This work is supported by the V Foundation Scholar (AGF) and the MPN Research Foundation (AGF).

<ol>
	<li>Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+chronic+myelogenous+leukemia+in+mice+by+the+P210bcr/abl+gene+of+the+Philadelphia+chromosome.">Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome.</a> Science(New York, N.Y.). 247 (4944), 824-830 (1990).</li><li>Wernig, G., Mercher, T., Okabe, R., Levine, R. L., Lee, B. H., Gilliland, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Jak2V617F+causes+a+polycythemia+vera-like+disease+with+associated+myelofibrosis+in+a+murine+bone+marrow+transplant+model.">Expression of Jak2V617F causes a polycythemia vera-like disease with associated myelofibrosis in a murine bone marrow transplant model.</a> Blood. 107 (11), 4274-4281 (2006).</li><li>Lacout, C., Pisani, D. F., Tulliez, M., Gachelin, F. M., Vainchenker, W., Villeval, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAK2V617F+expression+in+murine+hematopoietic+cells+leads+to+MPD+mimicking+human+PV+with+secondary+myelofibrosis.">JAK2V617F expression in murine hematopoietic cells leads to MPD mimicking human PV with secondary myelofibrosis.</a> Blood. 108 (5), 1652-1660 (2006).</li><li>Zaleskas, V. M., Krause, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathogenesis+and+therapy+of+polycythemia+induced+in+mice+by+JAK2+V617F.">Molecular pathogenesis and therapy of polycythemia induced in mice by JAK2 V617F.</a> PloS One. 1, e18 (2006).</li><li>Bumm, T. G. P., Elsea, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+murine+JAK2V617F-positive+myeloproliferative+disease.">Characterization of murine JAK2V617F-positive myeloproliferative disease.</a> Cancer Res. 66 (23), 11156-11165 (2006).</li><li>Marty, C., Pecquet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Calreticulin mutants in mice induce an MPL-dependent thrombocytosis with frequent progression to myelofibrosis. , (2015).</li><li>Klampfl, T., Gisslinger, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+mutations+of+calreticulin+in+myeloproliferative+neoplasms.">Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms.</a> N. Engl. J. Med. 369 (25), 2379-2390 (2013).</li><li>Araki, M., Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+thrombopoietin+receptor+by+mutant+calreticulin+in+CALR-mutant+myeloproliferative+neoplasms.">Activation of the thrombopoietin receptor by mutant calreticulin in CALR-mutant myeloproliferative neoplasms.</a> Blood. , (2016).</li><li>Lim&#243;n, A., Briones, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Titer+Retroviral+Vectors+Containing+the+Enhanced+Green+Fluorescent+Protein+Gene+for+Efficient+Expression+in+Hematopoietic+Cells.">High-Titer Retroviral Vectors Containing the Enhanced Green Fluorescent Protein Gene for Efficient Expression in Hematopoietic Cells.</a> Blood. 90 (9), 3316-3321 (1997).</li><li>Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+bone+marrow+transplantation+(BMT):+providing+optimal+veterinary+and+husbandry+care+to+irradiated+mice+in+BMT+studies.">Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies.</a> J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 48 (1), 11-22 (2009).</li><li>Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Replication-Defective+Retrovirus+by+Transient+Transfection+of+293T+cells.">Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells.</a> J. Vis. Exp. (10), (2007).</li><li>Challen, G. A., Boles, N., Lin, K. K., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Hematopoietic+Stem+Cell+Identification+And+Analysis.">Mouse Hematopoietic Stem Cell Identification And Analysis.</a> Cytometry A. 75 (1), 14-24 (2009).</li><li>Ergen, A. V., Jeong, M., Lin, K. K., Challen, G. A., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+mouse+side+population+cells.">Isolation and characterization of mouse side population cells.</a> Methods Mol. Bio. (Clifton, N.J.). 946, 151-162 (2013).</li><li>Weksberg, D. C., Chambers, S. M., Boles, N. C., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD150-+side+population+cells+represent+a+functionally+distinct+population+of+long-term+hematopoietic+stem+cells.">CD150- side population cells represent a functionally distinct population of long-term hematopoietic stem cells.</a> Blood. 111 (4), 2444-2451 (2008).</li><li>Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLAM+family+markers+resolve+functionally+distinct+subpopulations+of+hematopoietic+stem+cells+and+multipotent+progenitors.">SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors.</a> Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).</li><li>Li, J., Kent, D. G., Chen, E., Green, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+myeloproliferative+neoplasms:+JAK+of+all+grades.">Mouse models of myeloproliferative neoplasms: JAK of all grades.</a> Dis. Model. Mech. 4 (3), 311-317 (2011).</li><li>Mullally, A., Lane, S. W., Brumme, K., Ebert, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloproliferative+neoplasm+animal+models.">Myeloproliferative neoplasm animal models.</a> Hematol. Oncol. Clin. North Am. 26 (5), 1065-1081 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

