Kind gift of THP-1 cells from Dr. Mark Chong and assistance in microfabrication from Dr. Yuejun Kang and Dr. Nishanth V. Menon (School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University) were greatly acknowledged. This project was funded by NTU-Northwestern Institute of Nanomedicine (Nanyang Technological University). H.W.H. was supported by Lee Kong Chian School of Medicine (LKCMedicine) postdoctoral fellowship.

1. النانوية (NPS) وصفها من الخلايا الجذعية الوسيطة وحيدات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة الخلايا الجذعية الوسيطة (اللجان الدائمة) في المتوسط ​​تعديل النسر Dulbecco وفي (DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل الجنين البقري (FBS) والمضادات الحيوية ل≥80٪ confluency قبل وضع العلامات. وبالمثل، ثقافة THP-1 الخلايا (آي تي سي سي) في معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) 1640 المتوسطة تستكمل مع FBS 10٪ لكثافة ~ 10 6 خلية / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مصادر القدرة النووية الحمل السيليكا (~ 500 ميكرون) مع الحل calcein صبغ (200 ميكرومتر) باستخدام التحريك بين عشية وضحاها. افتعال PLGA-calcein AM (CAM) باستخدام بروتوكول سبق وصفها. 22 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل 250 CAM ميكروغرام و 100 ملغ PLGA (50:50) في الكلوروفورم في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توليد مصادر القدرة النووية مستحلب واحدة باستخدام الخالط عالية السرعة (13600 x ج، 60 ثانية) في درجة حرارة الغرفة. تتبخر الكلوروفورم في غطاء الكيميائية (≥3 ساعة) قبل المجموعة باستخدام الطرد المركزي (3400 x ج لمدة 5 دقائق)، وغسل (disti مزدوجةالمياه lled)، وتجميد التجفيف والتخزين في درجة حرارة -20 درجة مئوية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان كام PLGA مصادر القدرة النووية (1 ملغ) أو مصادر القدرة النووية السيليكا calcein (150 ميكروغرام) في 0.01٪ بولي-L-ليسين (PLL) الحل في درجة حرارة الغرفة ل15-20 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 3400 x ج لمدة 5 دقائق لإزالة الزائد PLL طاف قبل إعادة تعليق NPS في 1 مل من مستنبت منها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان مصادر القدرة النووية مع الخلايا (اللجان الدائمة أو THP-1، ~ 1-2 × 10 6 خلايا في المجموع) لحوالي 24 ساعة (0.1 ملغ · تركيز مل -1 التوسيم). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل وحصاد اللجان الدائمة ملتصقة المسمى باستخدام 2 مل من 0.25٪ التربسين (5 دقائق، 37 ° C) وإرواء مع 6 مل من DMEM. تدور باستمرار في الخلايا (1000 x ج، 4 دقيقة) و resuspend إلى تركيز من 10 مايو - 10 يونيو خلية / مل لمعالجة ميكروفلويديك. استخدام المسمى THP-1 الخلايا (10 مايو - 10 يونيو خلية / مل) مباشرة لتنقية على microfluidics. </li></ol> 2. إعداد جهاز ميكروفلويديك <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصنيع جهاز <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> افتعال الجهاز دوامة ميكروفلويديك (500 ميكرون (ث) × 115 ميكرون (ح)) مع (PDMS) ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان من مجموعة تجارية باستخدام معيار خطوات الطباعة الحجرية الناعمة. 23 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلط 30 غراما من prepolymer قاعدة و 3 ز وكيل علاج تماما في قارب وزنها. دي الغاز الخليط في مجفف لمدة 60 دقيقة لإزالة أي فقاعات الهواء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يصب الخليط PDMS على القالب الرئيسي رقاقة السيليكون نمط مع تصميم قناة دوامة بعناية إلى ارتفاع ~ 5-10 ملم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دي الغاز الخليط في فراغ مجفف لمدة 60 دقيقة مرة أخرى لإزالة أي فقاعات الهواء. كرر العملية حتى يتم القضاء على كل الفقاعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علاج خليط PDMS في C الفرن 80 درجة لمدة 2 ساعة حتى يتم تعيين PDMS. ضمان عدم إمالة رقاقة خلال علاج لارتفاع الجهاز مستمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع الجهاز دوامة PDMS باستخدام مشرط وقشر بعناية بلاطة PDMS من القالب الرئيسي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> آرايم حواف الجهاز مع مشرط لضمان سطح أملس للارتباط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكمة اثنين من الثقوب (1.5 ملم) لمداخل واثنين من الثقوب (1.5 ملم) لمنافذ على الجهاز PDMS باستخدام خزعة الناخس 1.5 مم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الجهاز مع الأيزوبروبانول (IPA) لإزالة أي حطام وتجفيف الجهاز في الفرن 80 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنظيف السطح السفلي من الجهاز PDMS (مع ميزات القناة) باستخدام الشريط اللاصق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نظيف جانب واحد من شريحة زجاجية (2 &quot;ب 3&quot;) باستخدام الشريط اللاصق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعناية وضع وفضح السطوح تنظيف الجهاز PDMS وشريحة زجاجية في غرفة نظافة البلازما وإخضاعها لفراغ لمدة 60 ثانية. بعد ذلك، تبديل على السلطة البلازما إلى الحد الأقصى وخفض ضغط الغرفة حتى تتحول الغرفة وردي اللون. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كشف السطوح لالبلازما الجوية لمدة 60 ثانية. يخلق البلازما أنواع رد الفعل على السطوح المكشوفة من PDMS والزجاج والتي تمكن الرابطة ضيق عندما جلبت الى عالجآل الاتصال. إيقاف الطاقة البلازما والافراج عن الضغط من نظافة البلازما لاسترداد الجهاز والشريحة الزجاجية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السندات الجهاز PDMS وشريحة زجاجية معا عن طريق الضغط على الأسطح المعرضة للبلازما بإحكام والتأكد من عدم وجود فقاعات محاصرون بين سطحين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حرارة الجهاز المستعبدين باستخدام موقد وضعت في 80 درجة مئوية لمدة 2 ساعة لتعزيز الترابط. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جهاز تشغيل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع قطعتين من الأنابيب (1.52 مم OD) من ~ 15-20 سم للمحاقن مدخل وإرفاق طرف الحقنة (قياس 23) على نهاية واحدة من كل الأنابيب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع قطعتين من الأنابيب (1.52 مم OD) من ~ 5-10 سم للمنافذ ونعلق على ثقوب منفذ الجهاز PDMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل أخذ عينات التوالي، رئيس يدويا للجهاز مع حقنة تحتوي على 70٪ من الإيثانول حتى يتدفق من الأنبوب منفذ. السماح للاعتصام الإيثانول لمدة 30 ثانية إلى 1 دقيقة لتعقيم الجهاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل 30 مل من تصفيتها(0.2 ميكرومتر المسام) العازلة غمد (الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) بنسبة 0.1٪ الأبقار مصل الزلال (BSA)) في حقنة 60 مل وتأمين حقنة على ضخ حقنة. ضبط مضخة إلى الإعدادات الصحيحة (حجم الحقنة: 60 مل، المجلد: 60،000 ميكرولتر). ملاحظة: إضافة BSA لبرنامج تلفزيوني هو تقليل خلية خلية ملزم وغير محددة ملزمة بين الخلايا والجهاز PDMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل 3 مل من الخلايا المسمى في حقنة 3 مل وتأمين حقنة على ضخ حقنة منفصلة. ضبط مضخة إلى الإعدادات الصحيحة (حجم الحقنة: 3 مل، المجلد: 3000 ميكرولتر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من عدم وجود فقاعات الهواء محاصرون في الحقن لضمان تدفق مستقر. إزالة أي فقاعات الهواء عن طريق إخراج بلطف بضع قطرات من السائل من فوهة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ربط نصائح مدخل حقنة وأنابيب للحقن، وإدراجها في مداخل كل من الجهاز (غمد وعينة مدخل). تأكد من عدم وجود فقاعات على طول الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تركيب الأجهزة على وقلبإد المجهر المرحلة على النقيض من التصوير في الوقت الحقيقي خلال خلية عملية الفرز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأمين كوب النفايات الصغيرة واثنين من 15 مل أنابيب قريب من الجهاز على المسرح المجهر باستخدام مواد لاصقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الأنابيب منفذ في الكأس النفايات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين نسبة تدفق لعينة لعازلة غمد إلى 1:10 وتبدأ كل من مضخات حقنة لبدء عملية الفرز مثال (: 120 ميكرولتر / دقيقة لعينة حقنة و1،200 ميكرولتر / دقيقة لحقنة غمد، سرعة تدفق قناة ~ 0.38 متر / ثانية ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل الجهاز لمدة 1.5 دقيقة لمعدل التدفق لتحقيق الاستقرار. ويمكن التأكد من ذلك من خلال وجود خلايا inertially مركزة بالقرب من الجدار الداخلي قنوات تحت مشرق الميدان مع مرحلة التباين باستخدام كاميرا عالية السرعة (~ 5000 - 10000 لقطة في الثانية (fps)، وقت التعرض: 10-50 μsec). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الأنابيب منفذ في أنابيب مختلفة لجمع eluents من مأخذ خلية ومنفذ النفايات. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Wiraja, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamer+technology+for+tracking+cells'+status+&amp;+function.">Aptamer technology for tracking cells' status &amp; function.</a> Mol. Cell. Ther. 2, 33 (2014).</li><li>Yeo, D. C., Wiraja, C., Mantalaris, A., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanosensors+for+Regenerative+Medicine.">Nanosensors for Regenerative Medicine.</a> J. Biomed. Nanotech. 10, 2722-2746 (2014).</li><li>Naumova, A. V., Modo, M., Moore, A., Murry, C. E., Frank, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+imaging+in+regenerative+medicine.">Clinical imaging in regenerative medicine.</a> Nat. Biotechnol. 32, 804-818 (2014).</li><li>Soenen, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+toxicity+of+inorganic+nanoparticles:+Common+aspects+and+guidelines+for+improved+nanotoxicity+evaluation.">Cellular toxicity of inorganic nanoparticles: Common aspects and guidelines for improved nanotoxicity evaluation.</a> Nano Today. 6, 446-465 (2011).</li><li>Donaldson, K., Poland, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotoxicity:+challenging+the+myth+of+nano-specific+toxicity.">Nanotoxicity: challenging the myth of nano-specific toxicity.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 24, 724-734 (2013).</li><li>Veiseh, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-+and+shape-dependent+foreign+body+immune+response+to+materials+implanted+in+rodents+and+non-human+primates.">Size- and shape-dependent foreign body immune response to materials implanted in rodents and non-human primates.</a> Nat. Mater. 14, 643-651 (2015).</li><li>Jones, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+clearance+is+governed+by+Th1/Th2+immunity+and+strain+background.">Nanoparticle clearance is governed by Th1/Th2 immunity and strain background.</a> J. Clin. Invest. 123, 3061-3073 (2013).</li><li>Marchi, L. F., Sesti-Costa, R., Chedraoui-Silva, S., Mantovani, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+four+methods+for+the+isolation+of+murine+blood+neutrophils+with+respect+to+the+release+of+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+and+the+expression+of+immunological+receptors.">Comparison of four methods for the isolation of murine blood neutrophils with respect to the release of reactive oxygen and nitrogen species and the expression of immunological receptors.</a> Comp. Clin. Pathol. 23, 1469-1476 (2014).</li><li>Morton, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamic+metamaterials:+Microfabricated+arrays+to+steer,+refract,+and+focus+streams+of+biomaterials.">Hydrodynamic metamaterials: Microfabricated arrays to steer, refract, and focus streams of biomaterials.</a> Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 105, 7434-7438 (2008).</li><li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marker-specific+sorting+of+rare+cells+using+dielectrophoresis.">Marker-specific sorting of rare cells using dielectrophoresis.</a> Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 102, 15757-15761 (2005).</li><li>Cummings, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streaming+dielectrophoresis+for+continuous-flow+microfluidic+devices.">Streaming dielectrophoresis for continuous-flow microfluidic devices.</a> IEEE Eng. Med. Biol. Mag. 22, 75-84 (2003).</li><li>Augustsson, P., Persson, J., Ekstrom, S., Ohlin, M., Laurell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decomplexing+biofluids+using+microchip+based+acoustophoresis.">Decomplexing biofluids using microchip based acoustophoresis.</a> Lab Chip. 9, 810-818 (2009).</li><li>Di Carlo, D., Irimia, D., Tompkins, R. G., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+inertial+focusing,+ordering,+and+separation+of+particles+in+microchannels.">Continuous inertial focusing, ordering, and separation of particles in microchannels.</a> Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 104, 18892-18897 (2007).</li><li>Hur, S. C., Henderson-MacLennan, N. K., McCabe, E. R. B., Di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deformability-based+cell+classification+and+enrichment+using+inertial+microfluidics.">Deformability-based cell classification and enrichment using inertial microfluidics.</a> Lab Chip. 11, 912-920 (2011).</li><li>Mach, A. J., Di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+scalable+blood+filtration+device+using+inertial+microfluidics.">Continuous scalable blood filtration device using inertial microfluidics.</a> Biotechnol. Bioengin. 107, 302-311 (2010).</li><li>Gossett, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inertial+manipulation+and+transfer+of+microparticles+across+laminar+fluid+streams.">Inertial manipulation and transfer of microparticles across laminar fluid streams.</a> Small. 8, 2757-2764 (2012).</li><li>Amini, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+fluid+flow+using+sequenced+microstructures.">Engineering fluid flow using sequenced microstructures.</a> Nat. Commun. 4, 1826 (2013).</li><li>Sollier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inertial+microfluidic+programming+of+microparticle-laden+flows+for+solution+transfer+around+cells+and+particles.">Inertial microfluidic programming of microparticle-laden flows for solution transfer around cells and particles.</a> Microfluid. Nanofluid. 19, 53-65 (2015).</li><li>Lee, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivariate+biophysical+markers+predictive+of+mesenchymal+stromal+cell+multipotency.">Multivariate biophysical markers predictive of mesenchymal stromal cell multipotency.</a> Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 111, E4409-E4418 (2014).</li><li>Hou, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+retrieval+of+circulating+tumor+cells+using+centrifugal+forces.">Isolation and retrieval of circulating tumor cells using centrifugal forces.</a> Sci. Rep. 3, 1259 (2013).</li><li>Hou, H. W., Bhattacharyya, R. P., Hung, D. T., Han, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+detection+and+drug-resistance+profiling+of+bacteremias+using+inertial+microfluidics.">Direct detection and drug-resistance profiling of bacteremias using inertial microfluidics.</a> Lab Chip. 15, 2297-2307 (2015).</li><li>Yeo, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interference-free+Micro/nanoparticle+Cell+Engineering+by+Use+of+High-Throughput+Microfluidic+Separation.">Interference-free Micro/nanoparticle Cell Engineering by Use of High-Throughput Microfluidic Separation.</a> ACS Appl. Mater. Inter. 7, 20855-20864 (2015).</li><li>Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+Lithography.">Soft Lithography.</a> Angew. Chem. Int. Edit. 37, 550-575 (1998).</li><li>Lee, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+cell+cycle+synchronization+using+inertial+forces+in+spiral+microchannels.">High-throughput cell cycle synchronization using inertial forces in spiral microchannels.</a> Lab Chip. 11, 1359-1367 (2011).</li><li>Kuntaegowdanahalli, S. S., Bhagat, A. A., Kumar, G., Papautsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inertial+microfluidics+for+continuous+particle+separation+in+spiral+microchannels.">Inertial microfluidics for continuous particle separation in spiral microchannels.</a> Lab Chip. 9, 2973-2980 (2009).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

