofuscin.">Photodamage to human RPE cells by A2-E, a retinoid component of lipofuscin.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41, 2303-2308 (2000).</li><li>Picollo, A., Malvezzi, M., Accardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TMEM16+proteins:+unknown+structure+and+confusing+functions.">TMEM16 proteins: unknown structure and confusing functions.</a> J. Mol. Biol. 427, 94-105 (2015).</li><li>Mohammadi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+FtsW+as+a+transporter+of+lipid-linked+cell+wall+precursors+across+the+membrane.">Identification of FtsW as a transporter of lipid-linked cell wall precursors across the membrane.</a> EMBO J. 30, 1425-1432 (2011).</li><li>Meeske, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MurJ+and+a+novel+lipid+II+flippase+are+required+for+cell+wall+biogenesis+in+Bacillus+subtilis.">MurJ and a novel lipid II flippase are required for cell wall biogenesis in Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 6437-6442 (2015).</li><li>Ruiz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+Flippases+for+Bacterial+Peptidoglycan+Biosynthesis.">Lipid Flippases for Bacterial Peptidoglycan Biosynthesis.</a> Lipid Insights. 8, 21-31 (2015).</li><li>Rick, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+the+wzxE+gene+of+Escherichia+coli+K-12+encodes+a+protein+involved+in+the+transbilayer+movement+of+a+trisaccharide-lipid+intermediate+in+the+assembly+of+enterobacterial+common+antigen.">Evidence that the wzxE gene of Escherichia coli K-12 encodes a protein involved in the transbilayer movement of a trisaccharide-lipid intermediate in the assembly of enterobacterial common antigen.</a> J. Biol. Chem. 278, 16534-16542 (2003).</li><li>Suzuki, J., Imanishi, E., Nagata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+of+phosphatidylserine+by+Xk-related+protein+family+members+during+apoptosis.">Exposure of phosphatidylserine by Xk-related protein family members during apoptosis.</a> J. Biol. Chem. 289, 30257-30267 (2014).</li><li>Suzuki, J., Nagata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+scrambling+on+the+plasma+membrane.">Phospholipid scrambling on the plasma membrane.</a> Methods Enzymol. 544, 381-393 (2014).</li><li>Alaimo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+but+interchangeable+mechanisms+for+flipping+of+lipid-linked+oligosaccharides.">Two distinct but interchangeable mechanisms for flipping of lipid-linked oligosaccharides.</a> EMBO J. 25, 967-976 (2006).</li><li>Ernst, C. M., Peschel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad-spectrum+antimicrobial+peptide+restistance+by+MprF-mediated+aminoacylation+and+flipping+of+phospholipids.">Broad-spectrum antimicrobial peptide restistance by MprF-mediated aminoacylation and flipping of phospholipids.</a> Mol. Microbial. 80 (2), 290-299 (2011).</li><li>Vehring, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flip-flop+of+fluorescently+labeled+phospholipids+in+proteoliposomes+reconstituted+with+Saccharomyces+cerevisiae+microsomal+proteins.">Flip-flop of fluorescently labeled phospholipids in proteoliposomes reconstituted with Saccharomyces cerevisiae microsomal proteins.</a> Eukaryot. Cell. 6, 1625-1634 (2007).</li><li>Rouser, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+dimensional+then+[sic]+layer+chromatographic+separation+of+polar+lipids+and+determination+of+phospholipids+by+phosphorus+analysis+of+spots.">Two dimensional then [sic] layer chromatographic separation of polar lipids and determination of phospholipids by phosphorus analysis of spots.</a> Lipids. 5, 494-496 (1970).</li><li>Rigaud, J. -. L., L&#233;vy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes.">Reconstitution of membrane proteins into liposomes.</a> Methods Enzymol. 372, 65-86 (2003).</li><li>Geertsma, E. R., Nik Mahmood, N. A. B., Schuurman-Wolters, G. K., Poolman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+reconstitution+of+ABC+transporters+and+assays+of+translocator+function.">Membrane reconstitution of ABC transporters and assays of translocator function.</a> Nat. Protoc. 3, 256-266 (2008).</li><li>Mimms, L. T., Zampighi, G., Nozaki, Y., Tanford, C., Reynolds, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+vesicle+formation+and+transmembrane+protein+incorporation+using+octyl+glucoside.">Phospholipid vesicle formation and transmembrane protein incorporation using octyl glucoside.</a> Biochemistry. 20, 833-840 (1981).</li><li>Malvezzi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2+-dependent+phospholipid+scrambling+by+a+reconstituted+TMEM16+ion+channel.">Ca2+-dependent phospholipid scrambling by a reconstituted TMEM16 ion channel.</a> Nat. Commun. 4, 2367 (2013).</li><li>Eckford, P. D. W., Sharom, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+reconstituted+P-glycoprotein+multidrug+transporter+is+a+flippase+for+glucosylceramide+and+other+simple+glycosphingolipids.">The reconstituted P-glycoprotein multidrug transporter is a flippase for glucosylceramide and other simple glycosphingolipids.</a> Biochem. J. 389, 517-526 (2005).</li><li>Marek, M., G&#252;nther-Pomorski, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+Flippase+Activity+in+Proteoliposomes+Using+Fluorescent+Lipid+Derivatives.">Assay of Flippase Activity in Proteoliposomes Using Fluorescent Lipid Derivatives.</a> Methods Mol. Biol. 1377, 181-191 (2016).</li><li>Coleman, J. A., Kwok, M. C. M., Molday, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+purification,+and+functional+reconstitution+of+the+P4-ATPase+Atp8a2,+a+phosphatidylserine+flippase+in+photoreceptor+disc+membranes.">Localization purification, and functional reconstitution of the P4-ATPase Atp8a2, a phosphatidylserine flippase in photoreceptor disc membranes.</a> J. Biol. Chem. 284, 32670-32679 (2009).</li><li>Coleman, J. A., Quazi, F., Molday, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+P4-ATPases+and+ABC+transporters+and+their+role+in+phospholipid+transport.">Mammalian P4-ATPases and ABC transporters and their role in phospholipid transport.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1831, 555-574 (2013).</li><li>Romsicki, Y., Sharom, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+flippase+activity+of+the+reconstituted+P-glycoprotein+multidrug+transporter.">Phospholipid flippase activity of the reconstituted P-glycoprotein multidrug transporter.</a> Biochemistry. 40, 6937-6947 (2001).</li><li>Zhou, X., Graham, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+phospholipid+translocase+activity+with+purified+Drs2p,+a+type-IV+P-type+ATPase+from+budding+yeast.">Reconstitution of phospholipid translocase activity with purified Drs2p, a type-IV P-type ATPase from budding yeast.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 16586-16591 (2009).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