يوفر هذا البروتوكول وصفا مفصلا لكيفية إجراء عمليات زرع نخاع العظام في الفئران أن ألخص مرض الضرورية مثل كثرة الصفيحات مع التقدم إلى تليف النقي مع CALRdel52 طفرة باعتباره المحرك من المرض. زراعة ناجحة من الخلايا معربا عن النتائج CALRdel52 في زيادة الصفائح الدموية، وتوسيع الخلايا السوية العرطلة، وتليف نخاع العظام. كما زرع نخاع العظام هي عملية متعددة الخطوات، من المهم أن نعترف الخطوات التي يمكن تجنبها خطأ فني لمنع engraftment الفقراء من الخلايا معربا عن الجينات في المصالح أو حتى الموت الماوس. وثمة عامل حاسم لنموذج التنبيغ الزرع الناجحة التي غالبا ما يتم تجاهله هو نوعية الفيروس. فيروس مع التتر عالية يسهل كفاءة ترنسدوكأيشن جيدة، وبالتالي أساسا قويا لمرض، في حين باستخدام فيروس المرتبطة عيار منخفضة سيؤدي إلى عدد أقل من الخلايا معربا عن الجينات في المصالح. effici تنبيغency يمكن أن تتعزز الكواشف أن زيادة الاتصالات بين الفيروس والخلايا مثل polybrene وretronectin. ومن المعروف تنبيغ HSCs من الصعب حتى مع وجود تركيزات عالية من الفيروس، الارتجاعي ecotropic فقط يصيب تقسيم الخلايا. والغرض من وسائل الإعلام &quot;قبل STIM&quot; (التي تحتوي على SCF، IL-3، وIL-6) هو للحث على ركوب الدراجات من HSCs هادئة. ويمكن استخدام نظام lentiviral كنهج بديل إذا إصابة الخلايا غير تقسيم أمرا ضروريا. ومن العوامل الأخرى التي يمكن أن يكون لها تأثير على جيل الفيروس هو نوع من كاشف ترنسفكأيشن المستخدمة. وينبغي أن تحدد الكواشف ترنسفكأيشن الأمثل تجريبيا كما لوحظت اختلافات ملحوظة في سمية خلية بين المجموعات البحثية. وقد أدى الكاشف ترنسفكأيشن المستخدمة هنا في المحصول الفيروسي جيدة مع سمية الخلايا منخفضة. وتشمل الكواشف ترنسفكأيشن المشتركة الأخرى فوسفات الكالسيوم 11 و nonliposomal كاشف ترنسفكأيشن مثل Fugene. يستخدم هذا البروتوكول البلازميد كماناقلات التعبئة والتغليف مع trophisms الأنسجة محددة للماوس والفئران. إذا النظر في النماذج الحيوانية الأخرى لالتنبيغ الزرع، وناقلات التعبئة والتغليف الأخرى مع trophisms أوسع ويمكن أيضا أن تستخدم لتوليد amphotrophic (الجرذان والفئران والبشرية) أو pantrophic (trophisms نطاق واسع) الارتجاعي. ميزة إضافية لنخاع العظم نموذج التنبيغ الزرع هو القدرة التحقيق الميزة التنافسية لاثنين من السكان المانحة مختلف أو التعبير عن جينات متعددة من الفائدة في وقت واحد باستخدام علامات فريدة من نوعها لتعيين كل السكان من الاهتمام. إجراء عمليات زراعة الأعضاء غالبا ما تستخدم مسانج C57BL / 6 الفئران لتعقب الخلايا المانحة وراء استخدام علامة GFP متكاملة. لأن مسانج C57BL / 6 الفئران يمكن أن تعبر عن علامات الكريات البيض إما CD45.1 أو CD45.2، ويمكن الحصول على الخلايا المانحة من خلفية واحدة وزرع في الآخر. وعلاوة على ذلك، سلالة F1 الهجين يمكن أن تتولد لإنتاج ذرية التعبير عن كل CD45.1 وCD45.2علامات. بدلا من ذلك، ناقلات فيروسات MSCV متاح مع العديد من علامات مختلفة، بما في ذلك unicistronic (على سبيل المثال، FLAG HA) أو bicistronic (على سبيل المثال، GFP، طلب تقديم العروض، YFP، mCherry، hCD4) يبني. ويمكن استخدام هذه التركيبات بشكل متزامن في زرع تنافسية لتمكين التمييز بين السكان المانحة ويمكن أن تكون مفيدة بشكل خاص في الحالات التي يكون فيها التمايز عن طريق التعبير CD45.1 / CD45.2 غير متوفرة، مثل / ج الماوس سلالة BALB. ميزة أخرى لالتنبيغ الزرع هي القدرة على معرفة مدى مساهمة أنواع معينة من الخلايا لبدء المرض. بينما يصف هذا البروتوكول فقط تنبيغ-زرع نخاع العظم كله، قد تصاميم تجريبية أخرى يستلزم تخصيب أو العزلة من المقصورات شهادة الثانوية العامة المختلفة. في هذه الحالات، فإن عدد الخلايا المانحة تختلف وفقا لعدد السكان المانحة المحددة المستخدمة. بالإضافة إلى ذلك، فإن الخلايا الإنقاذ من متبرع السذاجة ينبغيأن تستخدم كمكمل لدعم الماوس حتى شهادة الثانوية العامة engraftment والتوسع يمكن أن يحدث. ويبين الجدول 2 عدد الموصى بها من الخلايا المانحة للزرع من مختلف نخاع العظام المقصورات 12-15. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> # من خلايا / زرع مستلم </td><td> # من خلايا الدعم / زرع مستلم </td></tr><tr><td> كله نخاع العظام </td><td> 500،000-2،000،000 </td><td> ن / أ </td></tr><tr><td> ج-كيت + </td><td> 1،000-10،000 </td><td> 200000 </td></tr><tr><td> لين-ج-كيت + هيئة السلع التموينية-1 + (LKS) </td><td> 100-10،000 </td><td> 200000 </td></tr><tr><td> LKS CD150 + CD48 - SP </td><td> 1-100 </td><td> 200000 </td></tr><tr><td> LKS CD150 + CD34 - </td><td> 1-100 </td><td> 200000 </td></tr></tbody></table> الجدول 2. عدد الخلايا المانحة لزرع. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا أن يؤديها زرع الثانوي لتقييم قدرة الخلايا transduced لزرع متسلسل المرض. تنبيغ الزرع هو طريقة تنوعا للغاية وأكثر تكلفة أسرع بكثير وبشكل كبير كفاءة بالمقارنة مع المعدلة وراثيا، ونماذج تدق في، أو طعم أجنبي. فإنه يسمح احد لتحديد ما إذا كان هذا الجين من الفائدة كافية لإحداث الأورام الخبيثة الدموية، ويمكن استخدامها لتكون نموذجا في الجسم الحي ما قبل السريرية لاختبار الأدوية. فوائد أخرى للتقنية التنبيغ الزرع هي أنه يتجنب التعبير في الخلايا غير المكونة للدم والتي يخدمها الموقع الإدراج فيروسات كعلامة نسيلي. القيود المفروضة على هذه امب تقنيةالبريد مستويات غير الفسيولوجية من الجينات transduced والاختلاف في موقع التكامل بين الجينات 16،17. أخذ كل الفوائد المذكورة أعلاه والقيود في الاعتبار، التنبيغ الزرع هو الخيار الواضح لنمذجة الأولي في الجسم الحي من الجينات المسرطنة للدم المفترضة.