التكنولوجيا قوات الأمر الواقع تنقية الخلايا الموصوفة هنا تمكن فصل سريع ومتواصل من الخلايا المسمى بطريقة إنتاجية عالية. هذا النهج فصل مثالية لحجم العينة كبير أو ارتفاع تركيز خلية تجهيز العينات، وأفضل من الترشيح التي تعتمد على الأغشية التقليدية التي هي عرضة للانسداد بعد الاستخدام الموسعة. وبالمثل، يتطلب الفصل المغناطيسي القائم على تقارب خطوات إضافية خلية العلامات التي هي شاقة ومكلفة. وتظهر الخلايا النقاء للاحتفاظ كلاء وصفت ومورفولوجيا الخلايا بشكل جيد (الشكل 3) مع الحد الأدنى من آثار تدفق / الناجم عن القص (τ إجهاد القص، ~ 200-250 داين / سم 2) وذلك بسبب الوقت القصير الإقامة داخل القناة (&lt; 1 ثانية) 20،24. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن للمستخدم اختيار الحل مزال من الخلايا المسمى فرزها ببساطة عن طريق استبدال العازلة غمد (المالحة) مع وسائل الإعلام المطلوبة أو حل العازلة. ومن الأهمية بمكان أنلا يوجد أي أوساخ أو الحطام في الاستخدام السابق متناهية التي يمكن أن تؤثر سلبا على الخلايا السلوك التركيز. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق تنظيف فتحات مدخل تماما مع خطة العمل الفورية، وكذلك استخدام اخفاء الشريط لتنظيف السطح PDMS قبل الرابطة البلازما. منذ microdevice تعمل في ظل ظروف تدفق عالية (~ 1-1،5 مل / دقيقة)، من المهم أيضا لتسخين PDMS الأجهزة المستعبدين على موقد لضمان الترابط القوي بين PDMS وشريحة زجاجية. خلال عملية الجهاز، إذا كانت الخلايا لا يركز جيدا، فهذا يعني أن معدلات التدفق ليست كافية. يمكن للمرء أن استكشاف عن طريق فحص الجهاز منطقة مدخل ونصائح حقنة لضمان عدم وجود أي تسرب. إزالة تلك المصادر غير منضم من الخلايا المسمى ليست تافهة منذ تقنيات الفصل مختبر مشترك (على سبيل المثال، الطرد المركزي) لا يمكن جزيئات منفصلة / خلايا مختلفة الأحجام (على سبيل المثال، الجزيئات غير منضم والخلايا المسمى). في حين يمكن للمرء أن يجادل بأن الغسيل المتكرروتغيير ثقافة وسائل الإعلام يمكن إزالة مصادر القدرة النووية خالية من الخلايا الملتصقة إلى حد ما، عملية شاقة وغير فعالة لمزارع الخلايا تعليق. الجهاز ميكروفلويديك قوات الأمر الواقع يستخدم الفرز القائم على حجم ومرنة للغاية لأنها يمكن أن تستخدم في كل تعليق والخلايا الملتصقة مع مجموعة كبيرة الحجم، وكذلك إزالة تلك المصادر من مواد مختلفة. إذا كانت الخلايا المستهدفة هي من أحجام مختلفة، وجهاز قوات الأمر الواقع يمكن أن يكون الأمثل عن طريق تغيير الظروف تدفق أو هندسة قناة (على سبيل المثال، ارتفاع القناة ونسبة من الاعراض قناة الداخلي والخارجي) لتحقيق الانفصال كفاءة. وقد تجلى ذلك في وقت سابق ان قوات الأمر الواقع متفوقة مقارنة الطرد المركزي التقليدية في إزالة مصادر القدرة النووية مع فقدان الخلية الحد الأدنى. 22 وعلاوة على ذلك، ظل الأداء الانتعاش خلية عالية (&gt; 90٪) عندما تمت زيادة تركيز العينة إلى 10 7 خلية / مل. وهذا يمثل تحسنا رئيسيا على طرق بالقصور الذاتي القائمة ميكروفلويديك فصل الخلية التي هي عامةتقتصر لاي ل10 5 خلية / مل القدرة بسبب التفاعل خلية خلية وخلية الازدحام في مواقف التوازن. 25 في حين أن التكنولوجيا قوات الأمر الواقع تحقق الفصل على أساس اختلاف حجم، فإنه لا يمكن أن تستخدم لعمليات هندسة الخلايا الأخرى مثل فصل الخلايا المسمى وغير المسماة بسبب تغيرات طفيفة في حجم الخلية. ويمكن اعتبار علامات سطح الخلية لفرز القائمة على تقارب وغيرها من طرائق الفصل المشترك (القابلية المغناطيسية والتوصيل الكهربائي) لمثل هذه التطبيقات المحتملة. التكنولوجيا قوات الأمر الواقع هي أيضا ليست مناسبة لفرز الخلايا المضاعفة على أساس مضان. ومن شأن خيار أفضل يتمثل في استخدام مضان خلية تنشيط الفرز (FACS) لخطوة واحدة الفرز من الخلايا المسمى مع مضان مختلفة والتي تعمل على إنتاجية عالية، ولكنها تتطلب معدات باهظة الثمن وضخمة. وأخيرا، وهذا البروتوكول هو مفيد للغاية لتنقية الخلايا المهندسة عندماوتستخدم مصادر القدرة النووية تحتوي على عناصر التحويلية (عوامل النمو، والمخدرات، القشرية، الخ) لbioimaging و / أو العلاج بالخلايا. وذلك لأن مصادر القدرة النووية المجانية المتبقية يمكن أن يؤدي الى تأثيرات خارج الهدف تحولي على الخلايا المجاورة أو الخلايا المناعية التي تستجيب لهذه الجسيمات الأجنبية عند حقنه في الجسم الحي. كما أنها قد تولد عن غير قصد الإشارات التي يمكن أن تكون مضللة خلال bioimaging. إزالة هذه مصادر القدرة النووية حرة قبل الاستخدام وبالتالي تقليل المخاطر لخلايا غير المستهدفة، تقليل مصنفات في الجهاز المناعي، والحد من قضايا التلوث بين الخطوات خلال متتابعة وضع العلامات / هندسة الخلايا. في التنفيذ الناجح يسهل إلى حد كبير وضع العلامات الخلية ويمكن استخدام خالية من التدخل من الجسيمات هندسية مقرها خلية في العلاج.