فحص النشاط scramblase مكنتنا أصلا لتحديد ما أوبسين ديه فوسفورية النشاط scramblase 2. يسمح فحص لنا أيضا لوصف النشاط scramblase أوبسين عن طريق اختبار خصوصية (كنا مجموعة متنوعة من الدهون مراسل المسمى دبي الوطني مثل بنك دبي الوطني فسفاتيديل إيثانولامين، وصفت مع بنك دبي الوطني على سلسلة أسيل كما هو مبين لبنك دبي الوطني-PC في الشكل 1A، أو على headgroup، بنك دبي الوطني، سفينغوميالين أو NBD- فسفاتيديل 2)، وتأثير حويصلة تكوين الدهون (على سبيل المثال، والكولسترول في كميات مختلفة كأحد مكونات الحويصلة)، وعما إذا كانت الدول متعلق بتكوين مختلفة من أوبسين ورودوبسين كل نشاط المعرض scramblase. وكشفت هذه التحليلات أن النشاط scramblase رودوبسين هو سريع جدا (&gt; 10،000 الفوسفورية لكل ثانية)، غير محددة لفوسفورية ومستقلة عن الدولة بتكوين رودوبسين أو ما إذا كان يحتوي حامل اللون في شبكية العين 2،3 أم لا. هنا،قدمنا ​​طريقة مفصلة لتوليد proteoliposomes تحتوي على أوبسين وأظهر كيف لفحص هذه الاستعدادات للنشاط scramblase فوسفورية. هو الأمثل لبروتوكول إعادة وصفها لتكوين الدهون معين، وعلى إعادة إنشاء وأوبسين بعد تنقيته بواسطة اللوني تقارب باستخدام DDM كما المنظفات على الانحلال. تكوين الدهون وكذلك المنظفات يمكن ان تتغير وفقا لاحتياجات المجرب، على الرغم من أن الظروف إعادة مثالية للظروف المتغيرة يجب أن يتم تحديدها عن طريق إجراء &quot;تورم-التجربة&quot; هو موضح في الشكل (2). DDM هو تجريبيا مناسبة تماما للحفاظ على أوبسين في حالة مستقرة وفاعلة. ومع ذلك، المنظفات الأخرى مثل الأوكتيل-β-جلوكوسيدي، CHAPS أو تريتون X-100 يمكن استخدام البروتوكولات التالية مماثلة. تريتون X-100 هو المنظفات المستخدمة على نطاق واسع لإعادة تشكيل النقل كاسيت ملزمة ATP (النقل ABC) كما efficie لهاNCY في التوسط غشاء إعادة أعلى من المنظفات الأخرى، ويستغرق وقتا أقل لتتوازن مع الجسيمات الشحمية بريفورميد 24. ومن الممكن تحديد حالة بلازميدة قليلة القسيمات من أوبسين تشكيلها وظيفيا إذا تم الحصول على مدى الحد من الفلورسنت لعينات تشكيلها مع كميات مختلفة من أوبسين، أي أكثر من مجموعة من البروتين لنسب فوسفورية (PPRs). من أجل القيام بذلك، PPR من الحويصلات تشكيلها يجب أن تقاس بوضوح عن الانتعاش من البروتين وفوسفورية قد تختلف. انتعاش فوسفورية يمكن تحديده من خلال الفحص الفوسفات هو موضح في القسم 1.2، في حين أن الانتعاش البروتين يمكن تقدير التحليل الكمي البقعة الغربية التي تستخدم في تنقية البروتينات المستخدمة في reconstitutions لتوليد منحنى المعايرة التي تسمح بالمقارنة مع استعادة عينات أعيد تشكيلها عبر مجموعة PPR اختبار (كما هو موضح بالتفصيل في إشارة 3). هو مبني على فحص النشاط scramblase على افتراض أن dithionite لا تتغلغل في الحويصلات. هذه النقطة يمكن التحقق من محاصرة مراسل ذوبان المسمى دبي الوطني داخل الحويصلات وتحديد ما إذا كان يمكن تخفيض dithionite. لهذا الغرض، ويستخدم بنك دبي الوطني الجلوكوز (12.6 ميكرومتر وأضاف بعد زعزعة الاستقرار الحويصلة) بدلا من بنك دبي الوطني-PC. وحوصر هذا الجزيء للذوبان في الماء داخل proteoliposomes مرة واحدة مغلقة الحويصلات، وبالتالي يجب أن تكون محمية من dithionite. لجعل دبي الوطني الجلوكوز متاحة تماما للتخفيض، تريتون X-100 يمكن إضافة (1٪ ث / ت) والذي ينتج بعد ذلك في الحد من 100٪ 3،27. يمكن وصفها في proteoliposomes للتحقق من أن إعادة تشكيل كل من الدهون والبروتين مراسل متماثل. ويتحقق السابق من خلال التجارب تبريد الارتطامية باستخدام أيونات يوديد بينما يستند الأخير على استراتيجية حماية البروتيني باستخدام AspN البروتيني الذيتخفيضات في موقع معين بالقرب من محطة سي من أوبسين 3. الانتقال من مضان الأولي (F ط) المحددة في فحص النشاط scramblase إلى مضان نقطة النهاية (F) معقد، ولكن لأغراضنا أنه يمكن أن يقترب إلى حد معقول من وظيفة الاضمحلال الأسي واحدة. ثابت الزمنية المرتبطة اضمحلال الأسي (20 ثانية) هو تقريبا نفس لالجسيمات الشحمية نشط وفعال، proteoliposomes التي تحتوي على أوبسين مشيرا إلى أن الهرولة كما يحدث بسرعة، أو أسرع من المعدل الذي يتم تقليل fluorophore دبي الوطني dithionite. وبالتالي فحص النشاط scramblase لديه قرار الوقت