لقد طورنا بروتوكولا سريعا وفعالا لتوليد عضويات سرطان المثانة عن طريق تحرير الجينات خارج الجسم الحي للخلايا البولية الطبيعية للفئران التي تحمل أليلات مفلطخة في الجينات ذات الاهتمام. هذه الطريقة خارج الجسم الحي لديها سير عمل لمدة أسبوع إلى أسبوعين بدلا من سنوات من تربية الفئران ، وهي فعالة للغاية في نقل الفيروس الغدي على عمليات حذف الجينات بوساطة Cre. للبدء ، قم بإعداد جميع الأدوات والكواشف المعقمة ، بما في ذلك المقص والملقط و DPBS في أطباق استزراع 35 ملليلتر والإيثانول 70٪ والشاش والمناشف الورقية النظيفة.
بعد ذلك ، قم بتنظيف جميع أسطح منطقة التشريح وقم بتغطية منطقة التشريح بمنشفة ورقية نظيفة. ضع الفأر الرحيم على الشاش في منطقة التشريح ورش 70٪ من الإيثانول على بطن الفأر ، ثم باستخدام مقص تشريح معقم ، قم بعمل شق أسفل خط الوسط في البطن لفضح المثانة. الآن ، استخدم الملقط للإمساك بالمثانة وسحبها بلطف لتحديد التقاطع الحالبي الثنائي.
باستخدام المقص ، قم بإزالة قاع المثانة ، باتباع الخط الفاصل بين فتحتي الحالب ونقل المثانة إلى طبق معقم يحتوي على 2 ملليلتر من DPBS ، ثم قم بإزالة النسيج الدهني والضام ووضع المثانة في طبق جديد يحتوي على 2 ملليلتر من DPBS. قم أيضا بإزالة الفيروس الغدي من التخزين الذي تبلغ درجة حرارته 80 درجة مئوية تحت الصفر واحتفظ به على الجليد. لتفكك الخلايا ، قم بإعداد جميع الأدوات والكواشف المعقمة كما هو موضح في المخطوطة ، ثم في خزانة السلامة البيولوجية ، ونقل المثانة إلى طبق 35 ملم وغسلها ب 2 ملليلتر من DPBS المعقمة.
اجمع أنسجة المثانة من أربعة فئران في طبق مع ملليلتر واحد من وسط الثقافة الكامل دون FBS المجردة من الفحم. بعد ذلك ، باستخدام شفرة جراحية ، قم بتقطيع كل مثانة إلى أربع قطع متساوية ، ثم باستخدام الملقط ، قم بفتح المثانة لتعريض سطح اليوروثيليوم إلى الوسط. انقل قطع المثانة والمتوسطة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر.
اغسل الطبق مرتين ب 2 ملليلتر من وسط الثقافة الكامل بدون FBS المجردة من الفحم وأضف الغسيل إلى أنبوب جهاز الطرد المركزي ، ليصل الحجم الإجمالي إلى 5 ملليلتر. بعد ذلك ، أضف خليط الكولاجيناز والهيالورونيداز وضع الأنبوب أفقيا في حاضنة اهتزاز مدارية 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة عند 200 دورة في الدقيقة. بعد هضم الأنسجة، أضف حجما متساويا بنسبة 10٪ من FBS و DPBS المجردين من الفحم إلى الأنبوب وأجهزة الطرد المركزي عند 200 مرة من الغرام لمدة 5 دقائق.
بعد التخلص من السوبر ناتانت ، أضف 2 ملليلتر من بديل التربسين إلى حبيبة الخلية واخلطها جيدا ، ثم احتضن الأنبوب عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 4 دقائق. بعد الحضانة ، قم بماصة الخلايا لأعلى ولأسفل 10 مرات باستخدام طرف P1000 قياسي وإضافة 5 ملليلتر من FBS و DPBS المجردين من الفحم بنسبة 10٪. قم بتصفية الخلايا المنفصلة من خلال مصفاة خلايا معقمة بسعة 100 ميكرومتر وجمع تعليق الخلية في أنبوب سعة 50 ملليلتر.