هندسة الخلايا الصغيرة / النانوية محملة كيل (NPS) هو بسيط الجيني خالية من التكامل، وتنوعا طريقة، لتعزيز قدرة bioimaging وزيادة / تكملة خصائصه العلاجية المحلية في مجال الطب التجديدي. وتتحقق 1-3 التعديلات الخلوية التي كتبها وصفها غشاء البلازما أو الهيولى مع التركيز الزائد من مصادر القدرة النووية محملة كيل لتشبع مواقع الربط. ومع ذلك، فإن العيب الرئيسي لهذا الأسلوب هو كميات كبيرة من الجزيئات غير منضم المتبقية في حل بعد عمليات الخلية وضع العلامات، والتي من المحتمل أن نخلط التحديد الدقيق للخلايا المهندسة الجسيمات أو تعقيد النتائج العلاجية. 4،5 وبالإضافة إلى ذلك، والتعرض لمصادر القدرة النووية التي تحتوي التحويلية وكلاء (عوامل النمو، القشرية، وما إلى ذلك) في تركيز عال بشكل مفرط يمكن أن يسبب السمية الخلوية والتعرض المهدورة ربما تتسبب في عواقب غير مقصودة على الخلايا غير المستهدفة. حتى لشركات الطيران الجسيمية التي تضم سو المواد &quot;حيويا&quot; [على سبيل المثال، بولي (اللبنيك المشترك حمض الجليكوليك)، PLGA] يمكن أن تحرض على استجابات الخلايا المناعية فعالة في ظل ظروف معينة أيضا. 6 وهذا أمر محفوف بالمخاطر وخاصة في الأشخاص الذين يعانون ضعف المناعة (مثل التهاب المفاصل الروماتويدي) التي يحتمل التأخير النظامية إزالة جسيمات متناهية الصغر. 7 وهكذا، وإزالة فعالة من جزيئات حرة قبل إدخال الخلايا المهندسة الجسيمات ذات أهمية كبيرة لتقليل سميته والحد من التعرض للاساءة الى جزيئات محملة عامل في الجسم الحي. وكثيرا ما يستخدم التقليدي التدرج الطرد المركزي لفصل خلايا هندستها من جزيئات حرة ولكن شاقة وتشغيلها في دفعة واسطة. وعلاوة على ذلك، اجهادات القص التي تمر بها الخلايا أثناء عالية السرعة الطرد المركزي ومقومات المتوسطة الكثافة التدرج قد تعرض سلامة الخلية و / أو سلوك الخلية النفوذ. 8 على microfluidics هو بديلا جذابا مع بغازيتكنولوجيات الفصل األطراف بما في ذلك النزوح الأفقي القطعية (DLD) 9، dieletrophoresis 10،11 وacoustophoresis 12 ضعت لفصل جزيئات صغيرة والتطبيقات الصرف العازلة. ومع ذلك، هذه الأساليب تعاني من سرعة منخفضة (1-10 ميكرولتر · دقيقة - 1) وتكون عرضة للانسداد القضايا. تتطلب فصل النشطة مثل أساليب تعتمد على dielectrophoresis أيضا اختلافات في الظواهر خلية dielectrophoretic الجوهرية أو خطوات إضافية خلية وضع العلامات لتحقيق الانفصال. ويشمل اتباع نهج أكثر واعدة على microfluidics بالقصور الذاتي - الهجرة الجانبية للجزيئات أو خلايا عبر يبسط إلى التركيز على مواقع متميزة نظرا لقوات رفع المهيمنة (F L) في ارتفاع عدد رينولدز (إعادة) 13 نظرا لظروف تدفق عالية، وقرار حجم متفوقة. وكثيرا ما تم استغلاله لتطبيقات الصرف على أساس حجم فصل الخلية 14،15 والعازلة. 16-18 Howeveص، يبقى أداء البورصة عازلة الفقراء مع حل الملوثات ~10-30٪ كما تبقى عادة الخلايا فصل على مقربة من الحدود بين الحلول الأصلية وعازلة جديد 16-18 الأهم من ذلك أن توزيع حجم الخلايا المستهدفة أن تكون مماثلة لتحقيق بالقصور الذاتي الدقيق التركيز والانفصال عن حل العازلة الأصلي الذي يطرح قضية لا سيما في معالجة أنواع غير متجانسة الحجم الخلايا مثل الخلايا الجذعية الوسيطة (اللجان الدائمة). 19 لقد سبق وضعها تقنية جديدة خلية على microfluidics بالقصور الذاتي الفرز ووصف عميد تدفق التقطير (الأمر الواقع) لعزل تعميم الخلايا السرطانية (CTCs) 20 والبكتيريا 21 من الدم الكامل باستخدام 2-مدخل، 2-منفذ جهاز متناهية دوامة. في هذا البروتوكول الفيديو، فإننا سوف وصف عملية وضع العلامات THP-1 الخلايا (الإنسان حاد خط خلية سرطان الدم الوحيدات) تعليق حيدي (~ 15 ميكرون)، واللجان الدائمة (10-30 ميكرون) مع calcein-Loaded مصادر القدرة النووية، يليه تصنيع وتشغيل microdevice دوامة قوات الأمر الواقع لاستعادة كفاءة من الخلايا المسمى وإزالة تلك المصادر غير منضم. تمكن 22 هذه الاستراتيجية تنقية خطوة واحدة الانتعاش المستمر للتعليق وصفت والخلايا الملتصقة مع وقف التنفيذ في حل العازلة جديدة دون الطرد المركزي. وعلاوة على ذلك، فإنه يمكن معالجة ما يصل إلى 10 مليون خلية · مل -1، وكثافة الخلايا قابلة للتطبيقات الطب التجديدي.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="781">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:780px;">Cell lines &#38; Media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Mesenchymal Stem Cells (MSCs)</td>
			<td style="width:127px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">PT-2501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td style="width:127px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">12-614F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">THP-1 monocyte cells (THP-1)</td>
			<td style="width:127px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">TIB-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 media</td>
			<td style="width:127px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">12-702F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Name</td>
			<td style="width:127px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:780px;">Reagents &#38; Materials</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">0.01% poly-L-lysine (PLL)</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">3 mL Syringe</td>
			<td style="width:127px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">302113</td>
			<td>Syringe 3ml Luer-Lock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">60 ml Syringe</td>
			<td style="width:127px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">309653</td>
			<td>Syringe 60ml Luer-Lock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:127px;">Biowest</td>
			<td style="width:119px;">P6154-100GR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Calcein, AM (CAM)</td>
			<td style="width:127px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">C1430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Calcein</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C0875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:119px;">#P/7507/17</td>
			<td>HPLC Grade 2.5 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:127px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">17-516Q/12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Plain Microscope Slides</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FIS#12-550D</td>
			<td>75 X 25 X 1 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td style="width:127px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:119px;">SYLGARD&#174; 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Scotch tape</td>
			<td style="width:127px;">3M</td>
			<td style="width:119px;">21200702044</td>
			<td>18mm x 25m</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Silica NPs (&#8764;200 &#956;m)</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">748161</td>
			<td>Pore size 4 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Syringe Tip</td>
			<td style="width:127px;">JEC Technology</td>
			<td style="width:119px;">7018302</td>
			<td style="width:167px;">23GA .013 X .25</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td style="width:127px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Tygon Tubing</td>
			<td style="width:127px;">Spectra-Teknik</td>
			<td style="width:119px;">06419-01</td>
			<td>.02X.06&#34; 100</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:368px;">Name</td>
			<td style="width:127px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:780px;">Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Biopsy punch</td>
			<td style="width:127px;">Harris Uni-Core</td>
			<td>69036-15</td>
			<td>1.50 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Dessicator</td>
			<td style="width:127px;">Scienceware</td>
			<td style="width:119px;">111/4 IN OD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">High-speed Camera</td>
			<td style="width:127px;">Phantom&#160;</td>
			<td style="width:119px;">V9.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Inverted phase-contrast microscope&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Plasma cleaner</td>
			<td style="width:127px;">Harrick Plasma</td>
			<td style="width:119px;">PDC-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Syringe Pump</td>
			<td style="width:127px;">Chemyx</td>
			<td style="width:119px;">CX Fusion 200</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic buffer exchange for interference-free micro/nanoparticle cell engineering