الفقراء (محدودة dithionite الكيمياء الحد) التي تسمح حاليا فقط تصنيف المسوخ إلى نشطة، بطيئة جدا أو غير نشطة. يمكن أن ينظر إلى هذا التصنيف لscramblase التنظيم الكالسيوم TMEM16 27: في ارتفاع الكالسيوم 2+ المستويات، كشف تسوس مضان وقت ثابت مماثل لثار ينظر في الجسيمات الشحمية خالية من البروتين، مشيرا إلى أن معدل الحد خطوة هو الحد الكيميائية من بنك دبي الوطني fluorophore التي كتبها dithionite من الدهون الهرولة. على العكس من ذلك، في انخفاض مستويات الكالسيوم 2+ لم يتم التوصل إلى حالة مستقرة للحد من الفلورسنت بعد 900 ثانية، مما يجعل من الممكن التمييز بين عنصرين الحركية، واحد المخصصة للحد من dithionite من النشرة الخارجية وأبطأ واحد إلى التعرض بنك دبي الوطني-الدهون الداخلية-النشرة إلى الخارج. التناقض بين توقع خسارة 100٪ من مضان على dithionite علاج الحويصلات أعدت مع ارتفاع طاعون المجترات الصغيرة (الشكل 1C) مقابل واقع التجربة حيث أنه من الصعب أن يتجاوز ~ تخفيض 85٪ (الشكل 3A) تشير إلى أن جزءا من الحويصلات هو صهر إلى إعادة. هذا جزء يمكن أن تتوافق مع حويصلات أن ختم في وقت مبكر أثناء إجراء إعادة كما كثف المنظفات إلى الخرز البوليسترين وهناكوبالتالي لم تعد قادرة على استقبال البروتين. لتحليل الموضحة في قسم 3، ونحن نفترض أن هذه الفئة من السكان الحرارية يتوافق مع جزء صغير و من مجموع الحويصلات. وإذا افترضنا أن نصف جزيئات دبي الوطني-PC (مجمع دبي الوطني-PC في النشرة الخارجي) في الحويصلات صهر يتوفر للdithionite الحد، ثم نقدر و = 2 • (1 - R ماكس / 100)، أو 0.35 عندما R الحد الأقصى = 82.5٪. تركيب ص (≥1 scramblase) مقابل طاعون المجترات الصغيرة * البيانات مع المعادلة أحادية الأسي يوفر α المستمر لائقا، والتي كان من الممكن لتحديد ما إذا أوبسين reconstitutes وظيفيا كما مونومر أو ديمر، أو خليط من الدول بما في ذلك multimers العليا . تفسير هذه النتائج تصبح معقدة إذا كان جزء من جزيئات أوبسين لا يمكن أن تعمل في الهرولة. في حين أن هذا يعطى من غير المرجح الظروف التي يتم تنقيته أوبسين التي تضمن أن يحتفظ كل من البروتين G ل، ويمكن أيضا أن تفسر الأنشطة مستقبلات قيمة α المقابلة لإدراج الوظيفي للdimers باسم الإدراج الوظيفي للأحادية من إعداد أوبسين حيث نصف البروتينات غير نشطة كما scramblases. نقطة إضافية للنظر هو أن التحليل أن نقدم يفترض أن الحويصلات تستخدم لإعادة متجانسة في الحجم. في الواقع، والحويصلات لديها مجموعة من أقطار تتميز توزيع جاوس مع انحراف معياري المقابلة إلى ما يقرب من ثلث متوسط ​​قطر. لحسن الحظ، ونتائج تحليل ص (≥1 scramblase) مقابل طاعون المجترات الصغيرة * البيانات لا تتأثر كثيرا النظر في عدم التجانس الحويصلة وبالتالي فإن تحليل بسيط هو أن قدمنا ​​ما يكفي لوصف البيانات. وجود قيود محتملة من الأساليب التي وصفنا هو أن الإجراء كثيفة العمل لا تسمح قياسات عالية الإنتاجية من عدد كبير جدا من العينات لالثانية أن عدم التجانس حويصلة قد تزعج قراءات. يمكن التغلب على المشكلة الأولى باستخدام تنسيق عيار مكروي لوحة للمقايسة scramblase. يمكن حل ثانيا في المستقبل من خلال فحوصات حويصلة واحدة باستخدام TIRF المجهري. فحص dithionite لقياس النشاط scramblase يمكن اعتبار موثوقة جدا وقوية بمجرد وضع إجراءات زعزعة الاستقرار وإعادة. نهج بديل لقياس النقل عبر الغشاء من الدهون الفوسفاتية، الذي يسمح أيضا التحقق من النتائج التي تم الحصول عليها من فحص dithionite، عاد استخراج قصيرة السلسلة دبي الوطني-الدهون من النشرة الخارجية للالحويصلات الدهنية باستخدام البقري الخالي من حمض مصل الزلال 22. العودة استخراج فضلا عن فحص dithionite كما تم توظيف لتوصيف وتحديد flippases من ATPases P4 من نوع والنقل ABC 28-33. كأدوات المعروضة هنا يمكن بسهولة أن تتكيف وفقا لاحالإقليم الشمالي يحتاج إلى إجراءات وصفها متعددة الاستعمالات، وسوف تساعد في تحديد وتوصيف scramblases فوسفورية في المستقبل. تعلم هوية العديد من هؤلاء، بما في ذلك من scramblase اللازمة للتوسع في الأغشية الاحيائية خلال نمو الخلايا هو من أهمية قصوى الفسيولوجية. للحصول على معلومات إضافية وصفا مفصلا لتحليل البيانات، ويشار إلى القراء المنشورات السابقة من مختبرنا 2-4،27 فضلا عن غيرهم 22،25،28،30.

