يوفر هذا البروتوكول بديلاً قوياً لفحص نشاط النوى كعلامة بيولوجية للمرض، مع منهجية سهلة التنفيذ حتى بالنسبة للباحثين الذين ليسوا متخصصين في مسابير الحمض النووي. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي القدرة على اختيار مسابير الحمض النووي التي يمكن أن تحدد كلا من الأنشطة النوى المعروفة وغير المعروفة، والاستفادة من التفاعل الديناميكي مسبار نوكلياز. ومن المزايا الأخرى لهذه المنهجية مرونتها، وإمكانية استنساخها العالية وسهولة استخدامها.
سيتم تنفيذ العرض من قبل خديجة، طالبة الماجستير، وباريس، وهو ما بعد الدكتوراه من مختبرنا. عند تصميم مكتبة oligonucleotide، وتشمل ما لا يقل عن واحد DNA واحد وNA واحدة تسلسل عشوائي يحتوي على مزيج من الأدينين، جوانين، السيتوسين والثيامين أو أوراسيل. لإعداد تحقيقات القلة، تدور أسفل تحقيقات أوليجنوكليوتيد الlyophilized وتمييع كل مسبار في مخزن Tris-EDTA في تركيز 500 picomolar لكل ميكرولتر لمنع تدهور النوى.
للثقافة البكتيرية على المتوسطة الصلبة، لفة حبة زجاجية واحدة مسامية من التخزين المبرد مباشرة على طبق ثقافة واحد يحتوي على TSA تكملها دم الأغنام المتبلورة إلى خط من المستعمرات البكتيرية الفردية. ثم ضع اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. بالنسبة للثقافة البكتيرية في الوسط السائل، قم بنقل مستعمرة واحدة من ثقافة متوسطة صلبة إلى 50 ملليلتر من TSB للحضانة بمعدل 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة بمعدل 200 دوران في الدقيقة.
في اليوم التالي ، تمييع الثقافة بنسبة 1 إلى 500 في TSB الطازجة واحتضان البكتيريا لمدة 24 ساعة إضافية عند 37 درجة مئوية و 200 دوران في الدقيقة في حاضنة تهتز. لإعداد فحص نشاط نووي ، أولاً قبل تسخين جهاز قياس الفلور إلى 37 درجة مئوية وإضافة 96 ميكرولترات من TSB العقيمة أو السوبر من ثقافة السالمونيلا أو E.Coli السائلة المتوسطة إلى أنبوب واحد 1.5 ملليلتر خالية من النيوكلاز في أنبوب ميكروسنتريفوج لكل مسبار. إضافة أربعة ميكروليترس من حل عمل التحقيق لكل أنبوب واستخدام ماصة لخلط محتويات كل أنبوب بدقة حتى يتم تحقيق حلول متجانسة، مع الحرص على تجنب فقاعات.
المقبل، بعناية تحميل 95 ميكرولترات من كل حل على مقربة من جدار الآبار الفردية من أسفل أسود، غير المعالجة 96 جيدا لوحة، مع الحرص على تجنب فقاعات. عندما يتم إضافة جميع الحلول، قم بتغطية اللوحة وفحص الغطاء بصريًا بحثاً عن علامات القلم أو الغبار الذي قد يقدم نتائج القياس. لإعداد البرنامج لقياس نشاط النوى، افتح برنامج اقتناء مناسب.
حدد القراءة الآن من نافذة إدارة المهام، وحدد جديد لإنشاء بروتوكول القياس الحركي. انقر على تعيين درجة الحرارة لتحديد 37 درجة مئوية وتأكيد وحفظ الإعدادات بالنقر فوق موافق. انقر فوق بدء الحركية. في النافذة المنبثقة، حدد ساعتين في مربع إدخال وقت التشغيل ودقيقتين في مربع الإدخال الفاصل الزمني قبل النقر فوق موافق لتأكيد الإعدادات وحفظها.
انقر فوق قراءة. في النافذة المنبثقة، حدد كثافة الفلوريسينكين كأسلوب الكشف، نقطة النهاية الحركية كنوع القراءة والفلاتر كنوع البصريات. ثم انقر فوق موافق. في النافذة المنبثقة، حدد الأخضر من "مجموعة التصفية" وانقر فوق موافق. في النافذة الإجراء، حدد استخدام غطاء وانقر فوق التحقق من الصحة.
سيظهر إطار منبثق يؤكد صحة البروتوكول الذي تم إنشاؤه. ضمن القائمة بروتوكول ، حدد الإجراء. في إطار الإجراء، حدد الآبار التي سيتم قياسها وأدخل اسم التجربة في المربع إدخال اسم الملف.
ثم قم بتحميل اللوحة في قارئ اللوحة ، مع الحرص على أن اللوحة في الاتجاه الصحيح وانقر على الزر اقرأ جديد لبدء الاستحواذ. لتحليل البيانات، افتح البيانات في برنامج التحليل المناسب، وحدد أحد الآبار المقاسة في اللوحة النافذة الواحدة. انقر فوق تحديد Wells وتضمين كل الآبار المقاسة في إطار حوار اختيار البئر قبل النقر فوق موافق. ثم حدد البيانات في إطار واحد لوحة لتصور النتائج الجدولة وانقر QuickExport لتصدير البيانات إلى جدول بيانات.
في جدول بيانات، قم بتسمية أعمدة البيانات على أنها مناسبة لكل عينة و probe، و قم برسم وحدات الفلورسينت النسبية مقابل الوقت للبيانات لإنشاء رسومات بيانية حركية. في هذه التجربة التمثيلية ، بعد الجولة الأولى من الفحص ، أبلغ عظمى ثقافة السالمونيلا عن تفضيل واضح لمسبار الحمض النووي الريبي على مسابير الحمض النووي. استنادا إلى تحديد الحمض النووي الريبي كنوع الحمض النووي المفضل من قبل نوكيلا السالمونيلا، تم تصميم مكتبة RNA فقط جديدة لاستخدامها في الجولة الثانية من الفحص.
وعلى النقيض من ذلك، أظهر E.Coli في الضوابط المتوسطة الثقافة قدرة محدودة للغاية على تدهور تحقيقات الحمض النووي الريبي. بعد جولة ثانية من الفحص باستخدام النيوكليوتيدات المعدلة كيميائيا تهدف إلى زيادة خصوصية تحقيقات RNA، يمكن تحديد RNA بيريميدين 2'O-ميثيل وRNA البيورين 2'O-الميثيل على أساس تعديلاتها الكيميائية كما تظهر أفضل أداء السلوك الحركي بالمقارنة مع البيريمدين RNA 2'fluoro وRNA بورين 2 fluoro على التوالي. وتشير هذه النتائج إلى أن السالمونيلا لديها نشاط RNAse الهامة مع تفضيل الكيمياء الركيزة التفاضلية التي يمكن استخدامها لاختيار تحقيقات قادرة على الاعتراف تحديدا هذه البكتيريا.
هذا الإجراء يتيح اختيار المسابير التي هي قادرة على تحديد النوى الأنشطة المرتبطة بأمراض الظروف، مثل السرطان أو العدوى البكتيرية، مما يسمح لتطوير أدوات التشخيص السريرية الجديدة.