خلايا الهندسة مع الصغير تحميل النشط العنصر / النانوية (NPS) أصبحت وسيلة شعبية متزايدة لتعزيز الخصائص العلاجية الأم، تمكين التصوير الحيوية والسيطرة على النمط الظاهري الخلية. ثمة مسألة حاسمة بعد تلقى العناية الكافية لعدد كبير من الجسيمات التي لا تزال غير منضم بعد خلية وضع العلامات التي لا يمكن إزالتها بسهولة عن طريق الطرد المركزي التقليدي. وهذا يؤدي إلى زيادة في الضوضاء الخلفية التصوير الحيوي، ويمكن نقلها آثار تحول إلى خلايا غير المستهدفة المجاورة. في هذا البروتوكول، ونحن تقديم استراتيجية بالقصور الذاتي القائم على microfluidics عازلة الصرف توصف بأنها دين تدفق التقطير (الأمر الواقع) للفصل بين كفاءة الخلايا المسمى من مصادر القدرة النووية حرة بطريقة إنتاجية عالية. وmicrodevice دوامة المتقدمة يسهل جمع المستمر (&gt; الانتعاش خلية 90٪) من الخلايا تنقيته (THP-1 واللجان الدائمة) معلقة في حل العازلة الجديد، في حين تحقيق نضوب&gt; 95٪ من صبغة الفلورسنت غير منضم أو مصادر القدرة النووية صبغ تحميل (سيلالحلف أو PLGA). هذه خطوة واحدة، تمكن استراتيجية تنقية الخلايا القائم على حجم الخلية عالية التجهيز الإنتاجية (10 6 خلية / دقيقة)، ومفيدة للغاية لتنقية الخلايا حجم كبير من جسيمات متناهية الصغر هندسيا خلايا / الدقيقة لتحقيق التطبيق السريري مجانا للتدخل.