رودوبسين مستقبلة للضوء، وهو نموذج أولي G البروتين يقترن مستقبلات (مراجعة على سبيل المثال، في اشارة 1)، هو أول scramblase فوسفورية الكشف عن هويته والتحقق منها كيميائيا 2،3. Scramblases هي النقل فوسفورية التي تزيد من بطء في جوهرها من transbilayer حركة فوسفورية على الناحية الفسيولوجية المستويات الملائمة في ثنائي الاتجاه، بطريقة ATP مستقلة 4-6. أمثلة من تصرفاتهم يمكن العثور عليها في الشبكة الإندوبلازمية وغشاء هيولي البكتيرية التي تحتاج إلى الهرولة التأسيسي للتوازن الغشاء والنمو، فضلا عن مجموعة متنوعة من مسارات بالغليكوزيل 5. فوسفورية ينظم الهرولة هناك حاجة لفضح فسفاتيديل (PS) على سطح الخلايا أفكارك حيث أنه بمثابة &quot;أكل لي&quot; -signal لالضامة 7 و يوفر سطح محفز التخثر على الصفائح الدموية تنشيط لتحفيز إنتاج بروتين عاملق اللازمة لتخثر الدم. في مبصرة الأغشية القرص، وقد اقترح النشاط الهرولة رودوبسين لمواجهة الخلل فوسفورية بين اثنين من منشورات غشاء من طبقة ثنائية التي يتم إنشاؤها من قبل لاعبي التنس المحترفين التي تعتمد، الدهن أحادي الاتجاه flippase ABCA4 4،8،9 10-12. وعلى الرغم من أهمية الفسيولوجية للscramblases، وظلت هويتهم بعيد المنال حتى أفيد رودوبسين باعتباره scramblase في أقراص مستقبلة للضوء 2، تم تحديد أعضاء الأسرة البروتين TMEM16 كما كا 2+ scramblases معتمد على الحاجة للتعرض PS في غشاء البلازما (مراجعة في إشارة 13)، واقترح البروتين البكتيري FtsW باعتباره الدهن الثاني scramblase المطلوبة لتخليق ببتيدوغليكان 14. واستندت هذه الاكتشافات على إعادة تشكيل تنقية البروتينات في الجسيمات الشحمية ومظاهرة من النشاط scramblase في proteoliposomes الناتجة باستخدام describ منهجيةإد هنا. scramblases إمكانات أخرى 15-21 - البروتينات MurJ وAMJ المتورطين في التركيب الحيوي ببتيدوغليكان، WzxE والبروتينات ذات الصلة المتورطين في الهرولة السلائف-O مستضد، البروتين منتدى مادهيسي اللازمة لنقل من phosphatidylglycerol aminoacylated عبر غشاء هيولي البكتيرية، وأفراد الأسرة Xkr8 أنه قد أقترح لفضح PS على سطح الخلايا أفكارك - لا يزال يتعين اختبار كيميائيا. هذا يسلط الضوء على أهمية فحص قوية لتحديد وتوصيف النشاط scramblase. هنا، نحن تصف إعادة تشكيل أوبسين النقي، وصميم بروتيني من رودوبسين مبصرة، إلى الحويصلات unilamellar كبيرة (LUVs)، وتحليل لاحقة من النشاط scramblase في proteoliposomes الناتجة باستخدام مقايسة على أساس مضان. وهناك العديد من البروتوكولات وصفها جيدا المتاحة في الأدب للتعبير مغاير وتنقية أوبسين، وبالتالي فإننا لن<html> وصف في هذا البروتوكول. نستخدم البروتوكولات المذكورة في غورين وآخرون. (3) الذي ينتج العلم الموسومة، أوبسين بالحرارة بنحو 100 نانوغرام / ميكرولتر في 0.1٪ (ث / ت) dodecylmaltoside (DDM). ويتحقق إعادة بواسطة علاج LUVs مع المنظفات كافية بحيث تنتفخ ولكن لا تذوب. في ظل هذه الظروف، وهو بروتين الغشاء - المتوفرة في شكل المذيلات البروتين المنظفات - والاندماج في الجسيمات الشحمية وتصبح أعاد في غشاء الحويصلية على إزالة المنظفات، مما أدى إلى proteoliposomes. لإعادة أوبسين (تم الحصول عليها من البروتين النقي في 0.1٪ (ث / ت) DDM)، يتم إعداد LUVs من خليط من POPC (1-بالميتويل-2-oleoyl- التعطيل -glycero-3-phosphocholine) وPOPG (1- بالميتويل-2-oleoyl- التعطيل -glycero-3- [الفوسفات-rac- (1-الجلسرين)]) ومشبعة DDM قبل إضافة أوبسين وبنك دبي الوطني-PC. ثم تتم إزالة المنظفات عن طريق التعامل مع عينة مع الخرز البوليسترين. <html> معشوقة = &quot;jove_content&quot;&gt; ويظهر المبدأ الأساس لفحص القائم على مضان في الشكل 1B. وأعيد LUVs بشكل متناظر مع كمية ضئيلة من بنك دبي الوطني-PC أو غيرها المسمى دبي الوطني، مراسل فوسفورية فلوري (الشكل 1A). على إضافة dithionite، يتم تخفيض على غشاء impermeant dianion، يتم تقديم جزيئات دبي الوطني-PC في النشرة الخارجية للLUVs غير الفلورسنت كما نيترو-مجموعة بنك دبي الوطني إلى الأمينية مجموعة غير الفلورسنت. كما لا الجزيئات دبي الوطني-PC ولا dithionite قادرة على اجتياز الغشاء على المدى الزمني للتجربة (&lt;10 دقيقة)، وهذا يؤدي إلى تخفيض 50٪ من إشارة الفلورسنت. ومع ذلك، إذا تم إعادة تشكيل الجسيمات الشحمية مع scramblase، جزيئات دبي الوطني-PC في النشرة الداخلية يمكن أن يتبارى بسرعة إلى الخارج حيث تقوم بتقليل. وهذا يؤدي إلى فقدان تام للمضان في حالة مثالية (الشكل 1C). وفاق / ftp_upload / 54635 / 54635fig1.jpg &quot;/&gt; . الشكل 1: تمثيل تخطيطي لفحص النشاط scramblase يستخدم فحص والمسمى دبي الوطني الفلورسنت مراسل الدهنية؛ ويرد دبي الوطني-PC (A). وأعيد الحويصلات unilamellar كبيرة مع كمية ضئيلة من بنك دبي الوطني-PC. إعادة تنتج الحويصلات متماثل، مع بنك دبي الوطني-PC موزعة بالتساوي في منشورات الخارجي والداخلي. Dithionite (S 2 O 4 2-) يقلل كيميائيا نيترو مجموعة بنك دبي الوطني إلى الأمينية مجموعة غير الفلورسنت. علاج الجسيمات الشحمية خالية من البروتين مع dithionite (ب، أعلى) يؤدي إلى تخفيض 50٪ من مضان فقط منذ جزيئات دبي الوطني-PC في النشرة الخارجي يتم تخفيض: تم شحن dithionite سلبا ولا يمكن عبور الغشاء لتتفاعل مع جزيئات دبي الوطني-PC في النشرة الداخلية. العلاج Dithionite من proteoliposomes التي تحتوي على أوبسين (B، أسفل)، أي proteoliposomes-scramblase نشط، والنتائج في فقدان 100٪ من وluorescence كما أوبسين يسهل حركة بنك دبي الوطني-PC بين الداخلية والنشرة الخارجية. (C) ويظهر آثار مضان المثالية الحصول على علاج الجسيمات الشحمية خالية من البروتين وproteoliposomes التي تحتوي على أوبسين مع dithionite. معدل فقدان مضان هو نفسه في الحالتين يشير إلى أن تخفيض الكيميائية دبي الوطني dithionite هو معدل الحد، والتي تسعى جاهدة يحدث بمعدل يساوي أو أكبر من معدل التفاعل الكيميائي. وتظهر آثار الحصول عليها من تجربة الفعلية في الشكل (3). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54635/54635fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> الطرق وصفنا يمكن استخدامها لإعادة بناء ومقايسة تنقية البروتينات الأخرى، فضلا عن خليط من البروتينات الغشاء تم الحصول عليها، على سبيل المثال، عن طريق استخراج microsomes ل مع المنظفات 22.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1148">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:683px;">1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td>
			<td style="width:141px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:132px;">850457C</td>
			<td style="width:193px;">POPC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840457C</td>
			<td>POPG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1-palmitoyl-2-{6-[7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]hexanoyl}-an-glycero-3-phosphocholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>810130C</td>
			<td>NBD-PC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>EM-5330</td>
			<td>HEPES</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653-1KG</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dodecyl-&#946;-d-maltoside&#160;</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310 5 GM</td>
			<td>DDM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorimeter cuvettes</td>
			<td>sigma</td>
			<td>C0918-100EA</td>
			<td>cuvettes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spectrofluorometer</td>
			<td colspan="2">Photon Technology International, Inc.</td>
			<td>fluorimeter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium hydrosulfite technical grade, 85%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>157953-5G</td>
			<td>dithionite</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GraphPad Prism 5 software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prism</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris Base</td>
			<td>VWR</td>
			<td>JTX171-3</td>
			<td>Tris</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LIPEX 10 mL extruder&#160;</td>
			<td>Northern Lipids, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Extruder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:683px;">Whatman, Drain disc, PE, 25 mm</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:132px;">28156-243</td>
			<td>Disc support</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:683px;">Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes, 0.4 &#181;m, 25 mm diameter</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:132px;">WHA110607</td>
			<td>400 nm membrane</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:683px;">Whatman Nucleopore Track-Etched Membranes, 0.2 &#181;m, 25 mm diameter</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:132px;">WHA110606</td>
			<td>200 nm membrane</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3264-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">VWR Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass, 13x100 mm</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>47729-572</td>
			<td>glass tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Perchloric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30755-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Molybdate Tetrahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-7302</td>
			<td>ammonium molybdate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">(+)-Sodium L-ascorbate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7631-25G</td>
			<td>sodium ascorbate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bio-Beads SM2 adsorbents</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1523920</td>
			<td>polystyrene beads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;2.0 mL Microtubes clear</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>10011-742</td>
			<td>Reconstitution tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reconstitution glass tube</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td style="width:132px;">53283-800</td>
			<td>Reconstitution glass tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zetasizer&#160;</td>
			<td>Malvern&#160;</td>
			<td></td>
			<td>DLS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a fluorescence-based assay of phospholipid scramblase activity