تنبيغ الزرع هو طريقة مفيدة لنموذج الأورام الخبيثة الدموية في الفئران. وكانت هذه التقنية قيمة خاصة لدراسة الأورام الخبيثة النخاعي التي يعود تاريخها إلى اول دليل على ان التعبير خارج الرحم من BCR-ABL1 يمكن أن ألخص بأمانة ابيضاض الدم النقوي المزمن في الفئران 1. وقد سهلت هذه التقنية فيما بعد دراسة مستفيضة من JAK2 V617F وMPL W515K / L تحور مرض تكاثر نقوي (MPN). مبن مجموعة من الأورام الخبيثة الدموية التي تتميز الافراط في خلايا الدم النخاعي ناضجة وتليف نخاع العظام. تنشأ هذه الأمراض عموما من توسع نسيلي من الخلايا الجذعية المكونة للدم الذي حصل طفرة جسدية في أي JAK2، MPL، أو CALR. تنبيغ-زرع JAK2 V617F وMPL W515K / نماذج L معرض المظاهر السريرية فيرا كثرة الحمر وتليف النقي 2-5 &lt;/ سوب&gt;. في الآونة الأخيرة، كما تم إنشاء نموذج الفأر من-تحور calreticulin مبن مع أسلوب التنبيغ الزرع 6. هذه الفئران تطوير مرض الضرورية مثل كثرة الصفيحات مع زيادة الصفائح الدموية، وزيادة عدد الخلايا السوية العرطلة، وتليف نخاع العظام. معا، وقد وفرت هذه النماذج ليس فقط الفرصة لاكتساب نظرة ثاقبة على المرضية الجزيئية من مبن، ولكن أيضا القدرة على تطوير ودراسة العلاجات في أجواء ما قبل السريرية. توفر هذه المخطوطة وصفا مفصلا لمنهجية التنبيغ الزرع مع التركيز على طفرة CALRdel52. تتضمن هذه التقنية زرع خلايا نخاع العظام transduced retrovirally معربا عن متحولة بناء في الفئران المتلقي مسانج المشع.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CELL LINES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3T3 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLASMIDS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoPak, also known as pCL-Eco</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12371</td>
			<td>Retroviral packaging cell lines, such as EcoPack 2-293, may be used in place of the EcoPak plasmid and standard 293T cells. Additional &#947;-retrovirus envelope and packaging plasmids are available from Addgene and others.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSCV-IRES-GFP (MIG)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>20672</td>
			<td>Additional &#947;-retroviral transfer plasmids are available from Addgene and others.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CONSUMABLES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G x 1/2&#34; needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin/L-glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-30-009-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-25-052-CI</td>
			<td>Can be homemade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10cm dishes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>172931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12565268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60mm dishes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>150288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9840454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-FU</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A13456-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100um cell strainers</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22363549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml conical tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12565270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>130184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-959-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45um syringe filters</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>0974061B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK buffer</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>10-548E</td>
			<td>Can be homemade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine IL-3</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>213-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine IL-6</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>216-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine SCF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-tremeGENE 9</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6365809001</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml centrifuge tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQUIPMENT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Accuri C6</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray irradiator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transduction-transplantation mouse model of myeloproliferative neoplasm