بعد وصفها الخلايا مع الحيوي التصوير NPS-تحميل عامل بين عشية وضحاها، ويتم حصاد الخلايا المسمى (التي تحتوي على جزيئات الحرة) وتنقيته من قبل قوات الأمر الواقع دوامة microdevice لإزالة مصادر القدرة النووية الحرة في العملية خطوة واحدة (الشكل 1A). تم تصميم 2-مدخل، متناهية لولبية 2-منفذ عن طريق هندسة البرمجيات وmicrofabricated باستخدام SU-8 مقاومة للضوء. ثم يتم استخدام رقاقة السيليكون نمط كنموذج لصب متماثلة PDMS باستخدام تقنيات الطباعة الحجرية الناعمة (الشكل 1B). لإجراء فرز الخلايا، يتم ضخ عينة خلية في مدخل الجدار الخارجي للmicrodevice دوامة بينما مدخل الجدار الداخلي يعمل حل العازلة الطازجة بمعدل تدفق أعلى (01:10) لقرصة تدفق عينة الخلية. ويتحقق الانفصال من خلال التركيز بالقصور الذاتي من الخلايا المسمى أكبر في الجدار الداخلي وإعادة تدوير الناجم عن عميد لمصادر القدرة النووية غير منضم صغيرة نحو الجدار الخارجي (الشكل 2A). وكان جهاز تطبيق صحيفة الأولىإد لفرز الخلايا تعليق المسمى الوحيدات (THP-1) من مصادر القدرة النووية السيليكا الفلورسنت محملة calcein (~ 500 نانومتر في الحجم). وقد تم الحصول على الكفاءات فصل عالية وهو ما أكدته التصوير سرعة عالية (الشكل 2A) والتدفق الخلوي تحليل (الشكل 2B). وأشار الصور من eluents التي تم جمعها من منفذ خلية الجهاز أيضا إزالة فعالة من السيليكا وPLGA مصادر القدرة النووية (~ 1-5 ميكرومتر) من THP-1 الخلايا. وبالإضافة إلى ذلك، أظهر التصوير مضان أن مصادر القدرة النووية المنضوية في الخلايا THP-1 المسمى تم الإبقاء جيدا خلال تنقية قوات الأمر الواقع (إدراجات) (الشكل 3). بسبب MSC حجم التجانس، تم تعديل هندسة دوامة متناهية في وقت لاحق عن طريق تغيير ارتفاع قناة وتصميم التشعب لتمكين مجموعة فعالة من اللجان الدائمة (الشكل 4). <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/54327/54327fig1.jpg" /> الشكل 1. (أ) ربوتكأسير العمل erall لخطوة واحدة صغيرة / جسيمات متناهية الصغر (NPS) الإزالة السريعة من الايقاف والخلايا الملتصقة بعد وضع العلامات باستخدام عميد تدفق التقطير (الأمر الواقع) تكنولوجيا الموائع الدقيقة. تم تصميم (B) الجهاز دوامة قوات الأمر الواقع من قبل البرامج الهندسية ونقوش على رقاقة السيليكون باستخدام التصنيع الدقيق. ويتم إنتاج الأجهزة PDMS في وقت لاحق من قبل وسائل الطباعة الحجرية الناعمة. يتكون الإعداد التجريبية من 2 مضخات حقنة للبث الخلايا المسمى وعازلة المالحة العذبة في معدلات تدفق مختلفة في الجهاز لتنقية مستمرة ومجموعة من الخلايا المسمى. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54327/54327fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/54327/54327fig2.jpg" /> الرقم إزالة 2. النانوية من المسمى THP-1 الخلايا عن طريق قوات الأمر الواقع. (A) رسم توضيحي لمبدأ الفصل قوات الأمر الواقع. الخلايا المسمى أكبر تجربة القوات قوية بالقصور الذاتي رفع (F L، السهام الحمراء)، وسحب القوات عميد (F D، الأسهم الصفراء) وتركز قرب متناهية الجدار الداخلي. مصادر القدرة النووية الصغيرة وحل العازلة تتأثر فقط من قبل عميد سحب وإعادة توزيع على الجدار الخارجي لتحقيق الانفصال. تمثيلية عالية السرعة والصور مضان تشير مواقف توازن THP-1 الخلايا (السهام الحمراء) والسيليكا مصادر القدرة النووية محملة صبغ calcein في منطقة منفذ. الأداء (ب) الفصل على أساس تحليل التدفق الخلوي مع النابضة يحدده حجم (FSC-A) وتحبب (SSC-A) الخصائص. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54327/54327fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/54327/54327fig3.jpg" /> الشكل (3). <strong<html> &gt; التمثيلية الصور الحقل مشرقة من النقاء وصفت THP-1 الخلايا (السهام الحمراء) ومصادر القدرة النووية كفاءة الإزالة باستخدام قوات الأمر الواقع. تظهر الأشكال العقد مرحلة منها (أعلاه) والصور مضان المجهر الخلايا الفردية. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54327/54327fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a> <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/54327/54327fig4.jpg" /> الرقم إزالة 4. النانوية من الخلايا الجذعية الوسيطة (اللجان الدائمة) عن طريق قوات الأمر الواقع. (A) التمثيلية صورة بسرعة عالية يوضح الفصل كفاءة اللجان الدائمة (الأسهم الحمراء)، وPLGA مصادر القدرة النووية (الأسهم الزرقاء) إلى وسائل مختلفة. متقطع أصفر خطوط تدل على موقف التقريبي للجدران متناهية. (ب) أداء فصل اللجان الدائمة من السيليكا وPLGA مصادر القدرة النووية.خريج &quot;الهدف =&quot; _ فارغة &quot;&gt; الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Buffer Exchange for Interference-free Micro/Nanoparticle Cell Engineering at JoVE.com

Microfluidic Buffer Exchange for Interference-free Micro/Nanoparticle Cell Engineering

يصف هذا البروتوكول استخدام استراتيجية الصرف عازلة القائم على microfluidics بالقصور الذاتي لتنقية الصغير / جسيمات متناهية الصغر خلايا هندسيا مع نضوب الفعال للجزيئات غير منضم.

ميكروفلويديك تبادل العازلة لمايكرو / الجسيمات النانوية هندسة الخلايا خالية من التدخل

Engineering cells with active-ingredient-loaded micro/nanoparticles (NPs) is becoming an increasingly popular method to enhance native therapeutic ...

microfluidic-buffer-exchange-for-interference-free-micronanoparticle

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.0K Views.  Nanyang Technological University.  يصف هذا البروتوكول استخدام استراتيجية الصرف عازلة القائم على microfluidics بالقصور الذاتي لتنقية الصغير / جسيمات متناهية الصغر خلايا هندسيا مع نضوب الفعال للجزيئات غير منضم. 