Scramblases نقل من الدهون الفوسفاتية عبر طبقة ثنائية الغشاء الاتجاهين بطريقة مستقلة اعبي التنس المحترفين. وscramblase الأولى أن يكون تحديد وكيميائيا التحقق وأوبسين، في صميم بروتيني من رودوبسين مبصرة. رودوبسين هو مستقبلات البروتين يقترن-G المحلية في قضيب مبصرة الأغشية القرص من شبكية العين حيث أنها مسؤولة عن إدراك الضوء. النشاط scramblase رودوبسين للا تعتمد على يجند لها 11- رابطة الدول المستقلة -retinal، أي أوبسين صميم بروتيني كما تنشط باعتباره scramblase. على الرغم من التأسيسية وينظم فوسفورية الهرولة تلعب دورا هاما في علم وظائف الأعضاء الخلية، تم التعرف على عدد قليل فقط scramblases فوسفورية حتى الآن إلى جانب أوبسين. نحن هنا وصف مقايسة على أساس مضان النشاط scramblase أوبسين ل. وأعيد أوبسين في الجسيمات الشحمية unilamellar كبيرة تتألف من فسفاتيديل، phosphatidylglycerol وكمية ضئيلة من الفلورسنت وصفت دبي الوطني PC (1-صalmitoyl-2- {6- [7-نيترو-2-1،3-benzoxadiazole-4-YL) الأمينية] hexanoyl} - SN -glycero-3-phosphocholine). يتم تحديد النشاط Scramblase من خلال قياس مدى جزيئات دبي الوطني-PC الموجود في النشرة الداخلية للحويصلة قادرة على الوصول إلى النشرة الخارجية حيث يتم التخلص مضان من كيميائيا من قبل وكيل الحد الذي لا يمكن عبور الغشاء. الطرق وصفنا لها تطبيق عموما، ويمكن استخدامها لتحديد وتوصيف الأنشطة scramblase للبروتينات غشاء الأخرى.