Transduction-transplantation is a quick and efficient way to model human hematologic malignancies in mice. This technique results in expression of the gene of interest in hematopoietic cells and can be used to study the gene's role in normal and/or malignant hematopoiesis. This protocol provides a detailed description on how to perform transduction-transplantation using calreticulin (CALR) mutations recently identified in myeloproliferative neoplasm (MPN) as an example. In this protocol whole bone marrow cells from 5-flurouracil (5-FU) treated donor mice are transduced with a retrovirus encoding mutant CALR and transplanted into lethally irradiated syngeneic hosts. Donor cells expressing mutant CALR are marked with green fluorescent protein (GFP). Transplanted mice develop an MPN phenotype including elevated platelets in the peripheral blood, expansion of megakaryocytes in the bone marrow, and bone marrow fibrosis. We provide a step-by-step account of how to generate retrovirus, calculate viral titer, transduce whole bone marrow cells, and transplant into irradiated recipient mice.

نتائج تقنية التنبيغ الزرع في إعادة المكونة للدم من الفئران المتلقي مع الخلايا معربا عن الجينات في المصالح. ويبين الشكل 1 لمحة عامة عن نموذج الفأر التنبيغ-زرع calreticulin تحور MPN. لفترة وجيزة، الارتجاعي معربا عن CALRwt أو CALRdel52 يستخدم لتصيب الخلايا BM من الماوس المانحة C57B / 6. يتم زرع خلايا Transduced في المشع C57B / 6 الماوس المتلقي والخلايا المانحة engraftment يحدث خلال الشهر الأول بعد زرع. أدلة على وجود النمط الظاهري يصبح المرض واضحة 3 أشهر بعد زرع فيها الفئران المعرض زيادة الصفائح الدموية والخلايا السوية العرطلة، تليها نخاع العظام التليف في 6-10 شهرا بعد زرع. إذا فشلت الخلايا المانحة إلى تدبر، قد تحدث الوفاة الماوس في غضون الأسابيع 2 الأولى بعد الزرع. بالإضافة إلى ضعف حقن أو الصدمة خلال الحقن، ويمكن أن أخطاء فنية أخرى تسبب engraftment الفقراء من تنبيغخلايا د أو الموت الماوس. وتشمل هذه الأشعة دون المستوى الأمثل من الفئران المتلقي، إذا كان هذا يحدث معظم الخلايا المكونة للدم سوف يكون المتلقي بدلا من أصل المانحة. من ناحية أخرى، التشعيع المفرط للمتلقي يمكن أن يسبب الفئران لتطوير المرض الناجم عن إشعاع أو حتى الموت. والتتر الفيروسية منخفضة يؤدي إلى انخفاض كفاءة إصابة الخلايا المانحة. ونتيجة لذلك انخفاض أعداد الخلايا المانحة والتعبير عن الجينات في المصالح وحتى الفئران قد لا يظهر النمط الظاهري المطلوب. لهذا السبب، فإنه من الأهمية بمكان أن فيروس مع التتر عالية يستخدم لتنبيغ الخلايا المانحة. ويوضح الشكل 2 كيفية حساب عيار الفيروسية النسبي حيث يتم حساب GFP٪ من الأحداث التي تم جمعها من بوابة الخلية الحية. ويوضح الشكل 2B عيار مع الجسيمات أكثر من واحد الفيروسي في الخلية (1: 3 تمييع) وكذلك التتر مع الجسيمات الفيروسية واحدة في كل خلية (1:30، 1:10، و 1: 100 طاف). من الناحية المثالية، سوف لا يقل عن 50٪ GFP + الخلايا يكون DETECتيد مع 1:30 التخفيف من طاف الفيروسي. الرقم 3 يظهر دليل على المتلقي زرع ناجحة حيث الفئران CALRdel52 يحمل النمط الظاهري مبن مع زيادة الصفائح الدموية، وزيادة السوية العرطلة في نخاع العظام، وتليف نخاع العظام. <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/54624/54624fig1.jpg" /> الشكل 1: نظرة عامة على تنبيغ-زراعة الفأر نموذج من التكاثر النقيي الأورام. أ) يحدث جيل الارتجاعي وتحديد عيار الفيروسية 1-2 أسابيع قبل زرع. ب) D (-8) (خمسة أيام قبل الحصاد نخاع العظام)، يتم التعامل مع الفئران المانحة مع 5-FU في استنزاف خلايا النسب التي ارتكبت وحمل المكونة للدم الدراجات الخلايا الجذعية. C) في (-3 D)، يتم حصاد نخاع العظام من