Video: Microfluidic Buffer Exchange for Interference-free Micro/Nanoparticle Cell Engineering

Site-specific Bacterial Chromosome Engineering: &#934;C31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)

The bacterial chromosome may be used to stably maintain foreign DNA in the mega-base range1. Integration into the chromosome circumvents issues such as plasmid replication, plasmid stability, plasmid incompatibility, and plasmid copy number variance. This method uses the site-specific integrase from the Streptomyces phage (&Phi;) C312,3. The &Phi;C31 integrase catalyzes a direct recombination between two specific DNA sites: attB and attP (34 and 39 bp, respectively)4. This recombination is stable and does not revert5. A "landing pad" (LP) sequence consisting of a spectinomycin- resistance gene, aadA (SpR), and the E. coli &szlig;-glucuronidase gene (uidA) flanked by attP sites has been integrated into the chromosomes of Sinorhizobium meliloti, Ochrobactrum anthropi, and Agrobacterium tumefaciens in an intergenic region, the ampC locus, and the tetA locus, respectively. S. meliloti is used in this protocol. Mobilizable donor vectors containing attB sites flanking a stuffer red fluorescent protein (rfp) gene and an antibiotic resistance gene have also been constructed. In this example the gentamicin resistant plasmid pJH110 is used. The rfp gene6 may be replaced with a desired construct using SphI and PstI. Alternatively a synthetic construct flanked by attB sites may be sub-cloned into a mobilizable vector such as pK19mob7. The expression of the &Phi;C31 integrase gene (cloned from pHS628) is driven by the lac promoter, on a mobilizable broad host range plasmid pRK78139.
A tetraparental mating protocol is used to transfer the donor cassette into the LP strain thereby replacing the markers in the LP sequence with the donor cassette. These cells are trans-integrants. Trans-integrants are formed with a typical efficiency of 0.5%. Trans-integrants are typically found within the first 500-1,000 colonies screened by antibiotic sensitivity or blue-white screening using 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-glucuronic acid (X-gluc). This protocol contains the mating and selection procedures for creating and isolating trans-integrants.

A quick and efficient method to integrate foreign DNA of interest into pre-made acceptor strains, termed landing pad strains, is described. The method allows site-specific integration of a DNA cassette into the engineered landing pad locus of a given strain, through conjugation and expression of the &#934;C31 integrase.

موقع محدد الهندسة الكروموسوم البكتيري: ΦC31 كاسيت الموفقة تبادل Integrase (IMCE)

The bacterial chromosome may be used to stably maintain foreign DNA in the mega-base range1. Integration into the chromosome circumvents issues such as ...

Microfluidic Mixers for Studying Protein Folding

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason for this is that folding takes place over a wide range of timescales, from nanoseconds to seconds or longer, depending on the protein1. Conventional stopped-flow mixers have allowed measurement of folding kinetics starting at about 1 ms. We have recently developed a microfluidic mixer that dilutes denaturant ~100-fold in ~8 &mu;s2. Unlike a stopped-flow mixer, this mixer operates in the laminar flow regime in which turbulence does not occur. The absence of turbulence allows precise numeric simulation of all flows within the mixer with excellent agreement to experiment3-4.
Laminar flow is achieved for Reynolds numbers Re &le;100. For aqueous solutions, this requires micron scale geometries. We use a hard substrate, such as silicon or fused silica, to make channels 5-10 &mu;m wide and 10 &mu;m deep (See Figure 1). The smallest dimensions, at the entrance to the mixing region, are on the order of 1 &mu;m in size. The chip is sealed with a thin glass or fused silica coverslip for optical access. Typical total linear flow rates are ~1 m/s, yielding Re~10, but the protein consumption is only ~0.5 nL/s or 1.8 &mu;L/hr. Protein concentration depends on the detection method: For tryptophan fluorescence the typical concentration is 100 &mu;M (for 1 Trp/protein) and for FRET the typical concentration is ~100 nM.
The folding process is initiated by rapid dilution of denaturant from 6 M to 0.06 M guanidine hydrochloride. The protein in high denaturant flows down a central channel and is met on either side at the mixing region by buffer without denaturant moving ~100 times faster (see Figure 2). This geometry causes rapid constriction of the protein flow into a narrow jet ~100 nm wide. Diffusion of the light denaturant molecules is very rapid, while diffusion of the heavy protein molecules is much slower, diffusing less than 1 &mu;m in 1 ms. The difference in diffusion constant of the denaturant and the protein results in rapid dilution of the denaturant from the protein stream, reducing the effective concentration of the denaturant around the protein. The protein jet flows at a constant rate down the observation channel and fluorescence of the protein during folding can be observed using a scanning confocal microscope5.

In this work we explain the fabrication and use of a microfluidic mixer capable of mixing two solutions in ~8 &mu;s. We also demonstrate the use of these mixers with spectroscopic detection using UV fluorescence and fluorescence resonance energy transfer (FRET).

ميكروفلويديك الخلاطات لدراسة طي البروتين

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason ...

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of interest following intravenous or intraarterial infusion. Consequently, increasing cell homing is currently studied as a strategy to improve cell therapy. Cell rolling on the vascular endothelium is an important step in the process of cell homing and can be probed in-vitro using a parallel plate flow chamber (PPFC). However, this is an extremely tedious, low throughput assay, with poorly controlled flow conditions. Instead, we used a multi-well plate microfluidic system that enables study of cellular rolling properties in a higher throughput under precisely controlled, physiologically relevant shear flow1,2. In this paper, we show how the rolling properties of HL-60 (human promyelocytic leukemia) cells on P- and E-selectin-coated surfaces as well as on cell monolayer-coated surfaces can be readily examined. To better simulate inflammatory conditions, the microfluidic channel surface was coated with endothelial cells (ECs), which were then activated with tumor necrosis factor-&#945; (TNF-&#945;), significantly increasing interactions with HL-60 cells under dynamic conditions. The enhanced throughput and integrated multi-parameter software analysis platform, that permits rapid analysis of parameters such as rolling velocities and rolling path, are important advantages for assessing cell rolling properties in-vitro. Allowing rapid and accurate analysis of engineering approaches designed to impact cell rolling and homing, this platform may help advance exogenous cell-based therapy.

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

This study used a multi-well plate microfluidic system, significantly increasing throughput of cell rolling studies under physiologically relevant shear flow. Given the importance of cell rolling in the multi-step cell homing cascade and the importance of cell homing following systemic delivery of exogenous populations of cells in patients, this system offers potential as a screening platform to improve cell-based therapy.

التحليل المنهجي لل<em&gt; في المختبر</em&gt; الخليوي المتداول باستخدام نظام ميكروفلويديك لوحة متعددة جيدا

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This technology has shown potential in addressing previously challenging applications; including, delivery to primary immune cells, cell reprogramming, carbon nanotube, and quantum dot delivery. This vector-free microfluidic platform relies on mechanical disruption of the cell membrane to facilitate cytosolic delivery of the target material. Herein, we describe the detailed method of use for these microfluidic devices including, device assembly, cell preparation, and system operation. This delivery approach requires a brief optimization of device type and operating conditions for previously unreported applications. The provided instructions are generalizable to most cell types and delivery materials as this system does not require specialized buffers or chemical modification/conjugation steps. This work also provides recommendations on how to improve device performance and trouble-shoot potential issues related to clogging, low delivery efficiencies, and cell viability.

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This protocol provides detailed steps on how to use the system for a broad range of applications.