وصفنا إعادة تشكيل أوبسين إلى LUVs لوصف النشاط scramblase وذلك باستخدام مقايسة على أساس مضان. نحن تحليل النتائج لوضع الحد الأدنى لمعدل فوسفورية بوساطة أوبسين الهرولة ولتحديد حالة بلازميدة قليلة القسيمات التي أوبسين reconstitutes وظيفيا إلى الحويصلات. لتحديد شروط إعادة الأمثل، فإنه من الضروري تحديد تجريبيا كمية من المنظفات التي يجب أن تستخدم لتضخيم LUVs بحيث تكون تقبلا لإدخال البروتين. ويتضح مثل هذه التجربة في الشكل 2A. aliquots من POPC: يتم التعامل مع LUVs POPG مع كميات مختلفة من DDM لمدة 3 ساعة ويتم قياس الامتصاصية من العينة في 540 نانومتر، وهو مقياس لدرجة التعكر، وبالتالي من حجم الحويصلة. الكثافة البصرية تقاس في 540 نانومتر (OD 540) الرسم البياني يبين أن الحويصلات تنتفخ كما DDM concentrوزيادة أوجه 4-6 ملم، والوصول إلى نقطة التشبع في حوالي 7 مم قبل الشروع في إذابة (الموافق فقدان العكارة والتطوير التنظيمي 540 إشارة) كما يتم زيادة DDM أبعد من ذلك. يضاف دبي الوطني-PC بعد العلاج المنظفات والعينات يتم تحضين أبعد لمدة ساعة قبل أن يتم تعامل مع الخرز البوليسترين لإزالة المنظفات. يتم تحديد توزيع transbilayer بنك دبي الوطني-PC عن طريق قياس فقدان مضان بعد إضافة dithionite إلى الحويصلات (كما هو موضح أعلاه). وبالتالي، إدراج بنك دبي الوطني-PC في النشرة الخارجية الحويصلات في حالة عدم وجود المنظفات، وأشار الوصول التام لdithionite. لالحويصلات تعامل مع&gt; 2 مم DDM، غير قادرة على توزيع بشكل متناظر في كل من منشورات بحيث بمجرد إزالة DDM 50٪ من بنك دبي الوطني-PC محمي من dithionite دبي الوطني-PC. ويبين الشكل 2B تجربة-زعزعة الاستقرار إعادة مماثلة (إعادة رسم من المرجع 2 &lt;/ سوب&gt;)، وهذه المرة تتبع إعادة تشكيل أوبسين. في هذه التجربة أنها يمكن أن نرى أن هناك حاجة 7 ملي DDM لإعادة أوبسين بحيث دبي الوطني-PC يصبح كميا (&gt; 80٪) في متناول dithionite نتيجة بوساطة أوبسين الهرولة. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/54635/54635fig2.jpg" /> الشكل 2: إعادة إعماره دبي الوطني-PC وأوبسين إلى الحويصلات زعزعة المنظفات (A) يتم التعامل مع أجزاء مأخوذة من الحويصلات مع مجموعة من تركيزات المنظفات (0-9 ملم) عن طريق خلط نهاية الإفراط في نهاية مدة 3 ساعة في درجة حرارة الغرفة . في نهاية فترة الحضانة يتم قياس الامتصاصية من العينات في 540 نانومتر (خط أسود). ثم يضاف دبي الوطني-PC (المنحلة في 0.1٪ ث / ت DDM) وحضنت العينة ل1 ساعة إضافية في درجة حرارة الغرفة قبل إزالة المنظفات عن طريق العلاج الخرز البوليسترين. ويتم تحليل الجسيمات الشحمية الناجم عن ذلك فلور<html> فحص تخفيض escent (خط أحمر) لتحديد مدى تشكيلها دبي الوطني-PC متناظر. (ب) كما في (A)، ولكن في هذه التجربة الحويصلات تشكلت من الدهون الفوسفاتية البيض (بيضة PC / بيضة حمض الفسفاتيديك، 9: 1 مول / مول) وزعزعة استقرار مع DDM، وتمت إضافة أوبسين مع بنك دبي الوطني-PC، مما أدى إلى تخفيض مضان من حوالي 80٪ مرة واحدة وأعادت كفاءة البروتين وقادرة على تسهيل الهرولة بنك دبي الوطني-PC (معدلة من المرجع 2). على الرغم من أن دبي الوطني-PC أعيد بشكل متناظر في 2 مم DDM، وقد تم اختيار الظروف المثلى لإعادة تشكيل أوبسين حول ذروة OD 540 الامتصاصية، أي النقطة التي كانت حويصلات منتفخة للغاية بسبب المنظفات مقحم لكن لا بالفاعلات بعد (المشار إليها في سهم). لPOPC / POPG (9: 1 مول / مول) الحويصلات، تركيز DDM من 8 ملي وجدت لتكون الأمثل لكل من بنك دبي الوطني-PC وإعادة أوبسين./54635/54635fig2large.jpg &quot;الهدف =&quot; _ فارغة &quot;&gt; الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. مدى تخفيض مضان يزيد مع كمية من أوبسين تستخدم لإعادة. ويبين الشكل 3A آثار مضان الحصول على إضافة dithionite إلى دبي الوطني-PC-تحتوي على الجسيمات الشحمية خالية من البروتين (تتبع الأسود) وproteoliposomes تشكيلها مع أوبسين في بروتين مختلف لنسب فوسفورية (طاعون المجترات الصغيرة، في وحدات من البروتين ملغ لكل فوسفورية مليمول، آثار حمراء اللون)؛ تم تطبيع آثار بحيث أنهم جميعا لديهم نفس مضان الأولي (F ط) قيمة لتسهيل التصور. نوبات Monoexponential من آثار تشير ثوابت زمنية مماثلة جدا، تتراوح 20-25 ثانية؛ كما أن معدل الحد دبي الوطني-PC-بوساطة dithionite في الجسيمات الشحمية خالية من البروتين هو نفسه كما هو الحال في proteoliposomes، فمن الممكن فقط لوضع أقل تقدير على معدل بوساطة أوبسين الهرولة (انظر تكسر لمزيد من التفاصيل). ويبين الشكل 3B البيانات التي تم تحليلها تم الحصول عليها من المقايسات تخفيض مضان لانتاج قطع ص (≥1) scramblase (احتمال وجود حويصلة وجود scramblase واحد على الأقل) مقابل طاعون المجترات الصغيرة قياسها تجريبيا (المتعلقة طاعون المجترات الصغيرة * كما نوقش أعلاه). مقارنة بين صالح monoexponential من النتائج التجريبية في نوبات افتراضية الموافق أوبسين التي أعاد كما مونومر، ديمر أو tetramer تبين أن أوبسين reconstitutes وظيفيا باعتبارها ديمر. <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/54635/54635fig3.jpg" /> الرقم 3: النشاط Scramblase من أوبسين (A) الإسفار آثار الموافق dithionite علاج الحويصلات تشكيلها مع بنك دبي الوطني-PC وأوبسين مبالغ تتراوح بين 0 حتي 4،95 ميكروغرام، التي أشار إليها إسفين. أقل مبلغ من أوبسين أعيد يتوافق مع طاعون المجترات الصغيرة من 0.21 ملغ / مليمول، وثاني أعلى مبلغ 0.43 ملغ / مليمول وأعلى مبلغ 1.3 ملغ / مليمول، أو 10 opsins في حويصلة في المتوسط. وأضاف Dithionite في الوقت المشار إليه (السهم) وتم رصد دبي الوطني مضان عن 400 ثانية أخرى. وكان الحد الأقصى للحد من مضان ينظر في هذه التجربة 85٪ في حين أن المتوسط ​​على مدى العديد من التجارب هو 82.5٪. (ب) اعتماد البروتين من الهرولة. وقد تم تحليل بيانات من تجارب مماثلة إلى لوحة وباستخدام إحصاءات بواسون لإنشاء رسم بياني لاحتمال وجود حويصلات scramblase واحد على الأقل (ع ≥1 scramblase) مقابل البروتين إلى نسبة فوسفورية (PPR) من الحويصلات (كان كميا البروتين مرحلة ما بعد تم تحديد إعادة بواسطة تحليل البقعة الغربية 3 و فوسفورية خلال قياس الفوسفات غير العضوية صدر عند التحلل الحمضي). ويمثل الخط الأحمر نوبة أحادية الأسي للبيانات. خطوط رمادية متقطع تمثل يناسب أحادية الأسي لإعادة تشكيل أوبسين إلى 170 نانومتر القطر الخامسesicles كما أحادية، dimers شكلت قبل أو tetramers شكلت مسبقا. كما يمثل محور س وطاعون المجترات الصغيرة قياسها تجريبيا (بدلا من طاعون المجترات الصغيرة * (انظر النص الرئيسي))، والثوابت تناسب تتوافق مع طاعون المجترات الصغيرة بدلا من طاعون المجترات الصغيرة * القيم، كما هو مبين في النص الرئيسي. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54635/54635fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity at JoVE.com