عظام الساق والمثقف في 2X بين عشية وضحاها قبل STIM للحث على الدراجات خلية من الخلايا الجذعية المكونة للدم. D) الخلايا المانحة<html> مصابون طاف الفيروسي على (-2) D ووطرد الخلايا في 400 x ج عند 30 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة للشارع spinoculation 1. E) في د (-1)، يتم تنفيذ spinoculation 2 الثانية على الخلايا المانحة. بالإضافة إلى ذلك، الفئران المعرضة للإشعاع في استنزاف الخلايا في نخاع العظم المضيف المتخصصة للسماح engraftment الخلية المانحة. تزرع F) الخلايا المانحة Transduced في الفئران المتلقي مسانج المشع على D0. G) إذا فشلت الخلايا المانحة إلى تدبر ثم الموت سوف يحدث بعد يوم 12-14 بعد الزرع إذا تم استخدام الفتاكة جرعة التشعيع. H) يصبح النمط الظاهري مبن واضح من 3 أشهر بعد زرع. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54624/54624fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <html> JPG &quot;/&gt; الشكل 2: تحديد عيار الفيروسية التي التدفق الخلوي. وtransduced خلايا 3T3 مع تركيزات مختلفة من الكفاءة فيروس وتنبيغ يتم مراقبتها عن طريق التدفق الخلوي. أ) يتم جمع الأحداث داخل بوابة الخلية الحية كما تصور من قبل FSC مقابل SSC. يتم استبعاد الخلايا الميتة من تحليل GFP. عرض ب) المدرج الإحصائي٪ GFP لكل وحدة تخزين من طاف الفيروسية التي تم اختبارها. عيار الفيروسي هو مقبول عند 50٪ على الأقل من 3T3 الخلايا GFP + عند المصابين مع تخفيف 1:30 من طاف الفيروسي. باستخدام المعادلة من الخطوة 2.11.6، تم احتساب عيار الفيروسية بناء على عدد خلايا من 400،000 الخلايا. حساب لعيار الفيروسية في التخفيف 01:30 يلي: [(400،000 س 0.56) / 1) × 30] = 6.72 × 10 6 PFU / مل. في خطوة 3.7، إصابة 4 × 10 6 الخلايا مع 2 مل من طاف الفيروسي من شأنه أن يؤدي في كل خلية استقبال 3 الجسيمات الفيروسية.ديزيل / ftp_upload / 54624 / 54624fig2large.jpg &quot;الهدف =&quot; _ فارغة &quot;&gt; الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/54624/54624fig3.jpg" /> الشكل (3): والدليل على نجاح الخلية المانحة Engraftment ومبن النمط الظاهري. الفئران المتلقي المشع على قيد الحياة بعد 2 أسابيع بعد زرع تشير engraftment الناجح لحقن الخلايا. أ) يمكن رصدها الخلايا المانحة المزروعة التي كتبها٪ GFP في الدم المحيطي. ب) بالإضافة إلى ذلك، ينبغي أن تؤخذ التهم CBC لمراقبة تطور المرض. تم الكشف عن زيادة الصفائح الدموية في وقت مبكر من 2 أشهر بعد زرع في CALRdel52 بالمقارنة مع CALRwt ومكافحة ناقلات الفارغة. C) في وقت إنهاء والفئران CALRdel52 يحمل ملامح كلاسيكية من النمط الظاهري مبن بما في ذلك تضخم الطحال (لا يظهر)، ونخاع العظام فرط، والتوسع في megakaryocyقسم التدريب والامتحانات في نخاع العظام، وتليف نخاع العظام. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54624/54624fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> خطأ فني </td><td> الأسباب </td><td> نتيجة </td></tr><tr><td> حقن الفقراء أو الصدمة </td><td> زرع الرفض </td><td> الفشل زراعة </td></tr><tr><td> نوعية سيئة من الخلايا المانحة </td><td> زرع الرفض </td><td> فشل زرع أو الموت </td></tr><tr><td> انخفاض عيار الفيروس </td><td> تنبيغ الفقراء من شهادة الثانوية العامة </td><td> الفشل زراعة </td></tr><tr><td> عالية الإشعاع الجرعة </td><td> تشعيع المرض الناجم </td><td> الموت </td></tr><tr><td> منخفضة الإشعاع دوحد ذاتها </td><td> زرع الرفض </td><td> الفشل زراعة </td></tr><tr><td> الفئران المانحة القديمة (+12 أسابيع) </td><td> انخفاض المدخلات شهادة الثانوية العامة </td><td> الفشل زراعة </td></tr></tbody></table> الجدول 1: أخطاء الفنية التي يمكن أن تؤدي في الماوس الموت أو فشل زراعة. يسرد هذا الجدول أمثلة من الأخطاء الفنية والأسباب المرتبطة بها التي يمكن أن تحدث مع بروتوكول العظام زرع نخاع.