الضغط خلية باعتبارها قوية، ميكروفلويديك بين الخلايا توصيل منصة

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an efficient manner. Typically, data for ~102 cells can be acquired within a 1 hr experiment. An automated image analysis program enables efficient post-experiment analysis of image data, enabling processing to be complete within a few hours. Our device geometry is unique in that cells must deform through a series of micron-scale constrictions, thereby enabling the initial deformation and time-dependent relaxation of individual cells to be assayed. The applicability of this method to human promyelocytic leukemia (HL-60) cells is demonstrated. Driving cells to deform through micron-scale constrictions using pressure-driven flow, we observe that human promyelocytic (HL-60) cells momentarily occlude the first constriction for a median time of 9.3 msec before passaging more quickly through the subsequent constrictions with a median transit time of 4.0 msec per constriction. By contrast, all-trans retinoic acid-treated (neutrophil-type) HL-60 cells occlude the first constriction for only 4.3 msec before passaging through the subsequent constrictions with a median transit time of 3.3 msec. This method can provide insight into the viscoelastic nature of cells, and ultimately reveal the molecular origins of this behavior.

We demonstrate a microfluidics-based assay to measure the timescale for cells to transit through a sequence of micron-scale constrictions.

تقنية ميكروفلويديك للتحقيق التشوه خلية

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation

Blood, as a non-Newtonian biofluid, represents the focus of numerous studies in the hemorheology field. Blood constituents include red blood cells, white blood cells and platelets that are suspended in blood plasma. Due to the abundance of the RBCs (40% to 45% of the blood volume), their behavior dictates the rheological behavior of blood especially in the microcirculation. At very low shear rates, RBCs are seen to assemble and form entities called aggregates, which causes the non-Newtonian behavior of blood. It is important to understand the conditions of the aggregates formation to comprehend the blood rheology in microcirculation. The protocol described here details the experimental procedure to determine quantitatively the RBC aggregates in microcirculation under constant shear rate, based on image processing. For this purpose, RBC-suspensions are tested and analyzed in 120 x 60 &#181;m poly-dimethyl-siloxane (PDMS) microchannels. The RBC-suspensions are entrained using a second fluid in order to obtain a linear velocity profile within the blood layer and thus achieve a wide range of constant shear rates. The shear rate is determined using a micro Particle Image Velocimetry (&#181;PIV) system, while RBC aggregates are visualized using a high speed camera. The videos captured of the RBC aggregates are analyzed using image processing techniques in order to determine the aggregate sizes based on the images intensities.

The protocol described details an experimental procedure to quantify Red Blood Cell (RBC) aggregates under a controlled and constant shear rate, based on image processing techniques. The goal of this protocol is to relate RBC aggregate sizes to the corresponding shear rate in a controlled microfluidic environment.

تسيطر البيئة الميكروية للتحقيق ديناميكية الدم الحمراء تجميع خلية

Blood, as a non-Newtonian biofluid, represents the focus of numerous studies in the hemorheology field. Blood constituents include red blood cells, white ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol adhesive through a metal stencil, the overall amount of adhesive used in assembling paper microfluidic devices can be significantly reduced. We show on a simple 4-layer planar paper microfluidic device that the optimal adhesive application technique and device construction style depends heavily on desired performance characteristics. By moderately increasing the overall area of a device, it is possible to dramatically decrease the wicking time and increase device success rates while also reducing the amount of adhesive required to keep the device together. Such adhesive application also causes the adhesive to form semi-permanent bonds instead of permanent bonds between paper layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use. Nonplanar 3D origami devices also benefit from the semi-permanent bonds during folding, as it reduces the likelihood that unrelated faces may accidently stick together. Like planar devices, nonplanar structures see reduced wicking times with patterned adhesive application vs uniformly applied adhesive.

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct 3D paper microfluidic devices. This method of adhesive application forms semi-permanent bonds between layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use and to ease folding complex nonplanar structures.

باستخدام لاصق الزخرفة لانشاء 3D ورقة أجهزة ميكروفلويديك

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

ومنصة ميكروفلويديك لعزل وحيدة الخلية عالية الإنتاجية والثقافة

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to entry for non-specialists who would benefit greatly from the ability to develop their own microfluidic devices to address research questions. Particularly lacking has been the open dissemination of protocols related to photolithography, a key step in the development of a replica mold for the manufacture of polydimethylsiloxane (PDMS) devices. While the fabrication of single height silicon masters has been explored extensively in literature, fabrication steps for more complicated photolithography features necessary for many interesting device functionalities (such as feature rounding to make valve structures, multi-height single-mold patterning, or high aspect ratio definition) are often not explicitly outlined. 
Here, we provide a complete protocol for making multilayer microfluidic devices with valves and complex multi-height geometries, tunable for any application. These fabrication procedures are presented in the context of a microfluidic hydrogel bead synthesizer and demonstrate the production of droplets containing polyethylene glycol (PEG diacrylate) and a photoinitiator that can be polymerized into solid beads. This protocol and accompanying discussion provide a foundation of design principles and fabrication methods that enables development of a wide variety of microfluidic devices. The details included here should allow non-specialists to design and fabricate novel devices, thereby bringing a host of recently developed technologies to their most exciting applications in biological laboratories.

Multilayer microfluidic devices often involve the fabrication of master molds with complex geometries for functionality. This article presents a complete protocol for multi-step photolithography with valves and variable height features tunable to any application. As a demonstration, we fabricate a microfluidic droplet generator capable of producing hydrogel beads.

متعدد خطوة الطباعة التصويرية متغير الطول لمحكم بصمام متعدد الأجهزة ميكروفلويديك

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic bioprinting to generate a scaffold with multilayer interlacing hydrogel microfibers. To achieve smooth bioprinting, a core-sheath microfluidic printhead containing a composite bioink formulation extruded from the core flow and the crosslinking solution carried by the sheath flow, was designed and fitted onto the bioprinter. By blending gelatin methacryloyl (GelMA) with alginate, a polysaccharide that undergoes instantaneous ionic crosslinking in the presence of select divalent ions, followed by a secondary photocrosslinking of the GelMA component to achieve permanent stabilization, a microfibrous scaffold could be obtained using this bioprinting strategy. Importantly, the endothelial cells encapsulated inside the bioprinted microfibers can form the lumen-like structures resembling the vasculature over the course of culture for 16 days. The endothelialized microfibrous scaffold may be further used as a vascular bed to construct a vascularized tissue through subsequent seeding of the secondary cell type into the interstitial space of the microfibers. Microfluidic bioprinting provides a generalized strategy in convenient engineering of vascularized tissues at high fidelity.

We provide a generalized protocol based on a microfluidic bioprinting strategy for engineering a microfibrous vascular bed, where a secondary cell type could be further seeded into the interstitial space of this microfibrous structure to generate vascularized tissues and organoids.