A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

We describe a fluorescence-based assay to measure phospholipid scrambling in large unilamellar liposomes reconstituted with opsin.

فحص مضان القائم من الفوسفوليبيدية Scramblase آخر

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and ...

a-fluorescence-based-assay-of-phospholipid-scramblase-activity

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

13.8K Views.  Weill Cornell Medical College. We describe a fluorescence-based assay to measure phospholipid scrambling in large unilamellar liposomes reconstituted with opsin. 

Video: A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many of these conditions cause protein unfolding in the cell and have detrimental impact on the survival of the organism. A group of unrelated, stress-specific molecular chaperones have been shown to play essential roles in the survival of these stress conditions. While fully folded and chaperone-inactive before stress, these proteins rapidly unfold and become chaperone-active under specific stress conditions. Once activated, these conditionally disordered chaperones bind to a large number of different aggregation-prone proteins, prevent their aggregation and either directly or indirectly facilitate protein refolding upon return to non-stress conditions. The primary approach for gaining a more detailed understanding about the mechanism of their activation and client recognition involves the purification and subsequent characterization of these proteins using in vitro chaperone assays. Follow-up in vivo stress assays are absolutely essential to independently confirm the obtained in vitro results.
This protocol describes in vitro and in vivo methods to characterize the chaperone activity of E. coli HdeB, an acid-activated chaperone. Light scattering measurements were used as a convenient read-out for HdeB&#39;s capacity to prevent acid-induced aggregation of an established model client protein, MDH, in vitro. Analytical ultracentrifugation experiments were applied to reveal complex formation between HdeB and its client protein LDH, to shed light into the fate of client proteins upon their return to non-stress conditions. Enzymatic activity assays of the client proteins were conducted to monitor the effects of HdeB on pH-induced client inactivation and reactivation. Finally, survival studies were used to monitor the influence of HdeB&#39;s chaperone function in vivo.

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

This study describes biophysical, biochemical and molecular techniques to characterize the chaperone activity of Escherichia coli HdeB under acidic pH conditions. These methods have been successfully applied for other acid-protective chaperones such as HdeA and can be modified to work for other chaperones and stress conditions.

الكشف عن تعتمد على درجة الحموضة آخر من<em&gt; كولاي</em&gt; الوصيفة HdeB<em&gt; في المختبر</em&gt; و<em&gt; في فيفو</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some S100 proteins have the capacity to bind transition metals with high affinity and effectively sequester them away from invading microbial pathogens in a process that is termed "nutritional immunity". S100A12 (EN-RAGE) binds both zinc and copper and is highly abundant in innate immune cells such as macrophages and neutrophils. We report a refined method for the expression, enrichment and purification of S100A12 in its active, metal-binding configuration. Utilization of this protein in bacterial growth and viability analyses reveals that S100A12 has antimicrobial activity against the bacterial pathogen, Helicobacter pylori. The antimicrobial activity is predicated on the zinc-binding activity of S100A12, which chelates nutrient zinc, thereby starving H. pylori which requires zinc for growth and proliferation.

Here, we present a method to express and purify S100A12 (calgranulin C). We describe a protocol to measure its antimicrobial activity against the human pathogen H. pylori.

التعبير، تنقية، ومضادات الميكروبات النشاط من S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ metabolic activity assays can provide information about the spatial distribution of metabolic activity within a tissue. We provide here a detailed protocol for monitoring the activity of the enzyme lactate dehydrogenase directly in tissue samples. Lactate dehydrogenase is an important determinant of whether consumed glucose will be converted to energy via aerobic or anaerobic glycolysis. A solution containing lactate and NAD is provided to a frozen tissue section. Cells with high lactate dehydrogenase activity will convert the provided lactate to pyruvate, while simultaneously converting provided nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) to NADH and a proton, which can be detected based on the reduction of nitrotetrazolium blue to formazan, which is visualized as a blue precipitate. We describe a detailed protocol for monitoring lactate dehydrogenase activity in mouse skin. Applying this protocol, we found that lactate dehydrogenase activity is high in the quiescent hair follicle stem cells within the skin. Applying the protocol to cultured mouse embryonic stem cells revealed higher staining in cultured embryonic stem cells than mouse embryonic fibroblasts. Analysis of freshly isolated mouse aorta revealed staining in smooth muscle cells perpendicular to the aorta. The methodology provided can be used to spatially map the activity of enzymes that generate a proton in frozen or fresh tissue.

We describe a protocol for mapping the spatial distribution of enzymatic activity for enzymes that generate nicotinatmide adenine dinucleotide phosphate (NAD(P)H) + H+ directly in tissue samples.

رسم الخرائط الأيض: رصد النشاط نازعة لاكتات مباشرة في الأنسجة

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ ...

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved N6-isopentenyladenosine modifications occurs at the A37 position in a subset of tRNAs. This modification improves translation efficiency and fidelity by increasing the affinity of the tRNA for the ribosome. Mutation of enzymes responsible for this modification in eukaryotes are associated with several disease states, including mitochondrial dysfunction and cancer. Therefore, understanding the substrate specificity and biochemical activities of these enzymes is important for understanding of normal and pathologic eukaryotic biology. A diverse array of methods has been employed to characterize i6A modifications. Herein is described a direct approach for the detection of isopentenylation by Mod5. This method utilizes incubation of RNAs with a recombinant isopentenyl transferase, followed by RNase T1 digestion, and 1-dimensional gel electrophoresis analysis to detect i6A modifications. In addition, the potential adaptability of this protocol to characterize other RNA-modifying enzymes is discussed.

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Here, we describe a protocol for the biochemical characterization of the yeast RNA-modifying enzyme, Mod5, and discuss how this protocol could be applied to other RNA-modifying enzymes.

تحليل في المختبر للكشف عن النشاط ترانسفيراز إيسوبينتينيل الحمض الريبي النووي النقال

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic properties of the absorbed/immobilized mass on sensor surfaces, allowing the measurements of the interaction of proteins with solid-supported surfaces, such as lipid bilayers, in real-time and with a high sensitivity. Annexins are a highly conserved group of phospholipid-binding proteins that interact reversibly with the negatively charged headgroups via the coordination of calcium ions. Here, we describe a protocol that was employed to quantitatively analyze the binding of annexin A2 (AnxA2) to planar lipid bilayers prepared on the surface of a quartz sensor. This protocol is optimized to obtain robust and reproducible data and includes a detailed step-by-step description. The method can be applied to other membrane-binding proteins and bilayer compositions.

Here, we present an experimental protocol that can be employed to determine the binding affinities and mode of interaction of label-free phospholipid-binding protein annexin A2 with immobilized solid-supported bilayers (SLB) by simultaneously measuring the mass uptake and the viscoelastic properties of the protein annexin A2.

ميكروجرافيميتري المسرف لدراسة ديناميات ملزمة فسفوليبيد ملزمة البروتين أنيكسين A2 إلى بليرس الدهن الصلب-يؤيد استخدام جهاز رنان مرو

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released from many cell types and play a pivotal role in regulating cell-cell communication and a diverse range of biological processes. Many different methods for the characterization of EVs have been described. However, most of these methods have the disadvantage that the preparation and characterization of the samples are very time-consuming, or it is extremely difficult to analyze specific markers of interest due to their small size and due to the lack of discrete populations. While methods for analysis of EVs have been considerably improved over the last decade, there is still no standardized method for characterization of single EVs. Here, we demonstrate a semi-automated method for characterization of single EVs by fluorescence-based nanoparticle-tracking analysis. The protocol that is presented addresses the common problem of many researchers in this field and provides the complete workflow for rapid isolation of EVs and characterization with PKH67, a general cell membrane linker, as well as with specific surface markers such as CD63, CD9, vimentin, and lysosomal-associated membrane protein 1 (LAMP-1). The presented results show a high level of reproducibility, as confirmed by other methods, such as Western blotting. In the conducted experiments, we exclusively used EVs isolated from human serum samples, but this method is also suitable for plasma or other body fluids and can be adjusted for characterization of EVs from cell culture supernatants. Irrespective of the future progress of research on EV biology, the protocol that is presented here provides a rapid and reliable method for rapid characterization of single EVs with specific markers.