Watch this Scientific Journal Video about Transduction-Transplantation Mouse Model of Myeloproliferative Neoplasm at JoVE.com

Transduction-Transplantation Mouse Model of Myeloproliferative Neoplasm

This manuscript provides a description of the methodology used to establish transduction-transplantation mouse models. A detailed account is given of technical errors to avoid when performing bone marrow transplants. A clear understanding should be gained of the importance of high viral titer, transfection/transduction, and irradiation.

تنبيغ-زرع نموذج الفأر من مرض تكاثر نقوي

Transduction-transplantation is a quick and efficient way to model human hematologic malignancies in mice. This technique results in expression of the ...

transduction-transplantation-mouse-model-myeloproliferative

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Cancer Research

11.8K Views.  University of California, Irvine. This manuscript provides a description of the methodology used to establish transduction-transplantation mouse models. A detailed account is given of technical errors to avoid when performing bone marrow transplants. A clear understanding should be gained of the importance of high viral titer, transfection/transduction, and irradiation. 

Video: Transduction-Transplantation Mouse Model of Myeloproliferative Neoplasm

Fluorescent Orthotopic Mouse Model of Pancreatic Cancer

Pancreatic cancer remains one of the cancers for which survival has not improved substantially in the last few decades. Only 7% of diagnosed patients will survive longer than five years. In order to understand and mimic the microenvironment of pancreatic tumors, we utilized a murine orthotopic model of pancreatic cancer that allows non-invasive imaging of tumor progression in real time. Pancreatic cancer cells expressing green fluorescent protein (PANC-1 GFP) were suspended in basement membrane matrix, high concentration, (e.g., Matrigel HC) with serum-free media and then injected into the tail of the pancreas via laparotomy. The cell suspension in the high concentration basement membrane matrix becomes a gel-like substance once it reaches room temperature; therefore, it gels when it comes in contact with the pancreas, creating a seal at the injection site and preventing any cell leakage. Tumor growth and metastasis to other organs are monitored in live animals by using fluorescence. It is critical to use the appropriate filters for excitation and emission of GFP. The steps for the orthotopic implantation are detailed in this article so researchers can easily replicate the procedure in nude mice. The main steps of this protocol are preparation of the cell suspension, surgical implantation, and whole body fluorescent in vivo imaging. This orthotopic model is designed to investigate the efficacy of novel therapeutics on primary and metastatic tumors.

A procedure to implant green fluorescent protein-expressing pancreatic cancer cells (PANC-1 GFP) orthotopically into the pancreas of Balb-c Ola Hsd-Fox1nu mice to assess tumor progression and metastasis is presented here.

فلوري مثلي نموذج الفأر من سرطان البنكرياس

Pancreatic cancer remains one of the cancers for which survival has not improved substantially in the last few decades. Only 7% of diagnosed patients will ...

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. Here we describe a method using targeted peripheral irradiation to induce fatigue-like behavior in mice. With appropriate shielding, the irradiation targets the lower abdominal/pelvic region of the mouse, sparing the brain, in an effort to model radiation treatment received by individuals with pelvic cancers. We deliver an irradiation dose that is sufficient to induce fatigue-like behavior in mice, measured by voluntary wheel-running activity (VWRA), without causing obvious morbidity. Since wheel running is a normal, voluntary behavior in mice, its use should have little confounding effect on other behavioral tests or biological measures. Hence, wheel running can be used as a feasible outcome measure in understanding the behavioral and biological correlates of fatigue. CRF is a complex condition with frequent comorbidities, and likely has causes related both to cancer and its various treatments. The methods described in this paper are useful for investigating radiation-induced changes that contribute to the development of CRF and, more generally, to explore the biological networks that can explain the development and persistence of a peripherally-triggered but centrally-driven behavior like fatigue.

We describe a method using targeted peripheral irradiation to induce fatigue-like behavior in mice. The selected non-lethal irradiation dose leads to a week-long reduction in voluntary wheel-running activity.

نموذج الفأر من التعب المستحث بواسطة الطرفية تشعيع

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate tumor biology and tumor cell dissemination. Orthotopic mouse models have been introduced to overcome these limitations; however, such models are technically demanding, especially in hollow organs such as the large bowel. In order to produce uniform tumors which reliably grow and metastasize, standardized techniques of tumor cell preparation and injection are critical. 
We have developed an orthotopic mouse model of colorectal cancer (CRC) which develops highly uniform tumors and can be used for tumor biology studies as well as therapeutic trials. Tumor cells from either primary tumors, 2-dimensional (2D) cell lines or 3-dimensional (3D) organoids are injected into the cecum and, depending on the metastatic potential of the injected tumor cells, form highly metastatic tumors. In addition, CTCs can be found regularly. We here describe the technique of tumor cell preparation from both 2D cell lines and 3D organoids as well as primary tumor tissue, the surgical and injection techniques as well as the isolation of CTCs from the tumor-bearing mice, and present tips for troubleshooting.

We describe the establishment of orthotopic colorectal tumors via injection of tumor cells or organoids into the cecum of mice and the subsequent isolation of circulating tumor cells (CTCs) from this model.

عزل الخلايا السرطانية المتداولة في نموذج الفأر المثلي لسرطان القولون والمستقيم

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

A Genetically Engineered Mouse Model of Sporadic Colorectal Cancer

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, colorectal cancer mouse models based on tumor cell injection have severe limitations and do not accurately simulate tumor biology and tumor cell dissemination. Genetically engineered mouse models have been introduced to overcome these limitations; however, such models are technically demanding, especially in large organs such as the colon in which only a single tumor is desired.
As a result, an immunocompetent, genetically engineered mouse model of colorectal cancer was developed which develops highly uniform tumors and can be used for tumor biology studies as well as therapeutic trials. Tumor development is initiated by surgical, segmental infection of the distal colon with adeno-cre virus in compound conditionally mutant mice. The tumors can be easily detected and monitored via colonoscopy. We here describe the surgical technique of segmental adeno-cre infection of the colon, the surveillance of the tumor via high-resolution colonoscopy and present the resulting colorectal tumors.

A protocol for the establishment of a genetically engineered mouse model of colorectal cancer by segmental adeno-cre infection and its surveillance via high-resolution colonoscopy is presented.