انقل تعليق الخلية إلى أنبوب 15 ملليلتر وأجهزة طرد مركزي عند 200 مرة غرام لمدة 5 دقائق. بعد إزالة supernatant ، أعد تعليق الكريات في 1 ملليلتر من وسط الثقافة الكامل. عد عدد الخلايا باستخدام مقياس الدم والصفيحة 0.5 في 10 إلى الخلايا السادسة في كل بئر من صفيحة 24 بئرا مع 0.5 ملليلتر من وسط الثقافة الكامل الطازج.
بعد ذلك ، أخرج مقتطفات المصفوفة من خلايا ساركوما الفئران Engelbreth-Holm-Swarm من تخزين 20 درجة مئوية تحت الصفر وقم بإذابتها على الجليد. أيضا ، قم بتسخين صفيحة من 6 آبار في حاضنة خلايا 37 درجة مئوية. لنقل الفيروس الغدي ، أضف 2 ميكرولتر من الفيروس الغدي إلى لوحة 24 بئرا واخلطها جيدا مع الخلايا البولية المنفصلة .
لتعزيز فعالية النقل ، قم بإجراء الدوران عن طريق الطرد المركزي للصفيحة عند 300 مرة غرام لمدة 30 دقيقة ، ثم احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 1 ساعة. انقل الخلايا والمتوسطة من البئر إلى أنبوب سعة 15 ملليلتر وأجهزة طرد مركزي عند 200 مرة جم لمدة 5 دقائق. بعد التخلص من supernatant ، أضف 50 ميكرولتر من وسط الثقافة الكامل واخلطه جيدا مع الخلايا الموجودة في الأسفل.
بعد ذلك ، أضف 140 ميكرولتر من مستخلص المصفوفة واخلطها جيدا بلطف لتجنب فقاعات الهواء ، ثم قم بإنشاء قباب للعضويات عن طريق إضافة 50 ميكرولتر من المحلول بسرعة لكل قبة إلى لوحة 6 بئر المحمومة مسبقا. احتضن اللوحة واسمح للقباب بالتصلب لمدة 5 دقائق. بعد 5 دقائق ، اقلب اللوحة المكونة من 6 آبار رأسا على عقب واستمر في التصلب لمدة 25 دقيقة إضافية.
بعد الحضانة ، أضف 2.5 ملليلتر من وسط الثقافة الكامل إلى كل بئر وضع اللوحة في حاضنة للثقافة العضوية. تم اكتشاف بروتين الفلورسنت الأخضر في ما يقرب من 100٪ من الخلايا ، مما يشير إلى كفاءة عالية لنقل الفيروس الغدي. أظهر تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوسين والكيمياء النسيجية المناعية للأورام العضوية الثلاثية بالضربة القاضية مورفولوجيا سرطان الظهارة البولية عالي الجودة مع تعبير بروتين إيجابي عن علامات النوع الفرعي القاعدي ل CK5 و p63.
تم الكشف عن الأليلات المفلطحة غير المعاد تجميعها في الخلايا البولية ، غير المعالجة بالفيروس الغدي ، في حين لوحظت الأليلات المعاد تجميعها في الضربات العضوية الثلاثية القاضية. بشكل عام ، كانت هناك حاجة إلى 2 إلى 3 أسابيع لتشكيل ورم تحت الجلد طوله 2 سم. أظهرت الكيمياء النسيجية المناعية للعضويات الثلاثية بالضربة القاضية ، في xenografts في الجسم الحي ، تعبيرا إيجابيا عن بروتينات CK7 و CK5 و p63.
تم الكشف عن التعبير السلبي لبروتينات CK8 و uroplakin. تم الكشف عن علامة اللحمة المتوسطة ، vimentin ، فقط في كبسولة الورم أو السدى. يجب ألا يتجاوز تفكك المثانة الفأر 30 دقيقة.
قد يزيد وقت التفكك الأطول في النسبة المئوية للخلايا السدى ، مثل الخلايا البطانية والخلايا الليفية يمكن دمج هذا النهج مع فرز الخلايا أو نوع الخلية فيروس غدي معين لتوليد نوع الخلية من المواد العضوية المحددة ، مثل التجويف مقابل المواد العضوية القاعدية.