In this protocol, we describe the complete workflow for rapid isolation of extracellular vesicles from human whole blood and characterization of specific markers by fluorescence-based nanoparticle-tracking analysis. The presented results show a high level of reproducibility and can be adjusted to cell culture supernatants.

توصيف واحد حويصلات خارج الخلية في الدم البشري مع تحليل تتبع نانوحبيبات المستندة إلى الأسفار السريع

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often viruses exhibit cell and tissue tropism and are adapted to specific cell or tissue proteases. Moreover, these viruses can introduce mutations or insertions into their genome during replication that may affect the cleavage, and thus can contribute to adaptations to a new host. Here, we present a fluorogenic peptide cleavage assay that allows a rapid screening of peptides mimicking the cleavage site of viral fusion proteins. The technique is very flexible and can be used to investigate the proteolytic activity of a single protease on many different substrates, and in addition, it also allows exploration of the activity of multiple proteases on one or more peptide substrates. In this study, we used peptides mimicking the cleavage site motifs of the coronavirus spike protein. We tested human and camel derived Middle East Respiratory Syndrome coronaviruses (MERS-CoV) to demonstrate that single and double substitutions in the cleavage site can alter the activity of furin and dramatically change cleavage efficiency. We also used this method in combination with bioinformatics to test furin cleavage activity of feline coronavirus spike proteins from different serotypes and strains. This peptide-based method is less labor- and time intensive than conventional methods used for the analysis of proteolytic activity for viruses, and results can be obtained within a single day.

We present a fluorogenic peptide cleavage assay that allows a rapid screening of the proteolytic activity of proteases on peptides representing the cleavage site of viral fusion peptides. This method can also be used on any other amino acid motif within a protein sequence to test for the protease activity.

"مقايسة الانقسام الببتيد فلوروجينيك" على الشاشة "النشاط بروتيوليتيك": تطبيقات للفيروس التاجي المسبّب لارتفاع البروتين التنشيط

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often ...

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

Mitochondria play the most prominent roles in cellular metabolism by producing ATP through oxidative phosphorylation and regulating a variety of physiological processes. Mitochondrial dysfunction is a primary cause of a number of metabolic and neurodegenerative diseases. Intact mitochondria are critical for their proper functioning. The enzyme citrate synthase is localized in the mitochondrial matrix and thus can be used as a quantitative enzyme marker of intact mitochondrial mass. Given that many molecules and pathways that have important functions in mitochondria are highly conserved between humans and Drosophila, and that an array of powerful genetic tools are available in Drosophila, Drosophila serves as a good model system for studying mitochondrial function. Here, we present a protocol for fast and simple measurement of citrate synthase activity in tissue homogenate from adult flies without isolating mitochondria. This protocol is also suitable for measuring citrate synthase activity in larvae, cultured cells, and mammalian tissues.

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

We present a protocol for a colorimetric assay of citrate synthase activity for quantification of intact mitochondrial mass in Drosophila tissue homogenates.

الفحص اللوني لنشاط سينثاز السيترات في دروفيميلا ميلنوغاستر

Mitochondria play the most prominent roles in cellular metabolism by producing ATP through oxidative phosphorylation and regulating a variety of ...

Single-Step Enrichment of a TAP-Tagged Histone Deacetylase of the Filamentous Fungus Aspergillus nidulans for Enzymatic Activity Assay

Class 1 histone deacetylases (HDACs) like RpdA have gained importance as potential targets for treatment of fungal infections and for genome mining of fungal secondary metabolites. Inhibitor screening, however, requires purified enzyme activities. Since class 1 deacetylases exert their function as multiprotein complexes, they are usually not active when expressed as single polypeptides in bacteria. Therefore, endogenous complexes need to be isolated, which, when conventional techniques like ion exchange and size exclusion chromatography are applied, is laborious and time consuming. Tandem affinity purification has been developed as a tool to enrich multiprotein complexes from cells and thus turned out to be ideal for the isolation of endogenous enzymes. Here we provide a detailed protocol for the single-step enrichment of active RpdA complexes via the first purification step of C-terminally TAP-tagged RpdA from Aspergillus nidulans. The purified complexes may then be used for the subsequent inhibitor screening applying a deacetylase assay. The protein enrichment together with the enzymatic activity assay can be completed within two days.

Single-Step Enrichment of a TAP-Tagged Histone Deacetylase of the Filamentous Fungus Aspergillus nidulans for Enzymatic Activity Assay

Class 1 histone deacetylases (HDACs) like RpdA have gained importance as potential targets to treat fungal infections. Here we present a protocol for the specific enrichment of TAP-tagged RpdA combined with an HDAC activity assay that allows in vitro efficacy testing of histone deacetylase inhibitors.

واحد خطوه إثراء من الحنفية الموسومة histone deاسيتيل من الفطريات الخيطية الرشاشيات معشش لفحص النشاط الانزيمي

Class 1 histone deacetylases (HDACs) like RpdA have gained importance as potential targets for treatment of fungal infections and for genome mining of ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. Nucleases display a variety of vital physiological roles in prokaryotic and eukaryotic organisms, ranging from maintaining genome stability to providing protection against pathogens. Altered nuclease activity has been associated with several pathological conditions including bacterial infections and cancer. To this end, nuclease activity has shown great potential to be exploited as a specific biomarker. However, a robust and reproducible screening method based on this activity remains highly desirable.
Herein, we introduce a method that enables screening for nuclease activity using nucleic acid probes as substrates, with the scope of differentiating between pathological and healthy conditions. This method offers the possibility of designing new probe libraries, with increasing specificity, in an iterative manner. Thus, multiple rounds of screening are necessary to refine the probes&#39; design with enhanced features, taking advantage of the availability of chemically modified nucleic acids. The considerable potential of the proposed technology lies in its flexibility, high reproducibility, and versatility for the screening of nuclease activity associated with disease conditions. It is expected that this technology will allow the development of promising diagnostic tools with a great potential in the clinic.

Altered nuclease activity has been associated with different human conditions, underlying its potential as a biomarker. The modular and easy to implement screening methodology presented in this paper allows the selection of specific nucleic acid probes for harnessing nuclease activity as a biomarker of disease.

الفحص الحركي للنشاط النواسي باستخدام مجسات الحمض النووي

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...