نموذج الفأر المهندسة وراثيا لسرطان القولون والمستقيم المتفرقة

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, colorectal cancer mouse models based on tumor cell injection have severe limitations ...

Tumor Engraftment in a Xenograft Mouse Model of Human Mantle Cell Lymphoma

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when stimulated by T lymphocytes, oncogenic B cells survive and expand autonomously in undefined organ niches. Mantle cell lymphoma (MCL) is one such B cell disorder, where the median survival rate of patients is 4 - 5 years. This calls for the need of effective mechanisms by which the homing and engraftment of these cells are blocked in order to increase the survival and longevity of patients. Therefore, the effort to develop a xenograft mouse model to study the efficacy of MCL therapeutics by blocking the homing mechanism in vivo is of utmost importance. Development of animal recipients for human cell xenotransplantation to test early stage drugs have long been pursued, as relevant preclinical mouse models are crucial to screen new therapeutic agents. This animal model is developed to avoid human graft rejection and to establish a model for human diseases, and it may be an extremely useful tool to study disease progression of different lymphoma types and to perform preclinical testing of candidate drugs for hematologic malignancies, like MCL. We established a xenograft mouse model that will serve as an excellent resource to study and develop novel therapeutic approaches for MCL.

Mantle cell lymphoma (MCL) is a difficult to treat B cell disorder and it is equally difficult to establish a xenograft mouse model of primary MCL to study and develop therapeutics. Here, we describe the successful establishment of MCL xenografts in mice to help understand its underlying biology.

ورم انجرافتمينت في نموذج الفأر إكسينوجرافت من عباءة البشرية الخلية اللمفاوية

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when ...

A Syngeneic Pancreatic Cancer Mouse Model to Study the Effects of Irreversible Electroporation

Pancreatic cancer (PC), a disease which kills approximately 40,000 patients each year in the US, has successfully evaded several therapeutic approaches including the promising immunotherapeutic strategies. Irreversible electroporation (IRE) is a non-thermal ablation technique that induces tumor cell death without destruction of adjacent collagenous structures, thus enabling the procedure to be performed in tumors very close to blood vessels. Unlike thermal ablation techniques, IRE results in gradual apoptotic cell death, along with immediate ablation induced necrosis, and is currently in clinical use for selected patients with locally advanced PC. An ablative, non-target specific procedure like IRE can induce a myriad of responses in the tumor microenvironment. A few studies have addressed the effects of IRE on tumor growth in other tumor types, but none have focused on PC. We have developed a syngeneic mouse model of PC in which subcutaneous (SQ) and orthotopic tumors can be successfully treated with IRE in a highly controlled setting, facilitating various longitudinal studies post procedure. This animal model serves as a robust system to study the effects of IRE and ways to improve the clinical efficacy of IRE.

Irreversible electroporation (IRE) is a non-thermal ablation technique used for the treatment of locally advanced pancreatic cancer. Being a relatively new technique, the effects of IRE on the tumor growth are poorly understood. We have developed a syngeneic mouse model that facilitates studying the effects of IRE on pancreatic cancer.

نموذج سرطان البنكرياس سينجينيك ماوس دراسة آثار انهانسر لا رجعة فيه

Pancreatic cancer (PC), a disease which kills approximately 40,000 patients each year in the US, has successfully evaded several therapeutic approaches ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the limitations of current treatments, as the majority of patients do not respond to immunotherapy. Development of accurate preclinical models to quickly identify novel and effective therapeutic combinations are critical to address this unmet clinical need. Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDA) is a canonical example of an immune checkpoint blockade resistant tumor with only 2% of patients responding to immunotherapy. The genetically engineered KrasG12D+/-;Trp53R172H+/-;Pdx-1 Cre (KPC) mouse model of PDA recapitulates human disease and is a valuable tool for assessing therapies for immunotherapy resistant in the preclinical setting, but time to tumor onset is highly variable. Surgical orthotopic tumor implantation models of PDA maintain the immunobiological hallmarks of the KPC tissue-specific tumor microenvironment (TME) but require a time-intensive procedure and introduce aberrant inflammation. Here, we use an ultrasound-guided orthotopic tumor implantation model (UG-OTIM) to non-invasively inject KPC-derived PDA cell lines directly into the mouse pancreas. UG-OTIM tumors grow in the endogenous tissue site, faithfully recapitulate histological features of the PDA TME, and reach enrollment-sized tumors for preclinical studies by four weeks after injection with minimal seeding on the peritoneal wall. The UG-OTIM system described here is a rapid and reproducible tumor model that may allow for high throughput analysis of novel therapeutic combinations in the murine PDA TME.

We describe a protocol for the ultrasound guided implantation of murine-derived pancreatic ductal adenocarcinoma cell lines directly into the native tumor site. This approach resulted in pancreatic tumors detectable by ultrasound scanning within 2-4 weeks of injection, and significantly reduced the proportion tumor cell seeding on the peritoneal wall as compared to surgical orthotopic implantation.

الموجات فوق الصوتية غرس العظام البنكرياس الاقنيه اللحمية

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...

An Orthotopic Resectional Mouse Model of Pancreatic Cancer

There is a lack of satisfactory animal models to study adjuvant and/or neoadjuvant therapy in patients being considered for surgery of pancreatic cancer (PC). To address this deficiency, we describe a mouse model involving orthotopic implantation of PC followed by distal pancreatectomy and splenectomy. The model has been demonstrated to be safe and suitably flexible for the study of various therapeutic approaches in adjuvant and neo adjuvant settings.
In this model, a pancreatic tumor is first generated by implanting a mixture of human pancreatic cancer cells (luciferase-tagged AsPC-1) and human cancer associated pancreatic stellate cells into the distal pancreas of Balb/c athymic nude mice. After three weeks, the cancer is resected by re-laparotomy, distal pancreatectomy and splenectomy. In this model, bioluminescence imaging can be used to follow the progress of cancer development and effects of resection/treatments. Following resection, adjuvant therapy can be given. Alternatively, neoadjuvant treatment can be given prior to resection.
Representative data from 45 mice are presented. All mice underwent successful distal pancreatectomy/splenectomy with no issues of hemostasis. A macroscopic proximal pancreatic margin greater than 5 mm was achieved in 43 (96%) mice. The technical success rate of pancreatic resection was 100%, with 0% early mortality and morbidity. None of the animals died during the week after resection.
In summary, we describe a robust and reproducible technique for a surgical resection model of pancreatic cancer in mice which mimics the clinical scenario. The model may be useful for the testing of both adjuvant and neoadjuvant treatments.

In the clinical context, patients with localized pancreatic cancer will undergo pancreatectomy followed by adjuvant treatment. This protocol reported here aims to establish a safe and effective method of modelling this clinical scenario in nude mice, through orthotopic implantation of pancreatic cancer followed by distal pancreatectomy and splenectomy.

نموذج الماوس استئصال العظام لسرطان البنكرياس

There is a lack of satisfactory animal models to study adjuvant and/or neoadjuvant therapy in patients being considered for surgery of pancreatic cancer ...

Molecular and Immunologic Techniques in a Genetically Engineered Mouse Model of Gastrointestinal Stromal Tumor

Gastrointestinal stromal tumor (GIST) is the most common human sarcoma and is typically driven by a single mutation in the KIT receptor. Across tumor types, numerous mouse models have been developed in order to investigate the next generation of cancer therapies. However, in GIST, most in vivo studies use xenograft mouse models which have inherent limitations. Here, we describe an immunocompetent, genetically engineered mouse model of gastrointestinal stromal tumor harboring a KitV558&#916;/+ mutation. In this model, mutant KIT, the oncogene responsible for most GISTs, is driven by its endogenous promoter leading to a GIST which mimics the histological appearance and immune infiltrate seen in human GISTs. Furthermore, this model has been used successfully to investigate both targeted molecular and immune therapies. Here, we describe the breeding and maintenance of a KitV558&#916;/+ mouse colony. Additionally, this paper details the treatment and procurement of GIST, draining mesenteric lymph node, and adjacent cecum in KitV558&#916;/+ mice, as well as sample preparation for molecular and immunologic analyses.

The goal of this manuscript is to describe the KitV558&#916;/+&#160;mouse model and techniques for successful dissection and processing of mouse specimens.

التقنيات الجزيئية والمناعية في نموذج فأر مهندس وراثيا لورم الجهاز الهضمي اللثوي

Gastrointestinal stromal tumor (GIST) is the most common human sarcoma and is typically driven by a single mutation in the KIT receptor. Across tumor ...

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

Bladder cancer is an understudied area, particularly in genetically engineered mouse models (GEMMs). Inbred GEMMs with tissue-specific Cre and loxP sites have been the gold standards for conditional or inducible gene targeting. To provide faster and more efficient experimental models, an ex vivo organoid culture system is developed using adenovirus Cre and normal urothelial cells carrying multiple loxP alleles of the tumor suppressors Trp53, Pten, and Rb1. Normal urothelial cells are enzymatically disassociated from four bladders of triple floxed mice (Trp53f/f: Ptenf/f: Rb1f/f). The urothelial cells are transduced ex vivo with adenovirus-Cre driven by a CMV promoter (Ad5CMVCre). The transduced bladder organoids are cultured, propagated, and characterized in vitro and in vivo. PCR is used to confirm gene deletions in Trp53, Pten, and Rb1. Immunofluorescence (IF) staining of organoids demonstrates positive expression of urothelial lineage markers (CK5 and p63). The organoids are injected subcutaneously into host mice for tumor expansion and serial passages. The immunohistochemistry (IHC) of xenografts exhibits positive expression of CK7, CK5, and p63 and negative expression of CK8 and Uroplakin 3. In summary, adenovirus-mediated gene deletion from mouse urothelial cells engineered with loxP sites is an efficient method to rapidly test the tumorigenic potential of defined genetic alterations.

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

This protocol describes the process of the generation and characterization of mouse urothelial organoids harboring deletions in genes of interest. The methods include harvesting mouse urothelial cells, ex vivo transduction with adenovirus driving Cre expression with a CMV promoter, and in vitro as well as in vivo characterization.

السابقين فيفو النموذج العضوي لحذف الجينات بوساطة الفيروس الغدي-Cre في خلايا الفأر البولية

Bladder cancer is an understudied area, particularly in genetically engineered mouse models (GEMMs). Inbred GEMMs with tissue-specific Cre and loxP sites ...